全 文 ：第4卷第1期
2006年2月
生物加工过程
ChineseJoumalofBi叩rocessEn舀neering
Feb．2006
· 9 ·
酶定向进化的研究进展
罗巅辉，方柏山
(华侨大学 工业生物技术研究所，泉州362021)
摘要：定向进化在改造酶的性质方面已得到广泛应用，各种建立突变库的方法不断涌现。对新近发展的几种突
变技术(如寡核苷酸设计型装配重组技术AD0、非序列同源蛋白重组旺既REC等)进行了简要地介绍与分类。与突
变技术相对应的筛选方法也在逐渐改变和完善，这里仅介绍高通量筛选方面的一些最新进展。
关键词：定向进化；突变库；高通量筛选
中图分类号：Q55 文献标识码：A 文章编号：1672—3678(2006)0l一0009一cr7
R鹤earchindirectedevolutionofem万瑚陀s
UJODiaJl一hui．FANGBai—shan
(Institute《IndustIialBiotechnolo舒，HllaqiaouI iversit)r，QI培n小ou36202l，CIlim)
Abs钉act：Directedevolutionhask．en奶delyusedtochaI]哩-etllecharacteristicsoferl巧me．田1efe鹊iblemet}l—
odsforgenemtingge elibraIiessuchasADOandSHIPRECwereintmducedint}lis枷cle；andrecentdevel．
opmentsinhigh-thmu曲putscreen(}rrS)forenz)硼eactiv时werediscussed．
KIeywords：directedevolution；咖tantlibraq；hi曲一thmu曲putscreen(HTS)
定向进化作为改造蛋白质的有效手段已被广泛
应用。通过定向进化可以使蛋白具备所需的各种性
质，应用于不同反应过程中。从该领域文章的增加
速度可以看出，在过去10a中，该技术已经逐渐渗透
到化工、医药、农业等各个领域，甚至已经成为生物
研究者的常用工具之一⋯。
1定向进化的建库策略
定向进化包括两个基本步骤：(1)建立目的酶
基因的突变体库；(2)对不同突变基因表达的蛋白
进行筛选，找到有益突变体。目前，建立突变库的策
略主要有随机突变、改组、和区域选择性突变。其中
随机突变与改组属于非理性设计，而区域选择性突
变属于半理性设计。
1．1随机突变
建立突变体库最直接的方式就是随机突变，这
种方法不需要知道蛋白质的结构信息，能够得到无
法预知突变位置的有益突变体。易错PCR是其典
型代表。它通过改变传统PcR反应体系中某些组
分的浓度，利用低保真DNA聚合酶，使碱基在一定
程度上随机错配而引入随机的点突变。然后，通过
筛选或选择，找到性质提高的突变体。
该技术可以应用在结构未知的对映体选择性催
化酶类的改造中，例如仅经过一轮易错PCR就可以
产生几十个R型或S型的环己烷单加氧酶突变
收稿日期：2006-01—05
基金项目：国家自然科学基金资助项目(20276026，20446004)；福建省自然科学基金资助项目(z0516009)；福建省科技计划重点课题基金
资助项目(20031020)。
作者简介：罗巅辉(1977一)，男，博士研究生，讲师，研究方向：蛋白质结构与功能的研究。
联系人：方柏山，教授，博导，主要从事生物反应工程和酶工程研究。E—nlail：‰gbs@I哪．edu．cn
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-12· 生物加工过程 第4卷第1期
物水解进而得到的产物，而产物可通过电荷作用耦
合到噬菌体颗粒上，之后通过一个能够亲和最终产
物的层析柱，带有产物的噬菌体被分离出来。采用
这种策略，cesaro．Tadic等人旧1即经过两轮筛选，从
超过109个突变体库中，得到一个催化活性提高
1000倍的突变体。另一个利用噬菌体展示进行筛
选的策略是将底物连接到表达目的酶的噬菌体上，
