全 文 ：Sep．2008
· 50．
生物加工过程
ChineseJournalofBioproeessEngineering
第6卷第5期
2008年9月
重组毕氏酵母中降解hIFNfl—HSA蛋白酶
的鉴定及其活性控制
宋一丹1，窦文芳1，许泓瑜1，金坚2，陆茂林1’2，许正宏1’3
(1．江南大学 医药学院制药工程实验室，无锡214122；
2．江苏省微生物研究所，无锡214122；
3．江南大学 教育部工业生物技术重点实验室，无锡214122)
摘要：研究了重组毕赤酵母KM71／pPIC9K．IFN口一HSA表达融合蛋白hlFNfl—HSA过程中产物降解的问题。十二烷
基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)和Western-Blotting分析结果表明，发酵液中除了9．0×104的目的融合
蛋白hIFN3-HSA外，同时还出现了6．5×104的降解带。进一步结合HPLC分析证实该降解发生在融合蛋白hWN#-
HSA的HSA区域。在此基础上，采用十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS．PAGE)活性电泳的方法，确定在
融合蛋白hlFN卢·HSA表达的过程中，引起融合蛋白hlFNfl—HSA降解的蛋白酶为蛋白酶B(ProteinaseB，PrB)。最
后，确定了可以抑制融合蛋白hlFN3一HSA降解的最佳的蛋白酶抑制剂EDTA，通过在诱导表达阶段添加不同浓度
的蛋白酶抑制剂EDTA，使融合蛋白的表达量达到22．18m∥mL，与空白对照组相比增加了61％。
关键词：毕赤酵母；蛋白酶；SDS—PAGE：高效液相色谱；人口干扰素．血清白融合蛋白；抑制赉j
中图分类号：Q814．9 文献标志码：A 文章编号：1672—3678(2008)05一0050—05
Definitionandcharacterizationofproteaseoffusionhuman
WNp-HSAexpressedinpichiapastoris
SONGYi—danl，DOUWen—fan91，XUHong．yul，JINJian2，LUMao．1inl’。，XUZheng．hon91，3
(1．LaboratoryofPharmaceuticalEngineering，SchoolofMedicineandPharmaceutics，JiangnanUniversity，Wuxi，214122，ChjrIa；
2．JiangsuInstituteofMicrobiology，Wuxi，214122，China；
3．KeyLaboratoryofIndustrialB otechnology，MinistryofEducation，JiangnanUniversity，Wuxi，214122。China)
Abstract：TheproblemforthexpressionofrecombinanthumanIFNfl-HSAfusionproteininPichiapasto．
risKM71／IHwasthedegradationofthetargetproteinsduringfermentation．TheanalysisbySDS-PAGE
andWestern—blotshowedhat9。0×t04fusionproteinand6．5×104degradationbandappearedinthe
fermentationbroth．ThedegradationppearedintheHSAregionofrecombinanthumanIF№一HSAfusion
proteinwasconfirmedbyHPLCanalysis．Theprot asecausedtheegradationoffusionproteinIFNfl—
HSAwasproteinaseB ndEDTAwasthebestproteaseinhibitor．ByaddingofEDTAintothefermenta—
tionmedium，thequantityofexpressionofthefusionproteinisupto22，18mg／mL，andcreasedby
