全 文 ：第 35 卷第 10 期
2015年 5月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vol.35,No.10
May,2015
http: / / www.ecologica.cn
基金项目:国家自然科学基金资助项目(31070003); 广州市科技计划项目(2013J4100050)
收稿日期:2013鄄12鄄11; 摇 摇 网络出版日期:2014鄄08鄄13
*通讯作者 Corresponding author.E鄄mail: shuli_1990@ 126.com
DOI: 10.5846 / stxb201312112929
李淑彬, 黄娟, 周仁超, 李泽恩, 徐诗如, 阮婷, 庞启华.南药植物高良姜内生细菌多样性及其促生潜力.生态学报,2015,35(10):3204鄄3213.
Li S B, Huang J, Zhou R C, Li Z E, Xu S R, Ruan T, Pang Q H.Diversity and plant growth鄄promoting potential of bacterial endophytes of Alpinia
Officinarum Hance, a famous south鄄China medicinal plant.Acta Ecologica Sinica,2015,35(10):3204鄄3213.
南药植物高良姜内生细菌多样性及其促生潜力
李淑彬*, 黄摇 娟, 周仁超, 李泽恩, 徐诗如, 阮摇 婷, 庞启华
华南师范大学生命科学学院, 广州摇 510631
摘要:以道地产地高良姜为材料,对该药用植物内生细菌种群组成、组织分布及其促生潜力进行了研究。 采用组织块分离法,从
高良姜根、根茎、茎和叶 4个组织共计分离得到细菌 136株,分属于 16个 16S rDNA基因型、12个细菌属、15个细菌种,其中,芽
孢杆菌、甲基杆菌分别为其最、次优势种群。 各种群分离比随组织不同而异;采用 HhaI 消化的末端限制性片段多态性(T鄄
RFLP) 免培养方法,从高良姜 4个组织共计检测到 36个不同的末端限制性酶切片段(T鄄RFs)。 种群对应分析表明其免培养内
生细菌群体主要包括芽孢杆菌、甲基杆菌等高抗性细菌,海洋螺菌、红杆菌、交替假单胞菌等海洋细菌及热带根瘤菌、沼泽考克
氏菌等热带相关细菌,说明高良姜内生细菌群体与其宿主植物生长环境密切相关。 不同组织其总 T鄄RFs数目、优势 T鄄RFs及其
对应细菌种群明显不同;在所分离的细菌菌株中,36.36%、51.52%、54.55%和 27.27%的菌株分别显示了胞外几丁质酶、茁鄄葡聚
糖酶,生长素及其 1鄄氨基环丙烷鄄 1鄄羧酸(ACC)脱氨酶产生能力。 其中,泛菌 L鄄 2、芽孢杆菌 S鄄 16所测 4个指标均为阳性,热带
根瘤菌菌株 R鄄1和 R鄄3显示了较高的 ACC脱氨酶及生长素产生能力,这些菌株是促生菌剂的良好候选。
关键词:道地高良姜; 内生细菌; 分离培养; T鄄RFLP; 植物促生作用
Diversity and plant growth鄄promoting potential of bacterial endophytes of Alpinia
Officinarum Hance, a famous south鄄China medicinal plant
LI Shubin*, HUANG Juan, ZHOU Renchao, LI Ze忆en, XU Shiru, RUAN Ting, PANG Qihua
College of Life Science, South China Normal University, Guangzhou 510631, China
Abstract: Alpinia officinarum Hance, which is a species of the family Zingiberaceae, is a perennial medicinal plant that is
mainly distributed in the tropical and subtropical regions of Southeast Asia. Although the endophytic communities of various
crop plants and several medicinal plants have been investigated, no publications have reported research related to the
endophytes of A. officinarum Hance. In the present study, a culture鄄dependent method combined with a terminal鄄restriction
fragment length polymorphism (T鄄RFLP) technique鄄based culture鄄independent method were applied to assess the diversity
of the culturable bacterial endophyte communities and total bacterial endophyte communities of A. officinarum Hance. Using
the culture鄄dependent isolation method, 136 bacterial isolates were obtained from the internal tissues of root, rhizome,
stem, and leaf of healthy, 4鄄year鄄old A. officinarum Hance plants collected from Longtang Town in Xuwen County,
Guangdong Province, China. We selected the A. officinarum Hance plants growing in this area because the quality and
pharmacological effects of these medicinal plants growing in this area are traditionally considered to be significantly higher
than those of any other areas of China. Based on 16S rDNA sequence analysis, the bacterial isolates represented 16 distinct
16S rDNA gene types, 12 distinct bacterial genera, and 15 distinct bacterial species. The most dominant bacterial
population was the genus Bacillus, followed by Methylobacterium. The culturable bacterial communities that were obtained
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from the different tissues of the medicinal plant were significantly different, and several bacterial populations displayed some
level of tissue preference in the host plant. Using the T鄄RFLP鄄based culture鄄independent method, 36 distinct Terminal鄄
Restriction Fragments (T鄄RFs) were detected from the amplified, HhaI mono鄄digestion鄄targeted 16S rDNA gene sequences
from internal tissues of the root, rhizome, stem, and leaf of A. officinarum Hance plants collected from the same sites. The
corresponding taxons of the dominant T鄄RFs were linked to highly resistant Bacillus and Methylobacterium, as well as several
marine bacterial orders, such as Oceanospirillales, Pseudomonadales, Vibrionales, and Rhodobacterales, which indicated
that the population composition of the total bacterial endophyte community in A. officinarum Hance was significantly
correlated with the environment of the host. The numbers of total T鄄RFs, the dominant T鄄RFs, and their corresponding
taxons were significantly different between tissues of A. officinarum Hance. These observations indicated that the tissue types
of A. Officinarum Hance could contribute to the variation in the bacterial endophyte communities of the plant. Furthermore,
the isolated bacterial endophytes were screened for a panel of beneficial effects that included the production of extracellular
chitinase and 茁鄄glucanase, indoleacetic acid (IAA), as well as 1鄄aminocyclopropane鄄1鄄carboxylic acid (ACC) deaminase.
