全 文 ：第７卷第２期
２００９年３月
生 物 加 工 过 程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．７Ｎｏ．２
Ｍａｒ．２００９
收稿日期：２００８－０７－１７
基金项目：江南大学人才引进基金资助项目（００６６２６）
作者简介：王 蕾（１９８１—），女，内蒙古包头人，硕士研究生，研究方向：生物大分子结构功能；廖祥儒（联系人），教授，博士生导师，
Ｅｍａｉｌ：ｌｉａｏｘｉａｎｇｒｕ＠１６３．ｃｏｍ
ＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍｓｐＳＹＢＣＷＵ ３脂肪酶的
双水相萃取和酶学性质
王 蕾１，２，蔡宇杰１，廖祥儒１，张 峰１，张大兵３
（１．江南大学 生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室，无锡 ２１４１２２；
２．内蒙古科技大学 生物与化学工程学院，包头 ０１４０１０；
３．江苏汉邦科技有限公司，淮安 ２２３００１）
摘 要：初步研究双水相体系对ＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍｓｐＳＹＢＣＷＵ ３脂肪酶的萃取分离效果，选用ＰＥＧ４０００／ＮａＨ２ＰＯ４作为
成相系统进行系统研究，考察影响脂肪酶萃取的各种因素（如ＰＥＧ相对分子质量及质量分数、ＮａＨ２ＰＯ４质量浓度、
ｐＨ），并采用正交实验进一步优化实验条件，确定双水相萃取体系为 ＰＥＧ质量分数为３０％、ＮａＨ２ＰＯ４质量分数为
２０％、体系ｐＨ为６，在此条件下ＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍｓｐＳＹＢＣＷＵ ３脂肪酶经硫酸铵沉淀和双水相萃取两步纯化的纯化倍
数达到最大，较ＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍｓｐＳＹＢＣＷＵ ３脂肪酶粗酶纯化了２２倍。ＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍｓｐＳＹＢＣＷＵ ３脂肪酶纯酶为低
温碱性脂肪酶，最适反应温度为１５℃，最适ｐＨ为９５，相对分子质量为３５８×１０４。
关键词：双水相；酶学性质；Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍｓｐ；脂肪酶；萃取
中图分类号：ＴＱ９２５＋．６ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－３６７８（２００９）０２－００５７－０６
ＡｑｕｅｏｕｓｔｗｏｐｈａｓｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｌｉｐａｓｅｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍ
ｓｐ．ＳＹＢＣＷＵ３ａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｅｎｚｙｍｅ
ＷＡＮＧＬｅｉ１，２，ＣＡＩＹｕｊｉｅ１，ＬＩＡＯＸｉａｎｇｒｕ１，ＺＨＡＮＧＦｅｎｇ１，ＺＨＡＮＧＤａｂｉｎｇ３
（１．ＳｃｈｏｏｌｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＥｄｕｃａｔｉｏｎａｌＭｉｎｉｓｔｒｙＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＪｉａｎｇｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ；
２．ＳｃｈｏｏｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄＣｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂａｏｔｏｕ０１４０１０，Ｃｈｉｎａ；