6l％comparedwiththeblankreference．
Keywords：Pichiapastoris；protease；SDS-PAGE；HPLC；IFN／3一HSA；inhibitor
收稿日期：2008旬1．22
基金硪目：国家863专题计划资助项目(2006AA022153)；教育郜新世纪优秀人才支持计划资助项目(NCET-07-0380)：上海市科学技术
委员会生物医药重大科技攻关资助项目(06DZl9020)
作者简介：宋一丹(1982一)，女，江苏无锡人，硕士研究生，研究方向：微生物与生化药学。
联系人：许正宏，教授，E-mail：zhenghxu@jiangnan．edu．1311
万方数据
2008年9月宋一丹等：重组毕氏酵母中降解hlFNB-HSA蛋白酶的鉴定及其活性控制·51·
人卢干扰素(HumanInterferon卢，hIFNfl)属I
型干扰素，由166个氨基酸残基组成，相对分子质量
为2．2×104—2．3×104，具有抗病毒、抗细胞分裂以
及免疫调节等多种生物学活性⋯。由于口干扰素
体内半衰期仅为8h左右，治疗时需频繁用药。近
年来，利用基因工程手段将hlFNfl与无免疫源性的
人源性大分子蛋白融合表达以延长hlFNfl体内半衰
期的方法日益受到学者和业界的重视口j。前期工
作中，构建了人IFN口与人血清白蛋白融合蛋白
(HumanIFN口一HSAFusionProtein，hlFN／3一HSA)基
因，并在毕赤酵母(PichiapastorisKM71)中表达，获
得了具有良好的HSA和IFNfl的抗原性的融合蛋白
hIFNfl—HSA，表达后的发酵上清液中hIFNfl—HSA的
活性约为640U／mL口J。
毕赤酵母是近十年来发展起来的一种真核表
达体系，具有表达量高、培养成本低、产物可以分泌
到胞外、糖基化程度适中等优点。目前，国内外已
有500多种外源蛋白在毕赤酵母中得到表达。但是
外源蛋白的降解是毕赤酵母表达体系应用过程中
的共性问题¨J，严重影响外源蛋白的积累"J。本文
报道了重组毕赤酵母蛋白酶对hIFNfl．HSA的降解
及其活性控制策略的初步研究结果，为进一步的研
究工作奠定了基础。
1材料与方法
1．1 材料
1．1．1菌株
携带有IFNB．HSA融合基因的重组毕赤酵母
(Pichiapastoris)KM71／pPIC9K—IFNfl—HSA(简称
KM71／IH)由本研究室构建并保存[3j。
1．1．2培养基
种子斜面固体培养基(YPD)(g／L)：葡萄糖
20，蛋白胨20，酵母膏10，琼脂20。
菌体生长培养基(BMGY)：蛋白胨20g／L，酵
母膏10g／L，pH6．0磷酸缓冲液100mmol／L，YNB
13．4g／L，甘油10g／L，生物素0．002s／L。
诱导培养基(BMMY)：蛋白胨20g／L，酵母膏
10g／L，pH6．0磷酸缓冲液100mmol／L，YNB13．4
g／L，甲醇20g／L，生物素0．002s／L。
1．2培养方法
1．2．1重组酵母KM71／IH诱导表达
将重组酵母KM71／IH接种于10mLBMGY中，
30oC，300r／min培养至A600为6，离心收集菌体，加
入3mL诱导培养基BMMY制成菌悬液，相同条件
下继续诱导培养，每隔24h补加一次甲醇，同时取
200IxL发酵样品，离心取上清液，检测诱导后发酵
上清液中融合蛋白的含量。
1．2．2蛋白酶抑制剂的添加旧1
在诱导起始阶段加入不同类型的蛋白酶抑制
剂，使其在发酵液中的终浓度为10mmol／L，诱导表
达96h取样检测蛋白含量。
在诱导起始阶段加入不同浓度的EDTA，使其在发
酵液中的终浓度为100mn_10l／L，10mmol／L，1mmol／L，
0．1mmol／L，诱导表达96h取样检测蛋白含量。
1．3分析方法
1．3．1SDS—PAGE电泳和Western．Blotting杂交¨1
1．3．2超声波破碎细胞岗。
取一定量的发酵液，8000r／min离心5min，收集
菌体。再用等体积的100mmoL／LpH6．0磷酸缓冲液
重悬，进行超声波破碎。破碎条件，10℃，4min，振幅
