全 文 ：收稿日期：2008-08-11
基金项目：国家自然科学基金（30671530）
作者简介：吴振芳（1984-），男，研究生，主要研究方向：分子酶学
通讯作者：陈惠，E-mail：chenhui@sicau.edu.cn
蛋白质定向进化又称为蛋白质的体外分子进
化，是人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化
机制，在体外对蛋白质基因进行改造，产生基因多
样性，在结合定向筛选（或选择）技术，获得所需性
能大幅提高的突变体 [1]。 与合理设计相比，蛋白质
定向进化不用事先了解蛋白质的结构、 活性部位、
催化机制等因素 [2]，而与同序概念相比 ，不需要科
研者具有复杂的生物软件和统计学基础 [3]。 蛋白质
定向进化是蛋白质工程的有效手段，在农业 、工业
和医药等领域都展现了其巨大的潜力。
大部分定向进化的研究目的局限于对蛋白质
现有功能进行改进 ， 比如提高酶热稳定性和酶活
等，利用定向进化策略对自然界蛋白质引入新功能
仍然是目前研究的难点。研究的难点主要表现在以
下两个方面：（1）蛋白质新功能的产生通常是一系列
突变、重组共同作用引起的，而目前大部分定向进
化策略，比如易错 PCR，DNA shuffling 等，都只局限
于少数氨基酸发生突变 [4]；（2）利用定向进化策略引
入蛋白质新功能通常需要对原始序列进行大幅度
的改造， 所构建的突变体库中含有大量无活性蛋
蛋白质新功能定向进化研究策略
吴振芳 陈惠 曾民 吴琦
（四川农业大学生命科学与理学院，雅安 625014）
摘 要： 利用定向进化策略改造蛋白质功能已经在农业、工业和医药等领域得到了广泛的应用。蛋白质工程的最
新进展是利用定向进化策略对自然界蛋白质引入新功能，但由于其决定因素比较复杂，是研究者面临的一个重大挑战。
详细介绍了国外近年发展的蛋白质新功能定向进化研究策略：对传统突变体库构建策略进行改进以及非同源重组改造
技术的开发，是早期引入蛋白质新功能的常用手段，利用计算 / 理性设计与定向进化相结合引入蛋白质新功能是近年定
向进化研究的一个重大突破，而噬菌体展示技术是蛋白质新功能筛选的主要策略。蛋白质新功能的分子进化模型已逐渐
成为蛋白质工程改造的新思路。
关键词： 定向进化 蛋白质新功能 计算结合设计 噬菌体展示 分子进化模型
Strategies for Introduction of Novel Protein Functions through
Directed Evolution
Wu Zhenfang Chen Hui Zeng Min Wu Qi
（College of Biology and Science，Sichuan Agricultural University，Yaan 625014）
Abstract： Directed evolution as an effective technique to engineer enzymes for the requirements of industrial，
medical and research application，have been used in protein engineering to introduce novel functions to natural protein，
with many limited factors being existed. This review aimed to introduce several strategies for introduction of novel
protein functions through directed evolution. The improvement of traditional strategies for Sequence diversity library
Creation，techniques for nonhomologous recombination and rational/ computational design have been proved as effective
methods for introduction of novel protein functions，Phage display is considered as the main screening strategy for novel
protein functions. Molecular evolution model has been paid special attention for obtaining novel protein functions.
