全 文 ：第 １２卷第 ６期
２０１４年 １１月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １２ Ｎｏ􀆰 ６
Ｎｏｖ􀆰 ２０１４
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１４􀆰 ０６􀆰 ００３
收稿日期：２０１３－０７－１９
基金项目：国家高技术研究发展计划（８６３计划）（２０１２ＡＡ０２１７０４）；国家科技支撑计划（２０１１ＢＡＤ２３Ｂ０３）；江苏省自然科学基金（ＢＫ２０１２４２４）
作者简介：胡学超（１９８３—），男，湖北荆州人，硕士研究生，研究方向：化学工程；任路静（联系人），讲师，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｒｅｎｌｕｊｉｎｇ＠ ｎｊｔｅｃｈ􀆰 ｅｄｕ􀆰 ｃｎ
菌种保藏方法对裂殖壶菌生长及发酵性能的影响
胡学超，张　 丽，任路静，纪晓俊，黄　 和
（南京工业大学 生物与制药工程学院，南京 ２１１８００）
摘　 要：考察保护剂、保藏温度及预冷冻方法对 Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ􀆰 ＨＸ ３０８菌种存活率及发酵性能保持的影响。 结
果显示：在－８０ ℃低温保藏 ６个月后，渗透性保护剂的细胞存活率均比非渗透性保护剂高了 ５％，其中用 ６０％（质量
分数）海藻糖的保护剂最终的株细胞存活率达到 ８０􀆰 ０２％，明显优于其他保护剂。 采用液氮－１９６ ℃保藏菌种（两步
预冷冻法、６０％海藻糖保护剂），存储 ６个月后存活率高达 ９０􀆰 ７０％，生物量、油产量和二十二碳六烯酸（ＤＨＡ）产量
分别达到了 ６１􀆰 ６５、２６􀆰 ４１和 １１􀆰 １０ ｇ ／ Ｌ，为最优的保藏方法，为裂殖壶菌的实验室研究及工业化生产提供了一种长
期安全的保藏法。
关键词：裂殖壶菌；ＤＨＡ；菌种保藏；保护剂
中图分类号：Ｑ８１５　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１４）０６－００１３－０５
Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔｒａｉｎ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ􀆰
ＨＵ Ｘｕｅｃｈａｏ，ＺＨＡＮＧ Ｌｉ，ＲＥＮ Ｌｕｊｉｎｇ，ＪＩ Ｘｉａｏｊｕｎ，ＨＵＡＮＧ Ｈｅ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔｓ，ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｒｅ⁃ｆｒｅｅｚｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｎ
ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎｄ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ􀆰 ＨＸ⁃３０８ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ􀆰 Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ ｗｈｅｎ ｕｓｉｎｇ ｐｅｒｍｅａｂｌｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ ｗａｓ ５％ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ
ｔｈａｔ ｏｆ ｕｎｐｅｒｍｅａｂｌｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ ａｆｔｅｒ ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ６ ｍｏｎｔｈｓ ａｔ －８０ ℃ ． Ｈｉｇｈｅｓｔ ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ ｏｆ