３．ＪｉａｎｇＳｕＨａｎｂｏｎＳｃｉｅｎｃｅ＆ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ．Ｌｔｄ，Ｈｕａｉａｎ２２３００１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＡｑｕｅｏｕｓｔｗｏｐｈａｓｅｓｙｓｔｅｍｃｏｍｐｏｓｅｄｏｆＰＥＧ４０００／ＮａＨ２ＰＯ４ｗａｓｅｖａｌｕａｔｅｄｉｎｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆ
Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍｓｐ．ＳＹＢＣＷＵ３ｌｉｐａｓｅ．Ｆａｃｔｏｒｓｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔ，ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＰＥＧ，ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ
ＮａＨ２ＰＯ４，ａｎｄｐＨｏｎｔｈｅｌｉｐａｓｅｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｂｙｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｔｅｓｔｄｅｓｉｇｎｗａｓ
ａｓｆｏｌｏｗｓ：ＰＥＧｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ３０％，ＮａＨ２ＰＯ４ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ２０％，ｐＨ６．Ａｔｔｈｅｓｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅ
ａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍｓｐ．ＳＹＢＣＷＵ３ｌｉｐａｓｅｗａｓ２２ｔｉｍｅｓｏｆｔｈｅｃｒｕｄｅｐｒｏｄｕｃｔ．Ｔｈｅｌｉｐａｓｅｗａｓａｌｏｗ
ａｄａｐｔｅｄａｌｋａｌｉｎｅｌｉｐａｓｅ，ｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｗａｓ１５℃，ｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｐＨｗａｓ９．５，ａｎｄｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｗｅｉｇｈｔｗａｓ３５８×１０４．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ａｑｕｅｏｕｓｔｗｏｐｈａｓｅｓｙｓｔｅｍ；ｅｎｚｙｍｅｐｒｏｐｅｒｔｙ；Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍｓｐ．；ｌｉｐａｓｅ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
脂肪酶（ｌｉｐａｓｅ，ＥＣ３１１３），在甘油酯及水不
溶性酯类的水解、醇解、酯化、酯交换以及合成等反
应不需要辅酶，反应条件温和，副产物少，在油脂加
工业、食品加工与饲料业、精细化工业、医药业、造
纸业、化妆业和生物柴油等领域有着广泛应用［１］。
随着催化反应对纯脂肪酶需求的日益增加，酶制品
的大规模分离纯化成为当前生物工程中的关键技
术问题。
双水相萃取（ＡＴＰＳ）提取蛋白质是近些年来发
展起来的技术，与一些传统的分离方法相比，ＡＴＰＳ
具有条件温和、产品活性损失小、处理量大、分离
步骤少、无有机溶剂残留、设备投资小、操作简单、
易于工程放大和连续操作等优点，非常适合大规
模应用［２－３］。该技术已成功地应用于几十种胞内
酶的提取和精制。在生化工程中，常用的双水相
体系有聚乙二醇／葡聚糖体系和聚乙二醇／磷酸盐
体系，后者由于成本低廉且选择性较高，应用更为
广泛。闫云君等［４］和王俊华等［５］利用双水相萃取
技术对不同来源的脂肪酶进行分离纯化均得到了
理想的结果。
本文对筛选得到的 １株产低温脂肪酶 Ｇｅｏｔｒｉ
ｃｈｕｍｓｐＳＹＢＣＷＵ３在 ＰＥＧ／ＮａＨ２ＰＯ４双水相体系
中对脂肪酶的萃取分离效果进行系统研究，考察影