Many of the strains displayed positive results in these assays (chitinases: 36.36%, 茁鄄glucanase: 51.52%, IAA: 54.55%,
ACC deaminase: 27.27%). In particular, the isolates L鄄2, which was assigned to the Pantone sp., and S鄄16, which was
assigned to the Bacillus sp., were capable of co鄄producing chitinases, 茁鄄glucanase, IAA, and ACC deaminase, and are
potential candidates for use as biocontrol agents and in biofertilizers. In addition, two isolates ( R鄄 1, R鄄 3) that were
assigned to Rhizobium tropici could produce IAA and ACC deaminase; therefore, they are good candidates for use as plant
growth鄄promoting bacteria.
Key Words: Alpinia officinarum Hance; bacterial endophytes; culture鄄dependent method; T鄄RFLP technique; plant
growth鄄promoting potential
植物内生细菌(Endophytic bacteria)存在于植物内部,其种群组成与其宿主植物种及其基因型、组织类型、
发育阶段、及植株生长环境密切相关[1鄄6]。 大量研究显示内生细菌可通过固氮作用、分泌生长素、产生 1鄄氨基
环丙烷鄄 1鄄羧酸脱氨酶、铁载体、抗生素等多种方式促进植物生长、提高其对生物及非生物境胁迫的抗性[1鄄8]。
研究植物内生细菌多样性及功能活性,对阐明植物鄄内生细菌相互作用、有效利用内生细菌资源具有重要
意义。
高良姜(Alpinia officinarum Hance),别名小良姜,又名徐闻良姜,是著名南药植物之一[9]。 高良姜提取物
具有抗菌、抗氧化、抗病毒、抗癌、保护心脑血管等活性[9鄄13],已广泛用于食品和药品添加剂的制备。 高良姜在
热带、亚热带均有分布,其中,以广东省湛江市徐闻县龙塘镇所产高良姜质量最优,为道地高良姜[9]。 高良姜
含有多种活性组分,其道地产地位于我国最南端高温高湿、强辐射、低 pH 值的海岸环境,在这样的环境其内
生菌多样性特征可能不同于内陆植物。 然而,有关高良姜内生菌的研究国内外尚未报道。 本论文以道地产地
高良姜为材料,采用分离培养方法、及基于末端限制性片段长度多态性分析(terminal鄄restriction fragment length
polymorphism, T鄄RFLP)的免培养方法对其内生细菌多样性、组织分布及其抗逆促生潜力进行了研究,以期了
解该药用植物内生细菌种群结构和生态分布特点,为分析内生菌群体在其道地性形成中的作用、及内生细菌
资源的开发利用提供参考。
1摇 材料与方法
1.1摇 植物材料
实验所用高良姜均采自道地高良姜产地广东省徐闻县龙塘镇。 整株挖取健壮、无病虫害、约 4年生植株,
用灭菌物品袋包裹带回实验室后立即进行内生菌分离及组织 DNA提取。
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1.2摇 主要试剂和培养基
1鄄氨基环丙烷鄄 1鄄羧酸(1鄄aminocyclopropane鄄 1鄄carboxylic acid, ACC)、茁鄄葡聚糖、几丁质购自 Sigma 公司;
限制性内切酶 HhaI、MspI, Premix Taq、pMD18鄄T购于 Takara公司;Dzup(植物)基因组 DNA提取试剂盒、细菌
基因组 DNA提取试剂盒、DNA纯化试剂盒购于上海生工生物科技有限公司;营养琼脂(nutrient agar, NA)、
Luria鄄Bertani 培养基(LB)、胰蛋白胨培养基购自广东环凯微生物科技有限公司;胶态几丁质培养基参照文
献[14]、刚果红鄄葡聚糖培养基参照文献[15]、无氮培养基和补充培养基(supplemental medium, SM)参照文献[16]
配制。 SMA 培养基: 向 SM 培养基中添加过滤除菌的 ACC,使其终浓度为 3 mmol / L[7]。
1.3摇 内生细菌的分离纯化
用流水冲洗高良姜根、根茎、茎和叶样品,吸干水分。 根茎、根用无菌小刀刮去表皮,切成长、宽、厚各约 2