８０􀆰 ０２％ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗｈｅｎ ｕｓｉｎｇ ６０％ ｔｒｅｈａｌｏｓｅ． Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ，ｆｕｒｔｈｅｒ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆ ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ ｕｐ ｔｏ
９０􀆰 ７０％ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗｈｅｎ ｕｓｉｎｇ ａ ｔｗｏ⁃ｓｔｅｐ ｐｒｅ⁃ｆｒｅｅｚｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ６０％ ｔｒｅｈａｌｏｓｅ ａｓ ｔｈｅ ｃｒｙｏｐｒｅｔｅｃｔａｎｔ
ａｆｔｅｒ ６ ｍｏｎｔｈｓ ａｔ －１９６ ℃􀆰 Ｃｅｌｌ ｄｒｙ ｗｅｉｇｈｔ，ｌｉｐｉｄ ｙｉｅｌｄ ａｎｄ ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ（ＤＨＡ） ｃｏｎｔｅｎｔ ｒｅａｃｈｅｄ
６１􀆰 ６５ ｇ ／ Ｌ，２６􀆰 ４１ ｇ ／ Ｌ ａｎｄ １１􀆰 １０ ｇ ／ Ｌ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ􀆰 Ｔｈｉｓ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｐｒｏｖｅｄ ｔｏ ｂｅ ｔｈｅ ｂｅｓｔ
ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ａｓ ａ ｌｏｎｇ ｐｅｒｉｏｄ ａｎｄ ｓａｆｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ􀆰
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ􀆰 ；ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ；ｓｔｒａｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ；ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔｓ
　 　 二十二碳六烯酸（Ｃ２２：６，ＤＨＡ）是一种重要的
ω ３型长链多不饱和脂肪酸，在促进脑细胞生长发
育、提高视力以及预防心脑血管疾病等方面具有显
著功效［１ ２］，被科学家誉为“脑黄金”。 迄今为止，
ＤＨＡ生产菌主要为破囊壶菌、裂殖壶菌等海生真菌
和海生异养微藻。 其中，裂殖壶菌（ Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ
ｓｐ􀆰 ）属于真菌门（Ｅｕｍｙｃｏａｔ）、卵菌纲（Ｏｏｍｙｃｅｔｅｓ）、
破囊壶菌科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｃｅａｅ），其具有生长速度
快、易于培养、细胞内脂肪酸和 ＤＨＡ含量高等优势，
已被证实为理想的 ＤＨＡ生产菌株［３］。
菌种保藏是微生物研究中的一项基础工作，对
于微生物发酵的科研和生产，菌种具有优良的发酵
性能是至关重要的。 目前，微生物培养过程中避免
不了频繁的连续传代，有些特殊的菌种更需要间断
性的活化培养来维持其细胞生物活性。 但这种频
繁的接种，不仅会增加菌种被污染的可能性，而且
大大提高菌种基因突变［４］。 因此，选择一种较持久
并能最大限度保持细胞特性，并降低甚至阻断这种