响脂肪酶萃取的各种因素，并采用正交实验优化实
验条件，以得到最佳萃取体系。此外，还对纯化后
的ＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍｓｐＳＹＢＣＷＵ ３脂肪酶性质进行初
步研究。
１ 材料与方法
１．１ 实验菌种
Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍｓｐ．ＳＹＢＣＷＵ ３为江南大学生物
工程学院工业生物技术教育部重点实验室保藏菌
株，菌种用马铃薯斜面４℃保存，使用前先在种子培
养基中３０℃活化２４ｈ。
１．２ 培养基
马铃薯斜面培养基（ｇ／Ｌ）：马铃薯 ２００，蔗糖
２０，琼脂２０。１１５℃灭菌１５ｍｉｎ。
种子培养基（ｇ／Ｌ）：酵母膏３，葡萄糖１０，麦芽
汁３，蛋白胨５。ｐＨ自然。１１５℃灭菌１５ｍｉｎ。
摇瓶发酵培养基：蛋白胨１００ｇ／Ｌ，酵母膏３０
ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ３０ｇ／Ｌ，橄榄油５０ｍＬ／Ｌ，聚氧乙烯辛基
苯基醚（乳化剂 ＯＰ）５０ｍＬ／Ｌ。自然 ｐＨ。１２１℃灭
菌１５ｍｉｎ。
１．３ 培养方法
种子培养：２５０ｍＬ三角瓶装 ５０ｍＬ种子培养
基，接入斜面菌种一环，３０℃，１８０ｒ／ｍｉｎ旋转式摇
床振荡培养２４ｈ。
产酶培养：２５０ｍＬ三角瓶装５０ｍＬ摇瓶发酵培
养基，接种量为体积分数２％，３０℃，１８０ｒ／ｍｉｎ旋转
式摇床振荡培养７２ｈ。
１．４ 分析方法
１４１ 双水相萃取体系
按质量配制双水相萃取体系，以１０ｇ为萃取体
系总质量，其中酶液为２ｇ。按照比例称取一定量的
ＰＥＧ和（ＮＨ４）２ＳＯ４，质量不足部分以水补足。８０００
ｒ／ｍｉｎ离心，５ｍｉｎ使其充分分相。分别测定上下相
的脂肪酶活力和总蛋白含量以及上下相的体积，按
以下公式计算：
相比（Ｒ）＝上相体积／下相体积；分配系数（Ｋ）＝
上相脂肪酶比活力／下相脂肪酶比活力；萃取率
（Ｓｆ）＝ＲＫ／（１＋ＲＫ）。
１４２ 酶活测定方法
脂肪酶活性的测定以对硝基苯丁酸酯（ｐ
ＮＰＢ）为底物，参考Ｍａｒｇｅｓｉｎ等［６］的测定方法并略作
修改。每 ５ｍＬ测定体系含有 ７２ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ
（ｐＨ９５）缓冲液，０８ｍｍｏｌ／Ｌ对硝基苯丁酸酯。
３０℃保温１５ｍｉｎ后加入１００μＬ酶液，在４０５ｎｍ下
测定吸光值。利用对硝基酚的消光系数１８６００
Ｌ／（ｍｏｌ·ｃｍ）计算对硝基酚的产生量，以１ｍｉｎ内催
化产生１μｍｏｌ的对硝基酚所需的酶量为１个酶活
力单位（Ｕ）。
１４３ 发酵液蛋白含量的测定
发酵液蛋白含量的测定采用 Ｂｒａｄｆｏｒｄ检测
法［７］。在试管中加入０１ｍＬ酶液，以１００μＬ双蒸
水替代相应的酶液作为对照，再加入４ｍＬ００１％考
马斯亮蓝Ｇ２５０溶液，振荡摇匀。５ｍｉｎ后测定５９５
ｎｍ处吸光值。测定工作需在１ｈ内完成。
１４４ ＳＤＳＰＡＧＥ电泳
采用不连续垂直板状电泳系统进行，分离胶质
量分数为１５％，浓缩胶质量分数为５％，电泳缓冲液
ｐＨ为８８。
２ 结果与讨论
２．１ 双水相体系的确定
２．１．１ ＰＥＧ相对分子质量对萃取效应的影响
同一系列聚合物的疏水性随相对分子质量增
８５ 生 物 加 工 过 程 第７卷
加而增加，其大小的选择依赖于萃取过程的目的和
方向。
分别选取相对分子质量为２０００、４０００、６０００、
１００００和２００００的ＰＥＧ，质量分数均为２０％（萃取体
系总质量１０ｇ），按照１４１配制双水相体系，分别
测定Ｋ和Ｓｆ（图１）。由图１可知，随着ＰＥＧ相对分
子质量的增加，萃取率和脂肪酶的分配系数呈现出
先增大后减小的趋势；在 ＰＥＧ相对分子质量为
４０００时萃取率和分配系数均达到最大，因此选用
ＰＥＧ４０００为本实验的萃取剂。
图１ ＰＥＧ相对分子质量对萃取效应的影响
Ｆｉｇ．１ ＥｆｅｃｔｏｆＰＥＧｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｏｎａｑｕｅｏｕｓ
ｔｗｏｐｈａｓｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
２．１．２ 盐对萃取效应的影响