Key words： Directed evolution Novel protein function Computational design Phage display Molecular
evolution model
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 3期·综述与专论·
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 3期
白，增大了筛选的难度 [5]。 选取一种快速、有效的高
通量筛选方法是蛋白质新功能定向进化研究的另
一个挑战。
蛋白质新功能的引入是目前定向进化研究的
新主题，各种有效的研究策略的涌现不仅是科学家
们智慧的结晶，也体现了蛋白质新功能研究的巨大
魅力。目前构建蛋白质新功能突变体库主要包括定
向进化策略、 结合计算方法/半理性设计的定向进
化策略、构建蛋白质新功能的分子进化模型 ，而蛋
白质新功能的筛选策略主要根据实验的具体情况
进行选取设计，主要集中于展示技术。 本实验室一
直致力于酶工程的研究，已经通过很多方法对植酸
酶 、纤维素酶等应用性较强的进行了改造，并取得
了很好的成绩 [6~8]。 目前，在承担利用定向进化策略
提高植酸酶热稳定性的同时，试图利用各种策略对
纤维素酶进行改造，以获得纤维素混合酶。
1 蛋白质新功能突变体库构建策略
1.1 定向进化
定向进化策略已经成为蛋白质工程的主要手
段，在农业、工业、医药等领域都展现了其巨大的潜
力。 然而，传统的定向进化策略主要用于对蛋白质
现有功能的改进，对于蛋白质新功能的引入依然存
在局限性。随着各种同源重组以及非同源重组策略
的相续报道，定向进化策略对自然界蛋白质引入新
功能已经成为了可能。
同源重组实验往往对蛋白质引入局部突变，以
点突变为主， 其为蛋白质引入新功能的可能性极
小。然而通过多次同源重组实验以及高效的筛选方
法，科学家们已经通过此技术成功开发了蛋白质新
功能。 Yano 等 [9]在 2001 年对来源于嗜热古菌 pyro-
coccus furiosus 的毫无功能相关的 DNA 片段进行
50 次 DNA shuffling 试验， 最终在大肠杆菌中获得
了具有氨苄青霉素抗性新型蛋白质。
Chen 和 Zhui[10]于 2005 年提出一种用于获取蛋
白质新功能新蛋白工程策略——体外协同进化（in
vitro coevolution）。 体外协同进化在试管内模拟自然
协同进化过程，包括野生型蛋白-中间蛋白-新蛋白
的假设进化途径（图 1）。 中间功能可以充当野生型
蛋白功能和新蛋白功能的功能缝隙，野生型蛋白的
起始功能不能通过试验进行筛选，任一中间功能便
可以设计试验方法筛选获得。作者利用体外协同进
化以人类雌激素受体 α 配体结合域 （hERαLBD）为
模型，发现两种类固醇——睾酮和孕酮提供 17β-雌
二醇和皮质酯酮的中间结构桥梁，以辅助 hERαLBD
的定向进化。
同源重组获得的突变体通常能够维持与亲本
的结构相似性，而非同源重组由于不依赖亲本序列
的相似性，极大扩大了突变体库的多样性 ，是引入
蛋白质新功能的有效手段。现已成功用于酶改造的
基于非同源基因重组策略主要有不依赖序列同源
性产生多重交叉 DNA 库（Creating multiple-crossover
DNA libraries independent of sequence identity， SCR-
ATCHY） [11]、不依赖序列同源性的蛋白质重组（sequ-
ence homology-independent protein recombinatio-n，S-
HIPREC） [12]、不依赖序列的定点突变嵌合产生（seq-
uence-independent site-directed chimeragenesis， SISD-
C） [13]、非同源随机重组 （nonhomologous random reco-
mbination， NRR） [14]。 不依赖序列的定点突变嵌合产
生 （sequence-independent site-directed chimera-genes-
is， SISDC） 是 Hiraga 等于 2003 年提出的一种简单
而普遍的非同源重组方法，其不依赖亲本基因的同
源性而实现多位点的交叉重组，可以用于多个亲本