遗传漂变的保藏方法显得尤为重要。 现在微生物
保藏的方法主要有传代法、干燥法、冷冻法及冷冻
干燥法，其中后两者是应用最广也是最长期安全的
方法。 Ｓａｍｕｅｌｅ等［５］探究了白腐真菌低温甘油管保
藏、低压冷冻保藏和液氮保藏法 ３ 种保藏法对菌种
性能的影响，结果证明前两者的保藏方法更适合白
腐真菌的保藏。 马学斌等［６］探讨了不同保藏方法
对海洋细菌的长期保存效果，结果发现 １０％脱脂乳
和 ３５％甘油肉汤对海洋细菌的长期保存效果较好。
本文将主要从保藏温度、保护剂类型和预冷冻
方法 ３ 个方面，详细探讨不同的冷冻保藏方法对
Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ􀆰 ＨＸ ３０８ 存活率和发酵参数的影
响，并从理论上解释这些因素对细胞保藏过程中的
作用， 为 寻 求 一 种 最 佳 的 保 藏 方 法 以 减 缓
Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ􀆰 ＨＸ ３０８ 菌种的退化速度提供
指导。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 菌种
裂殖壶菌 Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ􀆰 ＨＸ ３０８，笔者所在
实验室自主筛选获得，保藏在中国典型培养物保藏
中心（保藏号 ＣＣＴＣＣ Ｍ ２０９０５９）。
１􀆰 ２　 培养基
种子培养基（ ｇ ／ Ｌ）：ＮａＣｌ １５、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２ Ｏ ５、
ＫＣｌ ２、ＣａＣｌ２１、ＮａＨＣＯ３ ０􀆰 ５、ＫＨ２ＰＯ４ ４、酵母膏 ２、谷
氨酸钠 １０、葡萄糖 ４０。
发酵培养基（ｇ ／ Ｌ）：Ｎａ２ＳＯ４ １５、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ５、
ＫＣｌ ２、（ＮＨ４） ２ＳＯ４ ２、ＫＨ２ＰＯ４ ４、酵母膏 ２、谷氨酸钠
１０、葡萄糖 １００。
以上培养基都在 １２１ ℃、３０ ｍｉｎ条件下灭菌，并
以体积分数为 ０􀆰 ２％的量向培养基中分别添加质量
浓度为 ５０、５０和 ０􀆰 ２５ ｍｇ ／ ｍＬ的维生素 Ｂ１、Ｂ６和 Ｂ１２
母液，终质量浓度分别为 ０􀆰 １、０􀆰 １ ｍｇ ／ ｍＬ 和 ０􀆰 ５
μｇ ／ ｍＬ。
１􀆰 ３　 培养方法
种子和发酵培养方法参照文献［７］。
１）不同保护剂的考察 　 将活化好的菌株与配
制好的不同保护剂按体积比 １ ∶ １的比例加入到菌株
保藏管中，混匀后置于－８０ ℃超低温冰箱中保藏。
２）不同保藏温度的考察 　 将活化好的菌株与
４０％甘油保护剂按 １ ∶ １的比例加入到菌株保藏管
中，混匀后置于－８０ ℃超低温冰箱和－１９６ ℃液氮中
保藏。
３）－１９６ ℃液氮保藏法的优化　 将活化好的菌
株与保护剂按 １ ∶ １的比例加入到菌株保藏管中混
匀。 一组直接置于－１９６ ℃液氮中保藏；另一组先于
４ ℃冰箱中存放 ３０ ｍｉｎ，再将保藏管放入－８０ ℃冰
箱中存放 １２ ｈ，最后将冻存管投入－１９６ ℃液氮中
保藏。
１􀆰 ４　 分析方法
发酵液中葡萄糖和谷氨酸钠浓度采用 ＳＢＡ
４０Ｃ型生物传感仪（山东省科学院生物研究所）进
行分析检测。 细胞干质量的测定和油脂提取方法
参照文献［８］；脂肪酸甲酯制备及气相色谱分析方
法参照文献［９］。
细胞存活率测定参照文献［５］，采用台盼蓝染
色法进行。 具体方法为吸取 ５０ μＬ 细胞悬液到 ＥＰ
管内，加入台盼蓝染色液 ５０ μＬ，轻轻吹打混匀，３～５
ｍｉｎ（染色时间不宜过长）后用血细胞计数板计数。
细胞存活率 ＝ （细胞总数－蓝色细胞数） ／细胞
总数×１００％。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 －８０ ℃超低温保藏下保护剂对 Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ
ｓｐ􀆰 ＨＸ ３０８菌种存活率的影响
　 　 在菌种保藏过程中，冷冻保护剂起到保护细胞
免受冷冻损伤的重要作用。 它可以改变细胞周围
的物理、化学环境，减少不必要的力学损伤，从而最
大限度地保持细胞的生理和生物活性［１０］。 冷冻保
护剂按其对细胞作用的部位，可以分为渗透性保护
剂和非渗透性保护剂。 渗透性保护剂一般都是一
些小分子物质，如甘油、二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）、单糖、
二糖和氨基酸等，它们可以渗透到细胞内部；非渗
４１ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
透性保护剂一般是一些大分子物质，如蛋白质、多
聚糖和聚乙二醇等，它们不能渗透到细胞内部，只
能作用于细胞表面［１１］。
根据 Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ􀆰 ＨＸ ３０８ 菌种的细胞特
性，笔者选取了这两类保护剂中几种代表性的保护
剂，探讨这些保护剂及其不同浓度对菌种的影响，
结果见表 １。 由表 １可以看出：保藏 １ 个月后，渗透
性保护剂和非渗透性保护剂的菌种平均存活率分
别为 ９２􀆰 ４８％和 ８９􀆰 ６９％；保藏 ６个月后，渗透性保护
剂的菌种平均存活率在 ７５％，而非渗透性保护剂的
菌种平均存活率仅为 ７０％，而且前者的存活率下降
速率比后者高了 ２􀆰 ０２％。 由此可以发现，在－８０ ℃
超低温保藏下，渗透性保护剂的保持效果较优于非
渗透性保护剂。 这主要是因为，渗透性保护剂含有
较多的羟基，不仅能与细胞表面的自由基结合，形
成保护层，还能渗透到细胞内部结合自由水，减少
了冰晶形成，从而对细胞内部起到保护作用，降低
了力学损伤对细胞造成的破坏［１２］。
在 ２种渗透性保护剂中，４０％（体积分数）甘油
和 ６０％（质量分数）海藻糖的保藏效果为较佳。 ６个
月后菌种存活率最高，分别为 ７５􀆰 ２６％和 ８０􀆰 ０２％；
存活率下降比率也最慢， 分别仅为 ４􀆰 １２％ 和
３􀆰 ３３％。 在 ２ 种非渗透性保护剂中，３０％（体积分
数）聚乙二醇 ２０ ０００ 的保藏效果较佳，６ 个月后菌
种存活率和存活率下降比率分别为 ７２􀆰 ２３％和
４􀆰 ６３％。 综合以上结果发现，６０％海藻糖的保藏效
果最佳。 这主要是因为，海藻糖属于半渗透性保护
剂，只能渗透到细胞壁，胞内的水形成部分冰晶，使
保护剂的局部浓度增大，从而提高了保护剂玻璃化
的温度，这样保藏环境就较容易达到玻璃化状态，
而玻璃化状态是最稳定的状态，能很好地保护细
胞，保持其生理生化活性［１３］。
表 １　 保护剂对 Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ􀆰 ＨＸ ３０８存活率的影响
Ｔａｂｌｅ １　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｃｔａｎｔｓ ｏｎ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ ｏｆ Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ􀆰 ＨＸ⁃３０８
保护剂类型 保护剂组
存活率 ／ ％
１个月 ３个月 ６个月
存活率下降
比率 ／ ％
渗透性保护剂
２０％甘油 ９１􀆰 ２３±０􀆰 ９３ ８１􀆰 ７５±０􀆰 ９９ ７２􀆰 ４９±１􀆰 ２４ ４􀆰 ５９±１􀆰 ０２
４０％甘油 ９２􀆰 ９５±２􀆰 ０１ ８３􀆰 ３５±１􀆰 ４６ ７５􀆰 ２６±１􀆰 ２５ ４􀆰 １２±１􀆰 ３９
６０％甘油 ８９􀆰 ９２±０􀆰 ８５ ８０􀆰 １５±１􀆰 ０５ ７０􀆰 ９４±０􀆰 ９３ ４􀆰 ８４±０􀆰 ８２
２０％海藻糖 ９２􀆰 ４８±１􀆰 ７８ ８４􀆰 ３６±１􀆰 ０８ ７２􀆰 ４５±１􀆰 １２ ３􀆰 ３４±１􀆰 １０