有活性的突变体转化噬菌体连接的底物成为产物，
而产物依然连接在噬菌体表面。再通过能够特异吸
附产物的层析柱时，带有活性酶的噬菌体被分离出
来(见图1)。这种策略最近被应用在腺苷酸环化酶
的筛选上，展示的酶将连接在噬菌体上的A1P催化
形成cAMP，用抗cAMP的抗体进行固相吸附，得到
一个活性提高70倍的突变体∞J。
图1利用噬菌体展示技术选择突变体
Fig．1High-thmughputscreen(HIS)ofenzymesusir唱phage-
displaylibr嘶es
细菌细胞表面展示技术与荧光激活细胞筛选仪
(nuorescenceA tivatedCellSorting，FACS)相结合是非
常有效的高通量筛选方法。Geo硒ou等人Ⅲ1利用革
兰氏阴性细菌表面带有的高负电荷，结合荧光共振
能量转换(nourescenceresonanceneq科t啪sfer，
FRET)底物的多阳离子尾巴，使底物附着在大肠杆
菌的表面。展示在大肠杆菌表面的酶剪切底物的淬
灭基团从而产生相应荧光，通过FACS进行检测，得
到了活性提高约60倍的蛋白酶突变体。流式细胞
仪结合细胞表面展示技术具有以下几个明显的优
点：能够定量分析酶活性，同时测定多个参数，并且
对每个观察到的克隆进行记录。
2．2核糖体展示(RibosomeDisplay，RD)瞄o
RD技术是一种完全在体外合成蛋白质分子并
进行选择与进化的新技术。它的基本原理是通过
PCR扩增建立突变的DNA文库，置于具有藕联转录
／翻译的无细胞翻译系统中孵育，使目的基因的翻译
产物展示在核糖体表面，并形成“rIlRNA．蛋白质．核
糖体”三元复合体，最后利用常规的免疫学检测技
术，通过固相化的靶分子直接从三元复合体中筛选
出感兴趣的核糖体复合体，再利用RT—PCR扩增，进
行下一循环的富集和选择，最终筛选出高亲和力的
目标分子。
目前，RD技术作为功能蛋白质的筛选工具主要
有两种类型：一种类型是““州A．核糖体．蛋白质”以
非共价键形式形成三元复合体，称之为核糖体展示；
另一种类型是以共价键形式构成的耐州A．蛋白质
融合体，称之为谳州A一蛋白质融合展示。rr·RNA．蛋
白质融合体主要是借助一种蛋白合成抑制剂嘌呤霉
素形成的。
核糖体展示技术具有库容量大的优点。由于该
技术完全在体外进行，不受克隆和细胞转染效率的
限制，库容量可以达到10¨，超过噬菌体展示库的容
量。RD技术采用体外无细胞系统，目的蛋白展示在
细胞外的核糖体表面。因此，RD技术可以应用于任
何有细胞毒性分子的筛选与研究。另外，在体外核
糖体展示系统中蛋白的表达环境可精确控制，更有
利于目标蛋白的展示。利用此技术，对单链抗体可
变区片断进行表达文库的筛选，得到了亲和力提高
40倍的突变体ⅢJ。
2．3基因作用机制筛选
基因作用机制筛选或体内筛选是定向进化的传
统工具，从进化目标的广泛程度来讲，这种方法的应
用是有限的，毕竟这种选择方案是基于进化产生的
活性与缺陷型宿主互补。然而，利用酵母三杂交系
统，将酶的催化活性与报告基因的转录联系起来，大
大扩展了体内选择机制的应用范围仞J。
Han等人协1利用该思想建立了一个酵母蛋白酶
筛选模型，可以有效的筛选底物特异性蛋白酶突变
体。利用分泌蛋白必须经过高尔基体的特性，将转
化酶INV与高尔基体膜附着蛋白SrIEl3通过连接蛋
白链相连，而底物特异性表现在连接蛋白链的氨基
酸序列上，将突变基因转入酵母体内，如果表达的蛋
白酶突变体能特异性识别该序列，INV就会被从高
尔基体膜上切除下来，分泌到胞外，转化利用蔗糖，
酵母细胞生长。如果蛋白酶突变体不能识别并切断
该序列，则该酵母细胞在蔗糖培养基上不能生长(见
图2)。
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2006年2月 罗巅辉等：酶定向进化的研究进展 ·13·
图2利用酵母筛选模型选择突变体
Fig．2High-tllrou曲putscreen(HrS)ofen巧mesbyyeast．based
model