序列或其元件（elements）的重组改造。Hiraga 等 [13]利
用 SISDC 在 7 个位点对亲缘关系较远的两种 β-内
酰胺酶，TEM-1 和 PSE-4（氨基酸序列 40%同源性，
核酸序列 49%同源性）进行重组，以产生含有 28 条
嵌合序列的文库 ，结果表明 β-内酰胺酶基因重新
构建的成功率大约为 50%。 Joshua 等 [14]于 2004 年
创立了非同源随机重组（nonhomologous random rec-
ombination， NRR），实现了无同源性 DNA 序列的随
机重组，对于调整片段大小、交叉重组频率以及亲
图 1 体外协同进化策略设计蛋白质新功能示意图 [10]
12
2009年第 3期
本基因数量都更具有很强的机动性。 Guntas 等 [15]利
用非同源重组方法对大肠杆菌麦芽糖结合蛋白
（MBP）基因和 TEM-1β-内酰胺酶基因进行改组，获
得了新 β-内酰胺酶，其催化活性受麦芽糖调控。
1.2 结合计算/理性设计方法进行定向进化
结合计算/合理设计方法很大程度上克服了传
统定向进化策略不能彻底搜索巨大序列空间的局
限性，从而成为近年来蛋白质定向进化研究的两个
新的发展方向 [16]。
计算设计方法 （computational design）因其可以
预测所给序列的适合度而被成功运用于定向进化，
对于蛋白质的某种特性，比如稳定性、相似性，都可
以通过相应的软件包得到理想的预测结果 [17]。 理性
设计 （rational design）在定向进化实验中的作用主
要集中于高质量序列多样性突变体库的产生，结合
理性设计知识减少了随机突变的序列空间，为蛋白
质合理设计提供了突变目标 [18]。 结合理性设计进行
定向进化的最大优点表现在能够通过定向进化无
限扩大基因设计引入的微小起始活力 [19]。 目前，利
用计算 /理性设计方法已经成功实现了向蛋白质引
入新的催化活性、提高蛋白质的稳定性、设计酶的
催化活性位点、改变酶的底物特异性等。 本实验室
通过植酸酶三维结构和热稳定性因素对植酸酶进
行定点突变 [6]和延伸突变 [7]，均获得了热稳定性相
应提高的突变酶（图 2）。
Park 等利用功能元件结合 /调整 （simultaneous
incorporation and adjustment of functional elements，
SIAFE）结合定向进化引入新的催化活性。 SIAFE 主
要通过插入、删除以及基因片段的替换实现功能元
件结合和调整， 然后通过定向进化积累点突变，最
终引入新的催化活性。构成酶活性位点功能元件确
立主要基于酶氨基酸序列、催化机制以及其结构信
息进行理性设计。 Park 等 [20]利用 SIAFE 对乙二醛酶
II 引入内酰胺酶活性， 获得的新酶 evMBL8 完全丧
失了其原来活性，而具有催化头孢噻肟的活性，（k-
cat/km）app 为 1.8×102 mol/L·S，从而使大肠杆菌获得
头孢噻肟抗性。
以结构为基础的计算 /理性设计与定向进化相
结合已经成为蛋白质工程的一个新发展方向，尤其
在引入蛋白质新功能方向展现了其巨大的潜力。目
前， 计算/理性设计用于蛋白质改造仍然是定向进
化研究领域的一大挑战。这主要表现在计算设计方
法在对复杂酶机制分析时表现出的计算能力有限
和现有的运算法则不适合更多复杂的酶机制 。 其
次，现已知的酶空间结构信息和酶催化机制相当有
限， 这也很大程度上限制了计算/理性设计在蛋白
质工程领域的应用。 另外，理性设计的新酶的活性
往往低于天然酶。开发具有更强计算能力的运算法
则和探索更多酶的空间结构与催化机制将使计算/
理性设计与定向进化相结合快速引入蛋白质新功
能成为可能。
2 蛋白质新功能筛选策略
蛋白质突变体库构建之后，筛选方法的确定决
定了蛋白质外定向进化的方向和成功与否。成功的
筛选方法能够有效的实现基因型和表现型的连接，
以实现功能蛋白的获得（图 3） [21]。 利用定向进化策
略引入蛋白质新功能通常需要对原始序列进行大
幅度的改造，所构建的突变体库中含有大量无活性
蛋白，增大了筛选的难度 [4]。 而且因为不同的实验
目的不一样，几乎不可能获得一种普遍的 、适用任
何试验的经典筛选策略。蛋白质新功能筛选策略的
局限性很大程度上阻碍了对自然界蛋白质引入新
功能的研究步伐，所以选取一种快速、有效的高通
量筛选方法是蛋白质新功能定向进化研究的一个