mm小块。 剥去表层的茎、及叶切成长、宽各约 2 mm 小段。 按照以下步骤对上述样品进行表面消毒:75%酒
精浸泡 30 s—无菌水冲洗 3次—0.1%升汞浸泡 4 min—无菌水冲洗 5 次。 取表面消毒的组织小块(60 块 /组
织)贴于预先制备的 NA平板上,30 益培养 48 h,对出现的所有菌落进行划线纯化,经镜检后, 纯菌落转接于
NA斜面保存。 最后 1次消毒无菌水涂布于同样的平板以检测消毒效果。
1.4摇 菌株 16S rDNA扩增及限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)分析
菌株接入 LB培养液中 30 益、150 r / min 振荡培养 24 h,离心 (4000 r / min) 收集菌体,用 TE 洗涤 3 次,
用细菌基因组提取试剂盒提取基因组 DNA, 方法参见试剂盒说明书。 以提取的各 DNA 为模板,用细菌通用
引物 27F / 1492R扩增菌株 16S rDNA 序列。 每 25 滋L PCR 反应混合物含 Premix Taq 12.5 滋L,正、反引物各 1
滋L、模板 DNA 2 滋L,ddH2O 8.5 滋L。 PCR程序为:95 益预变性 5 min;95 益变性 30 s,52 益退火 45 s,72 益延
伸 90 s,30个循环;72 益终延伸 7 min。 切胶回收目标产物(—1500 bp),用 DNA纯化试剂盒纯化。 纯化产物
分别用 HhaI、MspI 于 37 益消化 3 h (酶切体系含 PCR 产物 2 滋L, 酶 1 滋L, 10 伊 M buffer 2 滋L, ddH2O 15
滋L),75 益下水浴 10 min终止消化。 2%琼脂糖凝胶电泳检测消化产物,根据其电泳条带数目及相对大小进
行 RFLP 图谱分型。 对两种酶 RFLP 图谱进行组合,在两种图谱中 DNA条带数目及其相对大小均相同的菌株
定义为同一 16S rDNA基因型 (rDNA type)。
1.5摇 菌株系统发育分析
选取各基因型中代表菌株 16S rDNA 扩增产物转化到 E. coli DH5鄄琢感受态细胞,挑选阳性克隆委托深圳
华大基因有限公司测序。 所有有效序列用核糖体数据库的分类程序进行属级或以上种群归类;在 NCBI 进行
Blast 同源性搜索,获得相近序列,Clustal X 多重比对后,运用 MEGA 5.05 软件构建 Neighbor鄄joining 系统树,
boostrap 1000次检测各分支的置信值。
1.6摇 免培养内生细菌群体的 T鄄RFLP 分析
取各组织表面消毒后的组织小块(10 块 /组织),用 Dzup(植物)基因组 DNA 提取试剂盒提取各组织总
DNA,方法参见试剂盒说明书。 以组织总 DNA 为模板,采用正向引物 5忆端用 6鄄羧基二乙酸荧光素(FAM)标
记的 27F / 1492R引物对扩增组织 16S rDNA序列,PCR反应体系和程序同 1.4。 回收预期产物 (—1500 bp),
试剂盒纯化后用 HhaI消化。 酶切条件及体系同 1.4。 消化终止后,将管壁用锡箔纸包裹,送深圳华大基因有
限公司进行 T鄄RFLP 分析。 T鄄RFLP 图谱中末端限制性片段(Terminal鄄Restriction Fragment, T鄄RF)范围在 50—
550 bp、荧光强度高于 100 U、在平行实验图谱中重复再现的峰纳入统计分析。 合并片段大小依1 bp的 T鄄RFs。
计算每一 T鄄RF 在其对应样品中的相对丰度[17],相对丰度 > 5%的 T鄄RFs 定义为该样品的优势 T鄄RFs。 按照
同样方法检测分离菌株对应的 T鄄RFs。 通过网站(http: / / trflp. limnology.wisc.edu / index. jsp) 检索未对应的 T鄄
RFs可能代表的细菌类群。 每一组织 3个平行分析。
1.7摇 内生细菌抗逆促生潜力的测定
几丁质酶测定参照文献[14]方法。 1 个几丁质酶活力单位定义为: 在测定的反应条件下, 每 min 生成 1
滋mol N鄄乙酰葡萄糖所需要的酶量;茁鄄葡聚糖酶测定参照文献[15]方法。 1 个 茁鄄葡聚糖酶活力单位定义为: 在
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测定的反应条件下, 每 min生成 1 滋mol葡萄糖所需要的酶量;生长素产生潜力的测参照文献[5]方法通过与
Salkowski 显色液的显色反应测定;ACC 脱氨酶测定参照文献[16]方法。 1 个 ACC 脱氨酶酶活单位定义为:在
测定的反应条件下, 每 h生成 1 滋mol 琢鄄丁酮酸所需的酶量;上述每一样品每一测定 3个重复。
1.8摇 免培养细菌群体多样性指数与差异分析