４０％海藻糖 ９２􀆰 ８１±０􀆰 ８９ ８４􀆰 ２７±１􀆰 ２８ ７４􀆰 ８２±１􀆰 ２２ ４􀆰 ２０±０􀆰 ８９
６０％海藻糖 ９５􀆰 ４８±１􀆰 ８３ ９０􀆰 ３６±１􀆰 ４５ ８０􀆰 ０２±１􀆰 １１ ３􀆰 ３３±１􀆰 ３１
非渗透性保护剂
２０％聚乙二醇 ６０００ ８９􀆰 ４５±１􀆰 ３７ ７２􀆰 ７３±１􀆰 ０５ ６７􀆰 ２９±０􀆰 ９３ ５􀆰 ４５±０􀆰 ９９
３０％聚乙二醇 ６０００ ８７􀆰 ５８±１􀆰 ３３ ７６􀆰 ２４±０􀆰 ７９ ６８􀆰 ２±１􀆰 ０７ ５􀆰 ３０±０􀆰 ８４
２０％聚乙二醇 ２００００ ９０􀆰 １４±１􀆰 ３６ ８１􀆰 ３９±１􀆰 ３１ ７０􀆰 ３５±１􀆰 １７ ４􀆰 ９４±１􀆰 ２７
３０％聚乙二醇 ２００００ ９１􀆰 ５７±０􀆰 ７９ ８０􀆰 ２５±０􀆰 ７１ ７２􀆰 ２３±０􀆰 ９８ ４􀆰 ６３±０􀆰 ８１
２􀆰 ２　 保藏温度对 Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ􀆰 ＨＸ ３０８ 菌种
性能的影响
　 　 细胞保藏在某些低温环境下，其细胞内的生化
反应可被减缓甚至停止，从而能长期保持其活性，
但在复苏后仍能恢复其正常生理功能。 笔者选取
了低温为－２０ ℃、－８０ ℃和液氮－１９６ ℃，探讨保藏 ６
个月后，菌种存活率及发酵性能的差异，结果见表
２。 由表 ２ 可以看出：保藏 ６ 个月后，－８０ ℃保藏的
菌种的存活率最高达到 ７５􀆰 ２６％，同时相应的存活
率下降比率也最低为 ４􀆰 １２％。 可是，笔者也发现一
个不寻常的现象，液氮－１９６ ℃保藏的菌种，在这 ６
个月的保藏中，存活率呈直线下降趋势，到 ６ 个月
后，菌种基本全部死亡。
不同保藏温度对 Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ􀆰 ＨＸ ３０８ 菌
种发酵性能的影响如图 １ 所示。 由图 １ 可知：保藏
６个月后，－８０ ℃保藏的菌种的发酵生物量、ＤＨＡ产
量稍高于－２０ ℃，分别达到了 ５０􀆰 ９１ 和 １０􀆰 ７０ ｇ ／ Ｌ。
同样也发现，液氮－１９６ ℃保藏的菌种在 ６ 个月后，
菌种的基本发酵性能也基本退化，无法进行发酵
生产。
王华等［１４］研究发现，液氮－１９６ ℃保藏是目前
微生物保藏中公认的最安全、最有效的长期保藏方
法。 但在本试验中，液氮－１９６ ℃保藏菌种基本都死
亡了，有悖于常理。 这可能是因为，在液氮－１９６ ℃
５１　 第 ６期 胡学超等：菌种保藏方法对裂殖壶菌生长及发酵性能的影响
保藏的处理方法是将菌种和保护剂直接投入液氮
中保藏，这将使细胞瞬间处于一个极低的环境，并
且这种冷冻速率随机性大、不稳定，这就一方面导
致胞外的水分大量结冰，胞内水分外渗，细胞皱缩
变形；另一方面，导致细胞内的自由水瞬间形成大
量的冰晶，这些冰晶极大地破坏了细胞内的超微结
构。 结合这两方面的原因，导致了对细胞形成了致
命性的力学损伤［１５－１７］。
表 ２　 保藏温度对 Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ􀆰 ＨＸ ３０８菌种存活率的影响
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ ｏｆ Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ􀆰 ＨＸ⁃３０８
保藏温度 ／ ℃
存活率 ／ ％
１个月 ３个月 ６个月
存活率下降比率 ／ ％
－２０ ８１􀆰 ３５ ± １􀆰 ３１ ６５􀆰 ４８ ± １􀆰 ０３ ４５􀆰 ８２ ± ０􀆰 ９６ ９􀆰 ０３ ± １􀆰 ０８
－８０ ９２􀆰 ９５ ± ２􀆰 ０１ ８３􀆰 ３５ ± １􀆰 ４６ ７５􀆰 ２６ ± １􀆰 ２５ ４􀆰 １２ ± １􀆰 ３１
－１９６ ５８􀆰 １２ ± ０􀆰 ８７ ２５􀆰 ２ ± １􀆰 ０４ ０ ± ０ １００ ± １􀆰 ０６
图 １　 保藏温度对 Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ􀆰 ＨＸ ３０８