29kHz。破碎后12000r／rain离心5min，收集上清液。
1．3．3高效液相色谱法(HPLC)一1
样品处理：样品A取发酵液中上清液和质量分
数为20％标准白蛋白溶液以体积比1：10的比例混
合。将混合液30℃温育，不同时间间隔取样，将取
得的样品与10mmol／LEDTA等体积混合，放入
一80℃冰箱备用。样品B取质量分数20％标准白
蛋白溶液直接30℃温育，与样品A同时取样，将取
得的样品与10mmol／LEDTA等体积混合，放人
一80℃冰箱备用。
柱条件：凝胶柱型号为TSKgelSW3000xl(7．5
mm×300mm)，流动相为50mmoL／LpH6．5磷酸缓
冲液(0．3moL／LNaCl)，流速1．0mL／min，波长280
nm紫外检测，上样量为10斗L。标样为20％标准白
蛋白溶液。
1．3．4SDS—PAGE凝胶活性电泳¨0。¨1
制胶：采用质量分数8％的分离胶(质量分数
0．5％HSA为底物)和质量分数5％的浓缩胶，样品处
理：样品10止和10斗L2×上样缓冲液(不含SDS)
37℃温育30min。电泳条件：上样量15IxL，200V恒
压、电泳40min。复性：电泳完成后，将分离胶在缓冲
液A(质量分数2％TritonX．100，50mmol／LTfis．
HCl，pH7．5)中充分洗涤30min，除去SDS，然后置
于缓冲液B(50mmol／LTris—HCl(pH7．5)，1．1g／L
CaCl2，11．7g／LNaCI)中，于37℃下反应16—18h。
万方数据
· 52· 生物加工过程 第6卷第5期
染色脱色：考马斯亮蓝R-250染色液染色1h，脱色液
脱色，直至凝胶中呈现出白色的蛋白酶条带。
1．3．5hlFN／3-HSA的测定
采用微量人白蛋白检测试剂盒(上海名典生物
工程公司产品)检测诱导后发酵上清液中HSA含
量，并依据HSA与hlFN／3按摩尔1：1结合，故根据公
式：c(hI眦Hs^)=c(Hs^)×8．47×104／6．62×104计算
融合蛋白的含量；式中6．62×104为HSA相对分子
质量，8．47X104为hlFN／3一HSA相对分子质量。
2结果与讨论
2．1 融合蛋白hlFN／3．HSA的诱导表达过程分析
采用SDS-PAGE分析丫融合蛋白hlFN／3一HSA
在菌株KM71／IH中的表达情况，结果如图1所示，
诱导表达12h后，发酵上清液中就可以在9．0X104
处检测到融合蛋白的目的条带。随着时间的延长，
融合蛋白的表达量逐渐增加，与此同时，发酵48h
后，可以观察到降解条带，并且随着诱导时间的延
长，降解条带的量亦逐渐增加。取96h时的诱导培
养上清液进行了Western．Blotting实验(图2)。实验
结果显示，图1中9．00X104和6．50×104左右的条
带均有良好的HSA免疫原性，进一步证实了hlFN／3一
HSA的确发生了降解。
M一低相对分子质量蛋白质标准；1—7一12h，24h
36h，48h，72h，84h，96h
图1 诱导不同时间上清液的SDS-PAGE分析
Fig．1Timecourseanalysisofculturesupernantafter
methanolinductionbySDS—PAGE
M一低相对分子质量蛋白质标准；1一诱导培养后上清液试样
图2表达产物hlFN／3一HSA的Western-Blotting鉴定
随2 Westernblatingta alysisofthefusionproteinhIrq邯-HSA
2．2发酵上清液对白蛋白的降解过程分析
将诱导表达96h后的发酵上清液与标准白蛋
白溶液混合，以未与发酵上清液混合的标准白蛋白
溶液作为对照，利用HPLC检测不同的时间白蛋白
的量的变化，结果如图3所示。由图3可以看出，标
准白蛋白直接经过120min温育，含量几乎没有变
化。而标准白蛋白与发酵上清液液混合液经过120
min的温育，混合体系中的白蛋白量下降了50％。
这充分说明了发酵上清液中存在能够降解白蛋白
的蛋白酶。文献[9]利用毕赤酵母表达重组人血清
白蛋白时也观察到了类似的现象，这也与2．1中
Western．Blotting的结果相符合。
图3 HPLC检测白蛋白含量分析