以 T鄄RFLP 图谱中各 T鄄RFs相对丰度计算免培养内生细菌群体 Shannon鄄Wiener多样性指数(H):
H= -移(P i ln P i)
式中,P i为第 i个 T鄄RF在该组织丰度;使用 SPSS 17.0 软件中的邓肯氏新复极差法(Duncan忆s Multiple Ranger
Test) 进行差异显著性分析(P < 0.05,n= 3)。
2摇 结果
图 1摇 可培养内生细菌 16S rDNA RFLP 分型检测
Fig.1摇 RFLP patterns of 16S rDNA genes of bacterial isolates
上:MspI;下:HhaI;数字代表基因型
2.1摇 可培养内生细菌 RFLP 分型与种群分析
本研究从高良姜根、根茎、茎和叶 4 个组织共计
240个组织块中分离获得 136 株能稳定传代的细菌菌
株,其编号见表 1。 其中, 根 38 株, 根茎 24 株、茎 32
株, 叶 42株。 扩增所有菌株 16S rDNA 基因序列,PCR
产物 (— 1500 bp) 经 HhaI、MspI 分别消化得到的酶切
图谱 (图 1) 组合后共获得 16 种不同基因型(表 1)。
其中,根所分离菌株分布于基因型 1—7、10—12 及
15—16中,根茎所分离菌株分布于基因型 1—7 中,茎
所分离菌株分布于基因型 1—7、及基因型 10、12、13、
14、和 16 中,叶分离菌株其基因型最多,共计 14 种,除
基因型 15、16 外其他各基因型均有分布。 这些结果说
明高良姜可培养内生细菌种群组成在不同组织中存在
明显差异。
从各基因型中随机选取 1—3个代表菌株进行 16S
rDNA 全序列测定,获得的正反向序列经拼接比对后大小为 1345—1497 bp。 序列提交至 Genbank 获得的检索
号显示在图 2。 基于核糖体数据库归类,这些序列归于芽孢杆菌属(Bacillus)、考克氏菌属(Kocuria)、类芽孢
杆菌属(Paenibacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、根瘤菌属(Rhizobium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、甲基
杆菌属(Methylobacterium)、伯霍尔德菌属(Burkholderia)、沙雷菌属(Serratia)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、泛
菌属(Pantoea)、及鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)等 12个不同的细菌属(表 1)。
表 1摇 高良姜可培养内生细菌 16S rDNA 基因型及其系统发育地位
Table 1摇 16S rDNA types of endophytic bacteria isolated from A. officinarum Hance and their phylogenetic position
菌株 Strains 基因型rDNA type
核糖体数据库归类
(置信度 / %)
RDP classifer
(Confidence)
最近缘种
Closest species
相似性 / %
Identity
R鄄5* R鄄14* R鄄41 RZ鄄8, RZ鄄14 RZ鄄24 RZ鄄26 S鄄17 S鄄27 L鄄4*
L鄄36
1 Bacillus (100) B. firmus 99
R鄄9 R鄄32 R鄄36 RZ鄄1*RZ鄄2 RZ鄄3 RZ鄄9* RZ鄄4 RZ鄄10 RZ鄄19 RZ鄄
25 RZ鄄32 S鄄1*L鄄16 L鄄27 L鄄33
2 Bacillus (100) B. megaterium 99
R鄄16 R鄄34 RZ鄄11 RZ鄄26 RZ鄄28 S鄄11*S鄄16* L鄄31 L鄄32 3 Bacillus (99, 100) B. subtilis 99
R鄄10 RZ鄄7* RZ鄄12 S鄄33 L鄄40 4 Bacillus (100) B. subtilis 99
R鄄8 R鄄13* R鄄38 RZ鄄17* RZ鄄20 S鄄21 S鄄22 S鄄23 L鄄29 5 Brevibacillus (100) B. brevis 99—100
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续表
菌株 Strains 基因型rDNA type
核糖体数据库归类
(置信度 / %)
RDP classifer
(Confidence)
最近缘种
Closest species
相似性 / %
Identity
R鄄 15* R鄄25 R鄄27 R鄄33, RZ鄄5 RZ鄄6* RZ鄄31 S鄄20 S鄄24 S鄄25 S鄄
