全 文 ： 万方数据
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2006年2月 孙乃霞等：高产虾青素红法夫酵母的选育及代谢通量分析 ·59·
利用SAS软件对实验数据进行二次多项回归，
获得虾青素产量对蔗糖浓度、初始pH和发酵温度
的二次方程见式(1)。
y=6．2405+0．2618X1—0．0844X2—0．137
2X3—0．6008X2+0．2669X1X2一O．0421XlX3一
o．1167霹一o．196如邑一o．3785霹 (1)
回归方程的R2=O．909，说明该模型的拟合效
果较好，可以代替实验真实点对实验结果进行分析。
由式(1)可计算得到3个因素的最佳组合为：x．=
0．25，蜀=0．116，墨=一0．226，即蔗糖质量浓度为
31．7∥L，初始pH为5．05，发酵温度为17．8℃，虾青
素预测产量】，=6．284nlg／L。在该条件下进行摇瓶
发酵实验，得到虾青素的产量为6．3381119／L。因此，
通过培养基和培养条件的优化，突变株的虾青素产
量从初始的2．674mg／L，提高到了6．338Ⅱ叫L。
2．3分批培养红法夫酵母的代谢通量分析
2．3．1代谢通量平衡方程的建立
工业微生物菌种改造的一般方法是先将菌株进
行物理或化学诱变，再根据合适的表型筛选出部分
突变株，最后检验其产量或产率是否得到提高。但
是由于诱变的随机性，不容易确定出发菌株基因组
的具体改变。为了考察突变株代谢方面的变化，对
突变株与野生株对数中期的通量分布进行了比较。
首先建立了红法夫酵母的代谢通量平衡方程，
图1所示的生化反应网络由13个代谢物和15个反
应速率组成。根据拟稳态假设可知中间代谢物的净
产生速率为O。围绕co也可以引入一个平衡式。
因此，本文建立的模型中总反应速率为15个，平衡
方程为10个，系统的自由度为5。通过实验可以测
定的值有：葡萄糖的消耗速率、丙酮酸的分泌速率、
虾青素的产生速率及比生长速率。根据本实验室博
士论文的研究结果旧J，该条件下发酵的副产物为丙
酮酸，其他有机酸等副产物可忽略不计，因此通过碳
平衡可以计算C02的产生速率，该系统可以得到唯
一解。根据Johnson等人[11]测定红法夫酵母生物体
组分，并结合大分子生物合成路径，计算各前体代谢
物的需求系数，结果如表6所示。
表6红法夫酵母生长的前体需求系数
T蝴e6 mcur∞rrequirememco 伍cie鹏for珊啦砌妞y撇
2．3．2代谢通量分析结果
在间歇培养条件下，分别测定野生株和突变株
对数生长期发酵液中的葡萄糖的比消耗速率、丙酮
酸、虾青素的比产生速率及比生长速率，并计算得到
cO，的比产生速率，带入计量矩阵，计算网络的代谢
通量分布，结果如图6所示。
对比图6所示野生株与突变株的通量分布图，
可以看出以下几点：(1)突变株的PP途径通量较野
生株减小，EMP途径和1℃A循环的通量有所增加。
(2)突变株用于细胞合成的通量有所减小。尤其是
对于需求系数比较高的乙酰辅酶A，通量需求减小
了6％。(3)在丙酮酸节点处，由于丙酮酸脱氢酶的
效率比较低，在突变株和野生株的代谢中均有大约
32％的通量分泌到胞外，而丙酮酸不能被红法夫酵
母很好的利用HJ，造成碳源的极大浪费。
通过计量分析可知，乙酰辅酶A至虾青素合成
路径的通量增加1，则虾青素的通量就能增加0。04。
因此，减少丙酮酸的分泌，增加其至乙酰辅酶A途
径的通量，对虾青素产量的提高至关重要。
(图中数据左侧为野生株通量值，右侧为突变株通量值)
图6野生株与突变株间歇发酵的代谢通量分布图
Fig．6MetabolicnuXdis晡butionsofwildstraina dmutantin
batch{-ernlentation
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·60· 生物加工过程 第4卷第1期
3结论
利用紫外线和亚硝基胍对红法夫酵母进行诱变
处理，可以显著提高虾青素的产量和含量，|3．紫罗酮
可有效抑制类胡萝卜素合成，降低筛选难度。经过
两轮紫外线诱变和两轮亚硝基胍诱变得到类胡萝卜
素产量和含量分别较出发菌株提高81．7％和2．25
倍的突变株。通过对发酵培养基的组分及发酵条件
的优化，突变株的虾青素产量由从初始的2．674nlg／
L，提高到了6．338mg／L。代谢通量分析结果表明：
突变株与野生株相比，PP途径通量减小，而EMP途
径和TCA循环的通量有所增加。大量丙酮酸分泌
至胞外，造成碳源浪费，因此通过遗传改造和发酵控
制提高丙酮酸至乙酰辅酶A的反应效率，可能会为
虾青素合成提供更多前体物，从而提高虾青素的产
量。
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