本实验选择 ＰＥＧ／盐体系作为双水相萃取
体系。
在酶的分离纯化中，盐的种类对双水相的形成
影响很大。在分离脂肪酶的双水相体系中，较常用
的盐为Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４。本实验中
由于（ＮＨ４）２ＳＯ４对酶活测定底物的稳定性有影响，
因此选择Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４作为盐相进行实验。
分别选取 Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４，质量分数均为
２０％，按照１４１配制双水相体系，分别测定 Ｋ、Ｓｆ，
结果表明选用ＮａＨ２ＰＯ４时萃取率和分配系数最大，
分别为５６２％和６０２。
２．１．３ ＰＥＧ用量对萃取效应的影响
固定ＮａＨ２ＰＯ４质量分数为２０％，以不同质量分
数的ＰＥＧ４０００为双水相体系测定萃取率和分配系
数（图２）。由图２可知，随 ＰＥＧ用量的增加，萃取
率和脂肪酶的分配系数均先减小后增大。当体系
中ＰＥＧ质量分数大于３０％时，上相黏度过大，影响
萃取操作，导致不能测定体系中的 ＰＥＧ质量大于
３０％后的Ｋ和 Ｓｆ。因此选用体系的 ＰＥＧ质量分数
为２０％进行下面的实验。
图２ ＰＥＧ质量分数对萃取效应的影响
Ｆｉｇ．２ ＥｆｅｃｔｏｆＰＥＧｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎａｑｕｅｏｕｓ
ｔｗｏｐｈａｓｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
２．１．４ ＮａＨ２ＰＯ４用量对萃取效应的影响
固定ＰＥＧ质量分数为２０％，以不同ＮａＨ２ＰＯ４用
量为成相体系，分别测定萃取率和分配系数。随着
ＮａＨ２ＰＯ４用量的增加，萃取率和分配系数均呈现出
先增加后减小的趋势；当实验体系中的 ＮａＨ２ＰＯ４质
量分数为 ２０％时，萃取率和分配系数均达到最大
（图３）。
图３ ＮａＨ２ＰＯ４质量分数对萃取效应的影响
Ｆｉｇ．３ ＥｆｅｃｔｏｆＮａＨ２ＰＯ４ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎａｑｕｅｏｕｓ
ｔｗｏｐｈａｓｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
２．１．５ 体系ｐＨ对萃取效应的影响
体系中ｐＨ对被萃取物的分配有很大影响，这
是由于体系的 ｐＨ变化能明显改变两相的电位差，
如体系ｐＨ与蛋白质的等电点相差越大，蛋白质在
两相中分配越不均匀。调节体系的ｐＨ分别为６、７、
８和９，测定萃取率和分配系数。由图４可知，随着
体系中ｐＨ增加，萃取率和脂肪酶的分配系数均先
增大后减小并在体系 ｐＨ为７时达到最大，因此选
用ｐＨ７为最佳值。
２．１．６ 双水相萃取体系的正交优化
由单因素实验可以确定对双水相萃取萃取效
率影响较大的因素为 ＰＥＧ４０００、ＮａＨ２ＰＯ４以及体系
９５ 第２期 王 蕾等：ＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍｓｐＳＹＢＣＷＵ ３脂肪酶的双水相萃取和酶学性质
图４ ｐＨ对萃取效应的影响
Ｆｉｇ．４ ＥｆｅｃｔｏｆｐＨｏｎａｑｕｅｏｕｓｔｗｏｐｈａｓｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
ｐＨ，并初步确定了其影响水平的范围，进一步对已
确定的因素水平进行正交实验以确定双水相萃取
体系的最优配比。按照表１选取的因素和水平，选
用Ｌ９（３
３）正交表，并按照正交表安排实验，正交实
验结果见表２。由表２可知，Ａ３Ｂ２Ｃ１为最优水平组
合，即双水相萃取体系的 ＰＥＧ质量分数为 ３０％、
ＮａＨ２ＰＯ４质量分数为２０％、体系的ｐＨ为６。由极差
分析比较ＲＡ＞ＲＣ＞ＲＢ可以看出，各项因素对双水
相萃取体系萃取 ＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍｓｐＳＹＢＣＷＵ ３脂肪
酶的主次顺序是 ＡＣＢ。即 ＰＥＧ用量对萃取效率的
影响最大，其次为体系ｐＨ和ＮａＨ２ＰＯ４用量。