29* L鄄5 L鄄14
6 Paenibacillus (95, 100) P. xylanilyticus 99
R鄄26 RZ鄄22* S鄄32 S鄄8 L鄄15 L鄄30* L鄄35 7 Kocuria (100) K. palustris 99
L鄄10* L鄄13 L鄄18 L鄄19 L鄄43* 8 Citrobacter (96) C. murliniae 99
L鄄2* L鄄3 L鄄6 L鄄24 L鄄8 9 Pantoea (100) P. stewartii 99
R鄄14 R鄄17* R鄄21 R鄄31 R鄄39 S鄄5* L鄄1 L鄄9 10 Serratia (100) S. marcescens 99
R鄄6 R鄄18 R鄄24* R鄄38 L鄄20* L鄄33 11 Pseudomonas (100) P. putida 99
R鄄29* R鄄20 R鄄30 S鄄3* S鄄37 L鄄8 L鄄12 12 Burkholderia (100) B. gladioli 100
S鄄 2 S鄄4 S鄄10 S鄄12 S鄄14 S鄄15 S鄄19 S鄄26* S鄄30 S鄄31 L鄄11 L鄄17 L鄄
21* L鄄22 L鄄23 L鄄25 L鄄26 L鄄27 L鄄37*
13 Methylobacterium (100) M. organophilum 99
S鄄9 S鄄18* L鄄38 L鄄41 14 Methylobacterium (100) M. organophilum 99
R鄄1* R鄄2 R鄄3* R鄄4 R鄄7 15 Rhizobium (100) R. tropici 99
R鄄22* R鄄11 R鄄23 R鄄28 R鄄42 S鄄6 S鄄28 S鄄7* 16 Sphingomonas (100) S. sanguinis 99
摇 摇 *表示测序的代表菌株; RDP: Ribosomal database project
用 Neighbor鄄joining 法构建系统进化树,对这些序列进行进一步的属、种归类。 结果显示芽孢杆菌属中的
菌株分别与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和坚硬芽孢杆菌(Bacillus
firmus)构成同一分支;其他各属菌株与沼泽考克氏菌(Kocuria palustris)、热带根瘤菌(Rhizobium tropici)、嗜有
机甲基杆菌(Methylobacterium organophilum)等 12个不同种的细菌显示了最近的进化距离(图 2)。 属级或以
上水平,核糖体聚类及进化树分析结果完全一致。
2.2摇 可培养内生细菌群体的组织差异
根据各基因型菌株分离比及对应的细菌种群,计算高良姜不同组织可培养内生细菌种群组成(属水平),
结果如图 3。 从图 3可知,从其根茎得到的菌株仅分布在芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属和考克氏
菌属等 4个属,以芽孢杆菌属最为优势(分离比达 75%);根中分离的菌株分属于 9 个不同的细菌属,芽孢杆
菌同样为其最优势种群(分离比 23.68%),鞘氨醇单胞菌、及沙雷氏菌并列为该组织次优势种群;茎、叶中分
离的菌株均以甲基杆菌最高,芽孢杆菌次之。 尽管茎、叶两个组织最优势、及次优势种群相同,其他种群存在
大的差异。 此外,几个种群显示了一定程度的组织喜好性,如根瘤菌仅从单一组织根中分离,泛菌仅从叶中分
离,假单胞菌仅从根和叶中分离,而甲基杆菌仅从两个地上组织茎和叶中分离。
2.3摇 免培养内生细菌群体 T鄄RFLP 分析
采用 HhaI 单酶消化的 T鄄RFLP 方法分析高良姜免培养内生细菌群体,得到的 T鄄RFLP 图谱显示在图 4。
从其根、根茎、茎和叶四个不同组织总共检测到 36 个相对丰度大于 1%的末端限制性酶切片段(T鄄RFs)。 按
照 1个 T鄄RFs至少代表 1种细菌,高良姜免培养内生细菌群体至少组成 36个不同的细菌种,说明高良姜免培
养内生细菌具有丰富的多样性。
对所有分离菌株的 16S rDNA序列进行了 T鄄RFLP 分析,总共检测到 17 个 HhaI 消化的 T鄄RFs,为直接组
织检测到 T鄄RFs 总数的 47.22%,说明高良姜内生细菌群体中有相当多的种群难以用普通的培养方法培养。
通过相关数据库检索分析, 19 个未从分离菌株检测到的 T鄄RFs 中, 14 个分别对应于海洋螺菌目
(Oceanospirillales)、交替假单胞菌目(Pseudomonadales)、弧菌目(Vibrionales)、红杆菌目(Rhodobacterales)及
肠杆菌目(Enterobacteriales)。 而另外 5个 T鄄RFs没有在相应的数据库中检索到,为未分类的 T鄄RFs。