挑战，也是成功引入蛋白质新功能的突破口。
2.1 常规的高通量筛选策略
利用表型观察筛选是一种传统的筛选方法，是
基于细胞生长率和生存率的筛选方法。利用这种筛
（a） （b）
图 2 植酸酶 F43Y 点突变前后化学结构图
a. phytase PP-NPm-8；b. phytase F43Y
吴振芳等：蛋白质新功能定向进化研究策略 13
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 3期
选方法，You 和 Arnold[22]通过连续几轮随机突变和
筛选提高了枯草杆菌蛋白酶 E 的表达水平和在有
机溶剂中的活性。 然而，表型观察筛选法具有很大
的局限性，如不能定量、对蛋白质特性中的微小的
变化不灵敏，因此不能被广泛使用。
表面展示技术是应用比较广泛的蛋白质突变
体库高通量筛选方法，大致分为体内筛选和体外筛
选技术。 体内筛选每步都需要活细胞，库容量受转
化效率的限制，大约为 109。应用比较广泛的体内筛
选技术主要有细胞表面展示技术 （cell-surface dis-
play） [23]和噬菌体表面展示技术 （phage display） [24]。
体外筛选技术克服了转化效率对库容量的限制，实
现了在体外筛选和展示功能蛋白 ， 库容量可达
1012~1013。核糖体展示技术（ribosome display） [25]、mR-
NA 展示技术（mRNA display） [26]和体外区室化（In v-
itro compartmentalization）[27]是目前应用比较成熟的体
外筛选技术。
2.2 蛋白质新功能筛选策略
近几年，基于多样性的蛋白质突变体库的高通
量筛选方法得到了快速的发展，但迄今还未有一种
非常有效的方法适合蛋白质新功能的筛选。这主要
是因为引入蛋白质新功能往往需要对原始序列进
行大幅度的改造，所构建的突变体库中含有大量无
活性蛋白，增大了筛选的难度。另外，新功能的引入
往往由不同的蛋白质存在很大的差异，这也为开发
筛选方法提出可挑战。 目前，已经成功应用于获得
蛋白质新功能的筛选策略相对有限，而且没有系统
性。
噬菌体展示技术（phage display）是 1985 年 Sm-
ith 博士建立的一个划时代的实验技术， 从建立至
今，在生物学的许多领域得到了广泛应用。 λ 噬菌
体、T7 噬菌体、丝状噬菌体在内的许多噬菌体都可
以用于展示宿主 ， 而目前应用最为广泛的是 M13
丝状噬菌体。噬菌体展示技术筛选的主要原理是以
改造的噬菌体为载体，将待选基因片段定向插人到
噬菌体外壳蛋白质区，使外源多肽或蛋白质与外壳
蛋白融合表达并展示于噬菌体表面，通过表型筛选
获取编码基因。噬菌体展示技术在新蛋白质筛选中
起着重要作用，已成为后基因组时代蛋白质相互作
用研究的重要工具之一 [28]。 此外，蛋白质水解结合
噬菌体展示技术已经被用于获得稳定新蛋白可能
性的研究。2000 年，Riechmann 等 [29]把编码冷休克蛋
白（CspA）N 端基因与片段化的 E.coli 基因组融合，
然后筛选抵抗蛋白质水解作用的新蛋白。
Olsen 等运用细胞表面展示技术结合荧光激活
细胞筛选仪（Fluorescence Activated Cell Sorting， FA-
CS）获得底物特异性改变的新酶，为蛋白质新功能
筛选提供了另一新方向 [30]。
3 蛋白质新功能的分子进化模型
在数亿年的自然界进化过程中，常常伴有新蛋
白质或蛋白质新功能的产生，以使生物适应环境的
变化。 蛋白质定向进化即为人为模拟自然进化过
程，以获得所需特征的突变酶。 蛋白质新功能的产
生模型不仅可以揭示生物进化历程，也可以为人工
引入蛋白质新功能提供思路，蛋白质分子进化模型
的研究具有重大的理论和应用意义。 目前，蛋白质
新功能的产生模型在以下两个方面已经基本达成
共识：（1）引起自然界蛋白质产生新功能的突变数量
往往很少，而且大部分集中在活性部位的附近；（2）
蛋白质新功能的产生不是一步过程，需要几种中间
功能的过渡 [4，31]。 这两种模型为蛋白质新功能定向
进化研究提供了新方向，目前也获得了成功应用。
根据第一个蛋白质分子进化模型，引起蛋白质
产生新功能所需要的突变数量往往没有我们想象
的大，而且活性部位的氨基酸残基对蛋白质功能改
变的影响往往要比其它氨基酸大得多，这个事实使

图 3 各种筛选方法基因型和表现型的连接策略 [21]