表１ 正交因素水平表
Ｔａｂｌｅ１ Ｆａｃｔｏｒｓａｎｄｌｅｖｅｌｓ
水平
因素
Ａ
ｗ（ＰＥＧ）／％
Ｂ
ｗ（ＮａＨ２ＰＯ４）／％
Ｃ
ｐＨ
１ ２０ １７５ ６０
２ ２５ ２００ ７０
３ ３０ ２２５ ８０
表２ 正交实验结果
Ｔａｂｌｅ２ Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｄｅｓｉｇｎｒｅｓｕｌｔ
实验
因素
ｗ
（ＰＥＧ）／
％
ｗ
（ＮａＨ２ＰＯ４）／
％
ｐＨ
分配
系数
Ｋ
萃取率
Ｓｆ／％
１ ２０ １７５ ６ ６３９ ７３４
２ ２０ ２００ ７ ６７６ ７７３
３ ２０ ２２５ ８ ６６８ ７４３
４ ２５ １７５ ８ ６４３ ７７９
５ ２５ ２００ ６ ６５０ ７８４
６ ２５ ２２５ ７ ６８３ ７６５
７ ３０ １７５ ７ ８２８ ８３６
８ ３０ ２００ ８ １０１９ ８４７
９ ３０ ２２５ ６ ７００ ８０７
表３ 误差分析
Ｔａｂｌｅ３ Ｅｒｒｏｒａｎａｌｙｓｉｓ
误差来源 Ａ Ｂ Ｃ
Ｒ １９０３ ０９８０ １０７３
Ｋ１ ６６１０ ７００３ ７８０３
Ｋ２ ６５８７ ７８１７ ６７３０
Ｋ３ ８４９０ ６８３７ ７１５３
２．２ 纯化后 ＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍｓｐＳＹＢＣＷＵ ３脂肪酶
ＳＤＳＰＡＧＥ电泳
对 ＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍｓｐＳＹＢＣＷＵ ３脂肪酶粗酶经
硫酸铵沉淀和双水相萃取两步纯化后较粗酶纯化
了２２倍，对纯化后的酶进行ＳＤＳ ＰＡＧＥ电泳，得到
１条脂肪酶条带，经过迁移率计算，Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ
ｓｐＳＹＢＣＷＵ ３脂肪酶纯酶的相对分子质量为
３５８×１０４，如图５所示。
图５ Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍｓｐ．ＳＹＢＣＷＵ ３脂肪酶纯酶
ＳＤＳＰＡＧＥ电泳
Ｆｉｇ．５ ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍｓｐ．ＳＹＢＣ
ＷＵ３ｌｉｐａｓｅｂｙＳＤＳＰＡＧＥ
本实验相对于其他利用双水相萃取法纯化脂
肪酶的报道［５，８－９］，具有较好的萃取分离效果。此
外，本文的萃取率较报道文献的萃取率稍低可能是
由于ＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍｓｐＳＹＢＣＷＵ ３脂肪酶有两个同
工酶，经过双水相萃取后，只纯化得到了其中一个
同工酶，另一个同工酶并没有被纯化得到。
２．３ 纯化后Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍｓｐ．ＳＹＢＣＷＵ ３脂肪酶
的酶学性质
２３１ 温度对纯化后Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍｓｐ．ＳＹＢＣＷＵ ３
脂肪酶的影响
将酶活测定缓冲液分别在不同温度下保温１５
０６ 生 物 加 工 过 程 第７卷
ｍｉｎ后，测定纯化后的脂肪酶活力，结果见图６。由
图６可知，Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍｓｐ．ＳＹＢＣＷＵ３脂肪酶纯酶在
１５℃时酶活最高，在０℃时仍保有１５℃时酶活的
８０％，当温度高于１５℃之后迅速失活，至４０℃时基
本没有活力。
根据 Ｍａｒｇｅｓｉｎ等［６］的定义，Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．
ＳＹＢＣＷＵ ３脂肪酶纯酶属于低温脂肪酶。
图６ 温度对Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍｓｐ．ＳＹＢＣＷＵ ３脂肪
酶纯酶活力的影响
Ｆｉｇ．６ Ｅｆｅｃｔｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｎｌｉｐａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆ
Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍｓｐ．ＳＹＢＣＷＵ３ｌｉｐａｓｅ
２．３．２ ｐＨ对纯化后 Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍｓｐ．ＳＹＢＣＷＵ ３
脂肪酶的影响
分别在ｐＨ为８０、８５、９０、９５和１００的缓冲
液中测定纯化后脂肪酶的活力，以确定其最适 ｐＨ；
酶活测定结果见图７。由图７可知，纯化后 Ｇｅｏｔｒｉ
ｃｈｕｍｓｐ．ＳＹＢＣＷＵ３脂肪酶为碱性脂肪酶，在 ５０
ｍｍｏｌ／ＬｐＨ７０Ｔｒｉｓ ＨＣｌ缓冲液中以ｐ ＮＰＢ为底
物测定的最适反应 ｐＨ为９５，ｐＨ８０时的酶活仅
为ｐＨ９５时的４０％，ｐＨ１００时仍保有 ｐＨ９５时
７８％的酶活。
图７ ｐＨ对Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍｓｐ．ＳＹＢＣＷＵ ３
脂肪酶纯酶活力的影响
Ｆｉｇ．７ ＥｆｅｃｔｏｆｐＨｏｎｌｉｐａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍ
ｓｐ．ＳＹＢＣＷＵ３ｌｉｐａｓｅ
２．３．３ 温度对Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍｓｐ．ＳＹＢＣＷＵ ３脂肪酶
纯酶稳定性的影响
纯化后Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍｓｐ．ＳＹＢＣＷＵ ３脂肪酶为
低温脂肪酶，在低温环境下比较稳定，在 ｐＨ６０的
ＴｒｉｓＨＣｌ缓冲液中放置于４℃冰箱中２０ｄ，２５℃２ｄ
也有８０％左右的酶活。
将纯化后的酶放置于温度为４０和５０℃的水浴
锅中保温１ｈ，每隔１０ｍｉｎ取样测定酶活，测定结果
如图８所示。由图８可见，纯化后的酶在４０℃环境
中也比较稳定，在 ５０ｍｉｎ后迅速失活至原酶活的
８０％左右；在５０℃的环境中不稳定，１０ｍｉｎ后即失
活４７％，１０～５０ｍｉｎ基本保持稳定，保持５０ｍｉｎ后
迅速失活至原酶活的１０％左右。
图８ 温度对Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍｓｐ．ＳＹＢＣＷＵ３脂肪酶
纯酶稳定性的影响
Ｆｉｇ．８ Ｅｆｅｃｔｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｎｌｉｐａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ
ｏｆＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍｓｐ．ＳＹＢＣＷＵ３
３ 结 论
１）通过双水相体系对Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍｓｐ．ＳＹＢＣＷＵ
３脂肪酶的萃取分离效果的初步研究，选用了ＰＥＧ
４０００／ＮａＨ２ＰＯ４作为成相系统进行了系统的研究，
确定双水相萃取体系为：ＰＥＧ４０００质量分数为
３０％、ＮａＨ２ＰＯ４质量分数为２０％、体系ｐＨ为６，在此
条件下Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍｓｐ．ＳＹＢＣＷＵ ３脂肪酶经硫酸
铵沉淀和双水相萃取两步纯化比粗酶纯化了２２倍；
２）采用硫酸铵沉淀和双水相萃取对 Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ
ｓｐＳＹＢＣＷＵ ３脂肪酶粗酶进行分离纯化，得到了
电泳纯的脂肪酶，经过迁移率计算，相对分子质量
为３５８×１０４；该酶为低温碱性脂肪酶，最适反应温
度为１５℃，最适ｐＨ为９５。
参考文献：
［１］ 谈重芳，王雁萍，陈林海，等．微生物脂肪酶在工业中的应用及
研究进展［Ｊ］．食品工业科技，２００６，２７（７）：１９３１９５．
１６ 第２期 王 蕾等：ＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍｓｐＳＹＢＣＷＵ ３脂肪酶的双水相萃取和酶学性质