分析不同组织 T鄄RFLP 图谱,可知其总 T鄄RFs数目、优势 T鄄RFs 及其对应种群随组织而异(图 4, 表 2)。
基于各组织所检测的 T鄄RFs及其相对丰度,计算不同组织免培养内生细菌群体 Shannon鄄Wiener 多样性指数,
结果如表 2,不同组织该多样性指数存在显著差异(P < 0.05),以根茎最低,叶最高,根和茎次之。
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图 2摇 高良姜内生细菌代表性菌株 16s rDNA系统进化树
Fig.2摇 Phylogenetic tree of 16s rDNA genes of representative bacterial isolates from A. Officinarum Hance
表 2摇 高良姜不同组织免培养内生细菌群体 Shannon鄄Wiener多样性指数和优势 T鄄RFs及其对应种群
Table 2 摇 Shannon鄄Wiener diversity index, as well as dominat T鄄RFs and responding taxa of culture鄄independence bacterial endophyte
commimniuties detected from various tissues of A. officinarum Hance
组织 Tissue Shannon鄄Wiener多样性指数Shannon鄄Wiener diversity index
优势 T鄄RFs(bp)及其对应种群 (属级或以上水平)
Dominat T鄄RFs (bp) and representing taxa at genra level or above
根 Root 2.67依0.02c 44 (Oceanospirillales); *62 (Rhizobium); 74 (Sphingomonas);249 (Unclassfied); 306, 500 (Rhodobacterales); *401(Bacillus)
根茎 Rhizome 1.46依0.06b 44 (Oceanospirillales); 82 (Unclassfied); *404 (Bacillus);*222 (Brevibacillus)
茎 Stem 2.48依0.04d 47 (Alteromonadales); *68(Methylobacterium); 71 (Unclassfied) ;*74 (Sphingomonas); *404 (Bacillus)
叶 Leaf 2.88依0.02ba 41, *50 (Enterobacteriales); *68 (Methylobacterium); *456 (Kocuria)247, 249 (Unclassfied); *404, *404 (Bacillus); 444 (Vibrionales)
摇 摇 * 代表从所分离菌株中检测; 不同小写字母表示在 0.05水平上差异显著(P < 0.05, n= 3)
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图 3摇 高良姜不同组织可培养内生细菌种群组成
摇 Fig. 3 摇 Populations compositions of culturable bacterial
endophytes from various tissues of A. Officinarum Hance
2.4摇 可培养内生细菌抗逆促生潜力菌株的筛选
对部分所分离的细菌菌株进行了几丁质酶、葡聚糖
酶、ACC脱氨酶和生长素产生能力的测定,其结果综合
如表 3。 在所测试的 4个抗逆促生活性指标中,绝大多
数菌株(29 / 33)至少显示了 1种阳性结果。 其中,12 个
(36.36%)菌株显示几丁质酶产生潜力,其酶产率变化
在 0.58—3.32 U / mL之间,以芽孢杆菌 RZ鄄6产率最高;
17个(51.52%)菌株显示了葡聚糖酶产生能力,以芽孢
杆菌 S鄄16产率最高,达 31.3依1.22 U / mL。 其他葡聚糖
酶产生能力较强的菌株包括:泛菌 L鄄 2、考克氏菌 RZ鄄
22、甲基杆菌 L鄄 21 及芽孢杆菌 RZ鄄 9等;分泌生长素产
生筛选中,18个(54.55%)菌株显示了阳性结果,包括:
甲基杆菌 3株,芽孢杆菌 3 株,沙雷氏菌、根瘤菌、假单
图 4摇 高良姜不同组织内生细菌群体 T鄄RFLP指纹图谱
Fig.4摇 T鄄RFLP profiles of culture鄄independence bacterial endophytes commimniuties of various tissues of A. officinarum Hance.