14
2009年第 3期
实验室获得蛋白质新功能不再遥不可及。 同时，生
物信息学和结构生物学的飞速发展，使获得蛋白质
活性位点已经成为快速而简单的工作。理性设计与
定向进化结合是在这个模型的基础上而发展起来
的蛋白质工程策略，通过点突变向序列中引入关键
残基和结构元件，从而在定向进化中增加有益突变
重组的频率。 根据第二个蛋白质进化模型，大部分
蛋白质都具有中间混杂功能（promicuous func），这些
蛋白质都具有引入新功能的潜力。
4 蛋白质新功能研究的生物意义及研究进展
定向进化已成为蛋白质工程改造的重要手段，
蛋白质新功能的引入已逐渐成为定向进化研究的
新主题。蛋白质新功能的引入在理论研究和实践应
用中都具有重大的意义。蛋白质新功能的成功引入
不仅能体现科学家对蛋白质的深入了解，更能体现
蛋白质工程、生物信息学以及结构生物学等许多交
叉学科的发展和成功结合。 在实践应用中，蛋白质
新功能可以结合原蛋白质在应用中的缺陷进行相
应改造引入，增加其实践应用价值。 本实验室结合
目前已报道的策略正对纤维素酶进行改造，以期望
通过理性设计和蛋白质进化模型获得同时具有内
切葡聚糖酶、 纤维二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶性质
的复合酶，最终降低纤维素酶的应用成本。
随着生物信息学以及蛋白质结构生物学的飞
速发展， 计算/理性设计与定向进化相结合以及蛋
白质分子进化模型已成为设计蛋白质新功能的两
条新思路。 然而，利用定向进化策略对自然界蛋白
质引入新功能仍然是目前研究的难点，主要表现在
具有更强计算能力的运算法则、更多酶的空间结构
与催化机制以及高效筛选策略的开发和探索。计算
法则和蛋白质分子模型的建立将成为蛋白质新功
能突变体库构建策略研究的重点，而多个筛选策略
的共同作用将成为新蛋白质的筛选主要手段。
参考文献
1 Farinas ET，Bulter T. Curr Opin Biotechnol，2001，12（6）：545~551.
2 Garmaise M. Rev Financ Stud，2001，14（4）：1183~1213.
3 Lehmann M，Pasamontes L. Biochim Biophys Acta，2000，1543
（2）：408~415.
4 Zhao HM. Biotechnol and Bioeng，2007，98（2）：313~317.
5 Yuan L，Kurek I. Microbiol Mol Biol Rev，2005，69（3）：373~392.
6 Chen H，Wang HN. Chinese Journal of Biochemistry and Molecular
Biology，2005，21（4）：516~520.
7 Chen H，Wang HN. Chinese Journal of Biotechnology，2005，21
（6）：983~987.
8 Zou LK，Wang HN. J Zhejiang Univ Sci B，2008，9（7）：536~
545.
9 Yano T，Kagamiyama H. Proc Natl Acad Sci USA，2001，98（3）：
903~907.
10 Chen ZL，Zhao HM. J Mol Biol，2005，348（5）：1273~1282.
11 Lutz S，Ostermeier M. Proc Natl Acad Sci USA，2001，98（20）：
11248~11253.
12 Udit AK，Silberg JJ. Methods Mol Biol，2003，231：153~163.
13 Hiraga K，Arnold FH. J Mol Biol，2003，330（2）：287~296.
14 Bittker JA，Le BV. Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（18）：
7011~7016.
15 Guntas G，Mansell TJ，Kim JR. Proc Natl Acad Sci USA，2005，
102（32）：11224~11229.
16 Funke SA，Otte N，Eggert T. Protein Eng Des Sel，2005，18
（11）：509~514.
17 Dwyer MA，Looger LL. Science，2004，304（5679）：1967~1971.
18 Chica RA，Doucet N，Pelletier JN. Curr Opin Biotechnol，2005，
16（4）：378~384.
19 Shanklin J. Curr Opin Plant Biol，2000，3（3）：243~248.
20 Park HS，Nam SH. Science，2006，311（5760）：535~538.
21 Matsuura T，Yomo T. J Biosci Bioeng，2006，101（6）：449~456.
22 You L，Arnold FH. Protein Engineering，1996，9（1）：77~83.
23 Stahl S，Uhhn M. Trends In Biotechnology，1997，15（5）：l85~
192.
24 Smith GP. Science，1985，228（4705）：1315~1317.
25 Mattheakes LC，Bhatt RR，Dower WJ. Proc Natl Acad Sci USA，
1994，91：9022~9026.
26 Roberts RW，Szostak JW. Proc Natl Acad Sci USA，1997，94
（23）：12297~12302.
27 Griffiths AD，Tawfik DS. EMBO J，2003，22（1）：24~35.
28 Cesaro TS，Lagos D，Honegger A. Nat Biotechnol，2003，21（6）：
679~685.
29 Riechmann L，Winter G. Proc Natl Acad Sci USA，2000，97（18）：
10068~10073.
30 Olsen MJ，Stephens D，Griffiths D. Nat Biotechnol，2000，18
（10）：1071~1074.
31 Aharoni A，Gaidukov L，Khersonsky O. Nat Genet，2005，37（1）：
73~76.
吴振芳等：蛋白质新功能定向进化研究策略 15