菌种发酵性能的影响
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
ｏｎ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ
Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ􀆰 ＨＸ ３０８
２􀆰 ３　 液氮－１９６ ℃保藏法的优化研究
基于 ２􀆰 ２中液氮－１９６ ℃保藏法菌种全部死亡
的现象，因此有必要对液氮保藏进行优化。 一方
面，采用分步预冷冻法：先将装有按一定比例混合
的菌种和保护剂的保藏管置于 ４ ℃预冷冻 ３０ ｍｉｎ，
再将保藏管置于－８０ ℃预冷冻 １２ ｈ，最后将保藏管
投入液氮－１９６ ℃中长期保藏。 另一方面，优化保护
剂：根据 ２􀆰 １中的结果，分别选取保藏效果较佳的一
个渗透性保护剂海藻糖和非渗透性保护剂
ＰＥＧ２００００以及两者混合的混合保护剂。
６ 个月后，菌种存活率及发酵性能结果如图 ２
所示。 由图 ２可知：采用两步预冷冻法后，菌种的存
活率明显提高，６ 个月后存活率基本上都在 ７５％以
上，其中 ６０％海藻糖保藏的菌种存活率最高，达到
了 ９０􀆰 ７０％，平均比其余 ３种保护剂高了 １３􀆰 ０６％，其
平均存活率下降比率也最低，仅为 １􀆰 ６７％；同时
６０％海藻糖的菌种的最终发酵指标生物量、油产量
和 ＤＨＡ 含量较其他保护剂也稍高，分别为 ６１􀆰 ６５、
２６􀆰 ４１和 １１􀆰 １０ ｇ ／ Ｌ。 因此，在液氮－１９６ ℃中，采用
６０％海藻糖作为保护剂的两步预冷冻法，保藏效果
较好，为裂殖壶菌的实验室研究及工业化生产提供
了一种长期安全的保藏法。
图 ２　 保护剂对 Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ􀆰 ＨＸ ３０８
菌种存活率及发酵性能的影响
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｃｔａｎｔｓ ｏｎ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ
ａｎｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ
Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ􀆰 ＨＸ⁃３０８
３　 结　 论
考察了不同保护剂、不同保藏温度及不同预冷
冻方法对 Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ􀆰 ＨＸ ３０８ 菌种存活率及
发酵性能保持的影响。 在－８０ ℃低温保藏下，不同
保护剂对 Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ􀆰 ＨＸ ３０８ 菌种保藏效果
存在着明显的差异。 渗透性保护剂的细胞存活率
比非渗透性保护剂高 ５％，其中 ６０％海藻糖最终的
６１ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
菌种存活率达到了 ８０􀆰 ０２％，明显优于其他保护剂。
采用 ６０％海藻糖为保护剂，结合两步预冷冻法，菌
种在液氮－１９６ ℃环境下保藏 ６ 个月后存活率可达
到 ９０􀆰 ７０％，生物量、油产量和 ＤＨＡ 产量无明显改
变，分别达到了 ６１􀆰 ６５、２６􀆰 ４１和 １１􀆰 １０ ｇ ／ Ｌ。 本文提
出一种适于裂殖壶菌的－１９６ ℃液氮保藏法，为长期
保藏 Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ􀆰 菌种并降低其优良发酵性能
的退化提供了技术指导。
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（责任编辑　 荀志金）
７１　 第 ６期 胡学超等：菌种保藏方法对裂殖壶菌生长及发酵性能的影响