胞菌和泛菌各 2株,伯霍尔德菌、类芽孢杆菌和柠檬酸杆菌各 1株。 其中假单胞菌菌株 L鄄20其生长素产率高
达(31.58依2.35) 滋g / mL;33个菌株中,9个(27. 27%)菌株能在以 ACC 为唯一氮源培养基中生长,包括:根瘤
菌 2株、芽孢杆菌 2 株、鞘氨醇单胞菌 1 株、甲基杆菌 2 株、泛菌 1 株,以根瘤菌 RZ鄄 1 ACC 脱氨酶产率最高
((2郾 67依0.27) U / mg菌体)。
表 3摇 高良姜内生细菌几丁质酶、葡聚糖酶、ACC脱氨酶、生长素产生菌的筛选
Table 3摇 Screening for production of chitinase,茁鄄glucanase, ACC deaminase, and IAA by bacterial endophytes from A. officinarum Hance
菌株
Strain
几丁质酶
Chitinase / (U / mL)
葡聚糖酶
茁鄄glucanase / (U / mL)
吲哚乙酸
IAA / (滋g / mL)
ACC脱氨酶 (U / mg菌体)
ACC deaminase / (U / mg cell)
R鄄1 18.56依1.11 2.67依0.27
R鄄3 23.33依2.19 2.16依0.15
R鄄5 1.38依0.22
R鄄14 1.75依0.34
R鄄15 9.87依35
R鄄17 2.39依0.34 11.48依0.94
R鄄22 0.82依0.49 5.94依0.25 2.03依0.11
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续表
菌株
Strain
几丁质酶
Chitinase / (U / mL)
葡聚糖酶
茁鄄glucanase / (U / mL)
吲哚乙酸
IAA / (滋g / mL)
ACC脱氨酶 (U / mg菌体)
ACC deaminase / (U / mg cell)
R鄄24 0.58依0.31 7.64依0.89 1.38依0.11
R鄄29 0.98依0.04 21.56依1.27
RZ鄄22 14.68依1.25
RZ鄄1 1.37依0.23
RZ鄄7 13.57依0.59
RZ鄄9 0.96依0.28 16.35依0.66 18.21依2.53
RZ鄄6 3.32依0.34 3.42依0.17 14.29依1.18
S鄄5 6.55依0.62
S鄄18 14.68依1.71 0.89依0.09
S鄄26 0.74依0.12
S鄄3 1.35依0.11 4.46依0.08 9.27依1.01
S鄄29 8.73依0.55 5.54依0.16
S鄄1 2.14依0.12 3.53依0.24 24.37依2.12
S鄄16 3.32依0.09 31.3依1.22 29.54依0.37 0.74依0.12
S鄄11 1.35依0.44
L鄄21 19.82依0.41 22.33依1.25
L鄄37 8.37依0.69 8.25依0.49
L鄄30 5.37依0.35
L鄄20 1.67依0.29 31.58依2.35
L鄄2 2.46依0.08 26.24依0.95 25.53依1.69 1.38依0.11
L鄄43 7.56依0.45
L鄄4 1.37依0.49
摇 摇 : 测定为阴性结果;数据为每一测定 3个重复的平均值; IAA: Indoleacetic acid; ACC: 1鄄aminocyclopropane鄄1鄄carboxylic acid
3摇 讨论
采用分离培养方法,本研究从道地高良姜分离得到的内生细菌归于 16 个不同的基因型、12 个不同的细
菌属(表 1,图 1,图 2),表明高良姜可培养内生细菌群体具有丰富的种群多样性和遗传多样性。 在本研究中,
芽孢杆菌从所有组织中得到且具有很高的分离比, 属于该植物可培养内生细菌最优势类群,而甲基杆菌为其
第二大优势类群(图 3)。 此外,热带根瘤菌和沼泽考克氏菌也具有较高的分离比,而一些土壤中常见的类群
如假单胞菌等其分离比相对较低(图 3)。 高良姜可培养内生细菌群体这种种群组成特征可能与该植物含有
多种具有抗菌活性的代谢产物、且该植物生长于高温高湿、低 pH值、高辐射的近海岸地区有关。 芽孢杆菌能
形成高抗逆性芽孢,甲基杆菌能在寡营养环境中生长,且大多具有较强的抗辐射和抗渗透压力[18],该 2 类细
菌高的抗逆能力使之能在高良姜组织定植和生存繁殖中更具竞争力。 而现有文献报导的热带根瘤菌、沼泽考
克氏菌主要分离自热带植物、热带土壤及海底沉积物中,该两个种群具有良好的低 pH、高温抗性,及多种化学
污染物抗性[19,20]。
分离培养是获得生物活性菌株的基础。 然而,由于大量细菌具有不可培养性及分离培养具有强烈的选择