ＴａｎＣｈｏｎｇｆａｎｇ，ＷａｎｇＹａｎｐｉｎｇ，ＣｈｅｎＬｉｎｈａｉ，ｅｔａｌ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓｏｎｉｎ
ｄｕｓｔｒｙｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｌｉｐａｓｅ［Ｊ］．ＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＦｏｏｄ
Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，２００６，２７（７）：１９３１９５．
［２］ ＤｉａｍｏｎｄＡＤ，ＨｓｕＪＴ，ｅｔａｌ．Ａｑｕｅｏｕｓｔｗｏｐｈａｓｅｓｙｓｔｅｍｓｆｏｒｂｉｏ
ｍｏｌｅｃｕｌｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＢｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９２，４７：８９１３５．
［３］ ＳｃｈｍｉｄＡＳ，ＶｅｎｔｏｍＡＭ，ＡｓｅｎｊｏＪＡ，ｅｔａｌ．Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇａｎｄｐｕｒ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆαａｍｙｌａｓｅｉｎａｑｕｅｏｕｓｔｗｏｐｈａｓｅｓｙｓｔｅｍｓ［Ｊ］．Ｅｎｚｙｍｅ
ａｎｄＭｉｃｒｏｂｉａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９４，１６：１３１１４２．
［４］ 闫云君，陈晖，杨江科，等．ＡＴＰＳ法分离纯化 Ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓｓｐ．
Ｆ０４４脂肪酶［Ｊ］．华中科技大学学报，２００５，３３（１０）：９２９５．
ＹａｎＹｕｎｊｕｎ，ＣｈｅｎＨｕｉ，ＹａｎｇＪｉａｎｇｋｅ，ｅｔａｌ．Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｐｕｒ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＡｓｐｅｒｇｉｌｕｓｓｐ．Ｆ０４４ｌｉｐａｓｅｂｙａｑｕｅｏｕｓｔｗｏｐｈａｓｅｓｙｓｔｅｍ
［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＨｕａｚｈｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
２００５，３３（１０）：９２９５．
［５］ 王俊华，杨洁，付建红，等．白地霉Ｃｒｙｙｔｏｃｏｃｃｕｓｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ脂肪酶
的双水相萃取［Ｊ］．中国生物工程杂志，２００７，２７（６）：７１７５．
ＷａｎｇＪｕｎｈｕａ，ＹａｎｇＪｉｅ，ＦｕＪｉａｎｈｏｎｇ，ｅｔａｌ．Ｌｉｐａｓｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆ
Ｃｒｙｙｔｏｃｏｒｕｓｎｏｆｏｒｍａｎｓｂｙａｑｕｅｏｕｓｔｗｏｐｈａｓｅｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．Ｃｈｉｎａ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，２７（６）：７１７５．
［６］ ＭａｒｇｅｓｉｎＲ，ＦｅｌｅｒＧ，ＨａｍｍｅｒｌｅＭ，ｅｔａｌ．Ａｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃｍｅｔｈｏｄ
ｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｌｉｐａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｓｏｉｌ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｌｅｔｅｒｓ，２００２，２４：２７３３．