Fig．3AnalysisofHSAbyHPLC
2．3发酵液中蛋白酶的分析
为r证实发酵上液清中存在的某种蛋白酶是引
起HSA降解的主要原因，采用以HSA为底物的SDS—
PAGE活性电泳分析不同诱导时间的发酵上清液中
蛋白酶酶量的变化情况(图4)。结果表明，引起HSA
降解的蛋白酶，随着诱导时间的延长，存在于发酵上
清液中该蛋白酶的酶量逐渐增多。72h时该蛋白酶
的酶量达到最大。这与72h以后融合蛋白降解增加
的现象相一致，与文献[9]的报道也是一致的。
M一低相对分子质量蛋白质标准；1—4—24h、
48h，72h，96h诱导发酵液的试样
图4 HSA-SDS-PAGE活性电泳酶谱分析
Fig．4ProteasenalyzedbyHSA-SDS—PAGE
万方数据
2008年9月宋～丹等：重组毕氏酵母中降解hIFNfl—HSA蛋白酶的鉴定及其活性控制·53·
进一步通过透明条带迁移率与低相对分子质
量蛋白质标准的迁移率进行分析比较后，得到这个
蛋白酶的相对分子质量约为3．20×104。通过文献
[7，9]比对，初步确定这种蛋白酶是毕赤酵母蛋白
酶B(ProteinaseB，PrB)。
2．4蛋白酶抑制剂对融合蛋白hIFNfl—HSA表达的
影响
进一步考察了不同的蛋白酶抑制剂对诱导过
程中融合蛋白表达的影响(表1)，从表1可以看出，
EDTA的添加可以有效的控制融合蛋白的降解，据
报道⋯，EDTA可以有效的抑制蛋白酶B的活性。
这也从另一个方面证明降解融合蛋白hIFN卢一HSA
的蛋白酶是PrB。进一步考察了添加不同终浓度的
EDTA对融合蛋白表达的影响(表2)。终浓度为10
mmolfLEDA添加后，抑制降解的效果比较明显。
融合蛋白在发酵上清液中的含量达到
22．18ms／mL，与不添加任何蛋白酶抑制剂相比，融
合蛋白的表达量提高了6l％。
表1 不同蛋白酶抑制剂对融合蛋白表达的影晌
TableEffectsofthefusionproteinxpressionwith
additiontodifferentpro easeinhibitors
表2添加EDTA对融合蛋白表达的影响
Table2 Effectsofhefusionproteinxpression
withadditiontoEDTA
C(EDTA)／(tool·L一)
对照
0．1
1．O
10．0
100．O
13．87
14．72
14．45
22．18
18。45
3结论
毕赤酵母表达外源蛋白时，外源蛋白的降解是
一个普遍存在的问题，构建一株融合蛋白hIN即-
HSA的毕赤酵母表达菌株，表达融合蛋白时亦发生
比较明显的降解现象，进而影响了融合蛋白hlN耶一
HSA的高效表达。
本工作是在前期研究工作的基础上，首先通
过SDS—PAGE和West—Blotting确定融合蛋白
hIFNfl—HSA在诱导表达过程中易发生降解，降解
的主要条带出现在6．50X104，而且还通过HPLC
证实了发酵液中蛋白酶对融合蛋白的降解主要发
生在HSA区域。在此基础上，通过蛋白酶SDS-
PAGE凝胶活性电泳以HSA为唯一底物的蛋白酶
活性电泳中，确定一种蛋白酶的存在是引起融合
蛋白hIFNfl—HSA降解的主要原因，以电泳图谱得
到的蛋白酶的相对分子质量，与相关文献[7—9]
和NCBI数据库对比，初步确定该酶为蛋白酶B
(ProteinaseB，PrB)。最后，确定了可以抑制融合
蛋白hIFNfl—HSA降解的最佳的蛋白酶抑制剂ED·
TA，通过在诱导表达阶段添加不同浓度的蛋白酶
抑制剂EDTA，使融合蛋白的表达量达到22．18
mg／mL，与空白对照组相比增加了6l％。目前，实
验室正在通过分子生物学的方法，将宿主细胞中
PrB基因敲除，使宿主细胞不表达PrB，从而减少
对融合蛋白hIFNfl．HSA降解的工作。
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设的10万t生物柴油项目是从日本引进，具有国际先进水平的工艺、设备，利用大豆毛油、油脚料等原料生
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(朱宏阳)
万方数据