性,使培养得到的内生菌不能完全反应自然状态下内生菌群落的真实情况。 T鄄RFLP 技术综合运用 PCR 技
术、限制性酶切技术、荧光标记技术和 DNA序列自动分析技术,不仅可定性评估群体中微生物种群数量,而且
可定量反映样品中的各类群丰度,在国内外已广泛应用于研究多种生境包括土壤、水域及其沉积物,动、植物
体表及内部组织微生物群体多样性及其动态变化[17,21鄄24]。 本研究采用 T鄄RFLP 技术进一步分析了高良姜免
培养内生细菌群体的多样性及其组织分布,结果显示与海洋螺菌、红杆菌、交替假单胞菌等海洋细菌及热带根
瘤菌、沼泽考克氏菌等相关的的 T鄄RFs在高良姜多个组织中检出,且具高的相对丰度(表 2,图 4),这个结果进
1123摇 10期 摇 摇 摇 李淑彬摇 等:南药植物高良姜内生细菌多样性及其促生潜力 摇
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一步说明该宿主植物生长环境是影响其内生菌种群组成的重要因素。 比较培养方法与免培养方法所得结果,
发现较之可培养细菌群体,其免培养群体种群多样性更为丰富(表 2),且免培养检测到的细菌群体中有近
50%的种群没有被分离到。 为了更全面了解可培养内生细菌的种群多样性,有必要对培养基及培养条件进行
更为细致的研究。 此外,本研究也发现 5个 T鄄RFs既没有在所分离菌株中检测到,也没有在相关数据库中检
索到,这 5个 T鄄RFs所对应的序列有如下两个可能: 1)未培养的内生细菌 16S rDNA 序列。 由于目前已登录
T鄄RFLP 数据库的细菌 T鄄RFs非常有限,所以未能查到其对应的细菌种群;2)植物叶绿体或线粒体的 rDNA序
列。 植物叶绿体 16S rDNA 和线粒体 18S rDNA序列同细菌 16S rDNA 高度同源,用细菌 16S rDNA通用引物
也可能导致植物组织中叶绿体或线粒体 rDNA序列的扩增。 由于目前尚无对应于植物叶绿体或线粒体 rDNA
序列的 T鄄RFLP 数据,目前所检测到的 5个未分类 T鄄RFs是否来源于植物细胞器,有待进一步研究。
分离培养方法及 T鄄RFLP 方法结果均显示高良姜内生细菌群体具有明显的组织差异(图 3,表 2),这可能
与该药用植物活性代谢产物在不同组织中的累积差异有关。 在相关研究中,测定了道地高良姜 4个不同组织
3种指标性成分总挥发油、1,8鄄桉油精以及高良姜素的含量,结果显示, 4 个不同组织中 3 种指标性成分含量
存在较大差异(详情另见文报道)。 研究已经显示这些成分均具有广谱的抗菌活性[9鄄12]。 群体中不同细菌种
群对这些物质的耐(抗)性可能不同,因而在该植物不同组织的生存和生长能力不同。 对植物内生菌的研究
发现一些细菌种群在某些植物中具有一定的组织专一性或喜好性。 如具有重要促生作用的内生性泛菌在水
稻中主要在叶和种子中分离[6],内生性的甲基杆菌主要从植物茎和叶分离[6,8]。 这些特定种群对植物组织偏
好型机理目前尚未有深入的研究和认识。 本研究中同样发现某些种群在高良姜植株内具有一定程度的偏好
性,如泛菌仅在其叶片中分离,而甲基杆菌也仅在两个地上组织中分离。 未培养群体中,对应于红杆菌的 T鄄
RFs在根中具有较高的丰度,而在其他组织丰度很低甚至没有检出,这个结果提示植物内化学环境的组织差
异可能是内生细菌组织偏好型的一个可能因素。 从另一角度,内生细菌生长于植物内部组织,由于基因转移
及对内化学环境适应,内生菌可获得直接合成这些代谢产物、或促进其生物转化的能力,因而,内生细菌种群
在高良姜组织间的差异可能也是导致该植物不同组织间活性代谢产物含量差异的原因之一。
几丁质酶和葡聚糖酶是与植物抗病防卫密切相关的水解酶,生长素可直接促进植物生长。 产 ACC 脱氨
酶的内生细菌能平衡植物因胁迫诱导产生的乙烯,从而间接促进植物根系延长和植株发育,在提高植物抗旱、
涝、盐、病和重金属等压力胁迫中具有重要作用[1,6鄄8,25]。 在本研究所测试的菌株中,36.36%、51.52%、54.56%
和 27.27%的菌株分别具有胞外几丁质酶、茁鄄葡聚糖酶,生长素及其 ACC 脱氨酶产生能力。 特别是泛菌 L鄄 2
和芽孢杆菌 S鄄16所测 4个指标均为阳性(表 3),是生防菌剂及生物肥料的良好候选;此外,热带根瘤菌菌株
R鄄1、R鄄3 显示了最高的 ACC脱氨酶产生及相对高的生长素产生能力(表 3)。 热带根瘤菌是已报道的极具应
用价值的固氮菌,其与多种热带豆科植物具有高的结瘤能力,且对低 pH、高温,及多种杀虫剂具有强的抗
性[20],菌株 R鄄1、R鄄3是促生菌剂的良好候选。
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