［７］ 汪家政．蛋白质技术手册［Ｋ］．北京：科学技术出版社，２００２．
［８］ 周晓云，傅美景．双水相提取脂肪酶的研究［Ｊ］．浙江农业大学
学报，１９９７，２３（２）：２０５２１０．
ＺｈｏｕＸｉａｏｙｕｎ，ＦｕＭｅｉｊｉｎｇ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｌｉｐａｓｅｂｙａｑｕｅｏｕｓｔｗｏ
ｐｈａｓｅｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＺｈｅｊｉａｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
１９９７，２３（２）：２０５２１０．
［９］ 付建红，石玉湖，欧阳平凯，等．产低温脂肪酶菌株 Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ
ｃａｎｄｉｄｕｍｃｈ３的选育、发酵条件及酶学性质研究［Ｊ］．中国生
物工程杂志，２００７，２７（１０）：２２２７．
ＦｕＪｉａｎｈｏｎｇ，ＳｈｉＹｕｈｕ，ＯｕｙａｎｇＰｉｎｇｋａｉ，ｅｔａｌ．Ｃｏｌｄａｄａｐｔｅｄｌｉ
ｐａｓｅｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍｃａｎｄｉｄｕｍｃｈ３：ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ｆｅｒｍｅｎｔａ
ｔｉｏｎｃｏｄｉｔｉｏｎａｎｄｅｎｚｙｍｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ，２００７，２７（１０）：
櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒
２２２７．
国外动态
Ｐｒｉｍａｆｕｅｌ推出国际藻类生物炼制项目
美国Ｐｒｉｍａｆｕｅｌ公司于２００９年初宣布将开展国际藻类生物炼制项目，通过整合上游的藻类生产和下游
的生物精炼系统，开发创新性的商业化藻类利用技术。该公司的专有过程将有效降低成本，实现藻类利用
经济潜力的最大化，生产出一系列高价值产品和可再生燃料。
Ｐｒｉｍａｆｕｅｌ公司总部位于加州，具有商业化藻类生产系统开发的成功经验。该公司与以色列Ｂｅｎ－Ｇｕｒｉｏｎ
大学微藻实验室签订了独家技术授权协议，同时，公司在美国和欧洲设有多个生物精炼实验室，其生物精炼
研发团队在２００８年世界经济论坛上获得了生物质转化工艺技术领域的技术先锋奖。过去的几年，该团队致
力于生物质分离、纯化和产品转化的研究，研发了多种技术平台，其中 ＳＭＡＡＲＴＴＭ油炼制平台已经成功投
入商业化运作。
新技术有望降低生物燃料成本
最新出版的《生物燃料、生物制品与生物精炼》（Ｂｉｏｆｉｅｌｓ，Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ＆Ｂｉｏｒｅｆｉｎｉｎｇ）报道，德国卡尔斯鲁
厄技术研究所（ＫａｒｌｓｒｕｈｅＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＫＩＴ）的科学家开发出了一种将植物原料直接转化为液体燃
料的新技术，并声称如果正确地建立基础设施，能够将生物燃料成本降低到０５０欧元／Ｌ。
这种被称为“ｂｉｏｌｉｑ”的生物液体燃料技术能够将木材和麦秆等植物原料转化为多种液体燃料和化学品，
包括裂解、气化、纯化和催化等步骤，能够得到甲醇、氢气和合成柴油。该研究所正与德国的鲁奇（Ｌｕｒｇｉ）过
程工程公司共同建造基于ｂｉｏｌｉｑ技术的试验工厂，计划在２０１２年前建成。为了确定合理的生产规模，该研
究所的ＮｉｃｏｌａｕｓＤａｈｍｅｎ小组用一个简单的经济模型计算了产能为１００万ｔ的ｂｉｏｈｑ生产厂的生产成本，最后
认为，如果生物质原料先由各原料产地的热解厂（５０家左右）进行预处理、再运送到１家燃料生产厂中集中
生产生物燃油，就能够大幅节约运输费用。按照这种方式生产出来的生物燃油的成本将会达到０５６～１０４
欧元／Ｌ，略高于传统的汽油和柴油，但二者的差价会在税收优惠之后有所缩小。
（文伟河）
２６ 生 物 加 工 过 程 第７卷