2．4 体外区室化(溉秽i￡r0companmentalization，
IvCP3
体外区室化是将水相混入油相体系中，形成较
小的水相区室，建立一个水／油体系。平均每个液滴
包含单个基因，液滴的体积容许单个DNA分子进行
转录、翻译及酶分子的检测。周围的油相惰性较大，
限制了基因和蛋白在不同区室间的扩散，其高容量
(>10m在1—11L混合液中)、易制备和在各种温度下
的稳定性使Ⅳc在酶的高通量筛选体系中特别吸引
人的注意。
IVC提供了一个简便的方法，使基因和其编码
的蛋白共同区室化于一个空间中，但是酶活的选择
需要将基因与反应的产物联系起来。一个可行的选
择方案是将酶催化的底物与起始基因合二为一，进
而再来分析产物的有无，这样编码酶的基因就可以
通过对产物的捕捉而被挑选出来。这个策略最经典
的应用是针对DNA修饰酶类的筛选。如限制性内
切酶、甲基化酶和DNA聚合酶，此时编码酶的基因
和底物是同一个分子，事实上，Ⅳc第一次就是应用
在DNA甲基化转移酶的选择上㈨J，当反应完成后，
将基因从微液滴中回收，再用同源的限制性内切酶
切割，以去除未被甲基化的DNA，从而进行选择。
一个HaeⅢMT鼬e经过Ⅳc改造，获得的突变体对
原先识别的序列(GGcc)活性提高了9倍‘31。。但是
这种选择模式在选择酶活的种类上受到限制。
第一个应用Ⅳc于非DNA修饰酶筛选的例子
是用IvC筛选细菌磷酸丙糖酯酶b引，选择的策略是
两步区室化：第一步，将转录基因固定到液滴中的微
珠上，再通过亲和标记捕获翻译产生的蛋白，使微珠
上带有一个基因和多个该基因编码的蛋白突变体。
第二步，将微珠抽提出来，置于含有修饰过的底物溶
液中，再次形成区室化。产物可与微珠结合，使具有
较高酶活的微珠被产物所包被，再用加有荧光标记
的抗产物的抗体进行结合检测，通过FAcs进行筛
选，从超过107的突变体库中筛选得到一个突变体，
其Kcat有较大提高(>105／s)。
Ⅳc筛选模式的优点在于这个体系是纯体外筛
选系统，这样底物、产物和反应状态不会受到体内系
统的干扰。然而，无细胞翻译体系必须在确定的
pH、缓冲体系、离子浓度和金属离子成分等条件下
进行，在上面的例子中，通过两步连续区室化，使翻
译过程与酶催化过程分离，这样使催化过程的筛选
不受翻译过程的影响。那么，是否可以只采用一步
区室化就完成整个筛选过程呢?即在翻译完成后，
不破坏微液滴而能够调节微液滴内的物质成分。最
近，已经有若干个相应技术被开发出来，用来在不破
坏液滴完整性的前提下，对其内含物进行调节，包括
疏水底物在油相中传递，酸的运输使液滴pH恢复，
液滴中底物的光激活等等[3|。此外，一种纳米微球
运输技术最近被用来向微液滴中运送各种物质，甚
至包括金属离子。如在选择DNA核酸抑制因子中，
未激活的DNA核酸酶与突变基因被共同区室化，当
翻译完成后，向微液滴中运输镍离子或钴离子，使核
酸酶激活，此时能编码合成核酸酶抑制因子的基因
存留下来不会被降解，这些基因还可以进一步被抽
提出来进行扩增Ⅲo。
在酶活检测中必须将产物与基因联系在一起，
使我们在利用Ⅳc对非DNA修饰酶类进行筛选时
受到巨大限制。最近，_个改进的策略被建立起来，
可以将基因、酶以及被催化形成的荧光产物共同区
室化，并进行筛选。这项技术利用双区室化系
统b5。，即水／油／水系统，结合FAcS进行分选。该方
法具有广泛的通用性，并且在制造和分选水／油／水
双区室时，不会打破原来的水／油微液滴。
3展望
全基因随机突变的方法直接有效，改组和区域
性选择突变可以得到更多的突变组合。日益增加的
蛋白结构与化学信息，使选择区域性突变的地位变
得越来越重要，半理性设计使我们在蛋白质定向进
化过程中有了更加明确的方向。过去几年，对酶活
高通量筛选方法的研究和应用有了巨大的进步，这
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2006年2月 罗巅辉等：酶定向进化的研究进展
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