全 文 ：第９卷第３期
２０１１年５月
生　物　加　工　过　程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．９Ｎｏ．３
Ｍａｙ２０１１
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２－３６７８．２０１１．０３．００６
收稿日期：２０１０－１２－０２
基金项目：国家自然科学基金重点资助项目（２０９３６００２）；国家自然科学基金资助项目（２０８７６０７８）；国家科技支撑计划资助项目
（２０１１ＢＡＤ２３Ｂ０３）
作者简介：吕　浩（１９７０—），男，江苏南京人，硕士，高级工程师，研究方向：生物分离工程、酶工程，Ｅｍａｉｌ：ｓａｎｖａｎｇｏ＠ｎｊｕｔ．ｅｄｕ．ｃｎ
酶法破碎裂殖壶菌提取胞内油脂
吕　浩１，崔丁维１，胡学超２，张红漫３
（１．南京工业大学 生物与制药工程学院，南京 ２１０００９；２．江苏省工业生物技术创新中心，南京 ２１１８１６；
３．南京工业大学 理学院，南京 ２１０００９）
摘　要：采用酶法破碎裂殖壶菌提取胞内油脂，进行单因素实验和正交实验优化酶解反应条件，酶解反应的影响
因素主次顺序依次为酶用量、温度、时间、ｐＨ，最佳酶解工艺参数：５５℃、ｐＨ９５、搅拌反应２５ｈ、酶用量为菌体生
物量的２％。在该条件下，胞内油脂的提取量高达（８１５３±０３３）ｇ／Ｌ，过氧化值仅为０１５，酸价为０２４。
关键词：裂殖壶菌；酶法；水解；提油量
中图分类号：ＴＱ６４１　　　　文献标志码：Ａ　　　　文章编号：１６７２－３６７８（２０１１）０３－００２７－０４
ＥｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｏｉｌｆｒｏｍＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍｓｐｂｙｅｎｚｙｍａｔｉｃｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ
ＬＨａｏ１，ＣＵＩＤｉｎｇｗｅｉ１，ＨＵＸｕｅｃｈａｏ２，ＺＨＡＮＧＨｏｎｇｍａｎ３
（１．ＣｏｌｅｇｅｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＮａｎｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１０００９，Ｃｈｉｎａ；
２．ＪｉａｎｇｓｕＰｒｏｖｉｎｃａｌＩｎｎｏｖａｔｉｏｎＣｅｎｔｅｒｆｏｒＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１１８１６，Ｃｈｉｎａ；
３．ＣｏｌｅｇｅｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＮａｎｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１０００９，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｏｉｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｏｆＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍｓｐ．ｗａｓｏｐｔｉｍｉｚｅｄｂｙｅｎｚｙｍａｔｉｃｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ．Ｂｙｓｉｎ
ｇｌｅｆａｃｔｏｒａｎｄｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｔｅｓｔｓ，ｔｈｅｐｒｉｏｒｉｔｙｏｒｄｅｒｓｏｆｔｈｅｆａｃｔｏｒｓｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇｔｈｅｅｎｚｙｍａｔｉｃｈｙ
ｄｒｏｌｙｓｉｓｗｅｒｅｅｎｚｙｍｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｔｉｍｅ，ａｎｄｐＨ．Ｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ
ｔｉｍｅ２５ｈ，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ５５℃，ｐＨ９５，ａｎｄａｄｄｉｎｇ２％ ｏｆｅｎｚｙｍｅ．Ｔｈｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｒｅｓｕｌｔｅｄｉｎｔｈｅｏｉｌ
ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｙｉｅｌｄｕｐｔｏ（８１５３±０３３）ｇ／Ｌ，ｐｅｒｏｘｉｄｅｖａｌｕｅａｎｄａｃｉｄｖａｌｕｅｗｅｒｅ０１５ａｎｄ０２４，ｒｅｓｐｅｃ
ｔｉｖｅｌｙ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍｓｐ．；ｅｎｚｙｍａｔｉｃ；ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ；ｏｉｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｙｉｅｌｄ
　　裂殖壶菌是一种极具商业价值的海洋微生物，
该菌体干质量的７０％以上为脂肪酸，其中的二十二
碳六烯酸（ＤＨＡ）比例约为３０％ ～４０％，且９０％以
上的脂肪酸为甘油三酯形式的中性脂［１］。目前，
ＤＨＡ油脂的商业来源主要是深海鱼油，但其往往会
受到季节和环境等的限制而供不应求。然而，来源
于裂殖壶菌的ＤＨＡ油脂不仅能避免以上缺陷，而且
品质更胜一筹，因此受到越来越广泛的关注和
研究［２－４］。
马建设等［５］比较了有机溶剂法、酸热法和超声波
法对于裂殖壶菌油脂的提取效率，结果显示超声波法
的提取率最高，可达（７２９０±４６１）％。实际生产中，
通常采用压榨和高压均质等技术进行大规模的细胞
破碎，释放胞内油脂，但油脂提取效率不够理想。考
虑到酶法细胞破碎技术具有条件温和、设备简易、利
于环保等优势，根据文献［６］报道，外用酶、自溶和噬
菌体裂解是３种主要的酶法细胞破碎技术，外用酶
法的使用范围最广，具有普适性。如今，酶的生产成
本不断下降，为酶法大规模破碎细胞的研究奠定了
坚实的基础。国内主要的ＤＨＡ生产厂家中，武汉友
芝友保健乳品有限公司和湖北福星生物科技有限公
司已成功地将酶法破碎应用于实际生产，并得到了一
定的经济效益［７－８］。目前，工业上常用于微生物细
胞破碎的酶主要是蛋白酶，其中碱性蛋白酶作为一
种胞外酶，培养简便，产量丰富，最适合于大规模的
生产应用。因此，本研究采用碱性蛋白酶法破碎裂
殖壶菌提取胞内油脂，旨在为该领域的工业化生产
提供相应的参考。
１　材料与方法
１１　材料与试剂
１１１　材料
裂殖壶菌发酵液，江苏天凯生物科技有限公
司；碱性蛋白酶液（比酶活３５００００Ｕ／ｇ），杰能科生
物工程有限公司。
１１２　试剂
正己烷、乙醇（体积分数８０％），江苏天凯生物
科技有限公司回收循环利用；ＮａＯＨ、ＫＯＨ、可溶性
淀粉、ＫＩ、酚酞，分析纯，国药集团化学试剂有限公
司；甲醇、三氯甲烷、乙醚、硫代硫酸钠，分析纯，上
海凌峰化学试剂有限公司；无水乙醇，分析纯，无
锡市亚盛化工有限公司；冰乙酸，分析纯，上海申
博化工有限公司。
１２　实验方法
１２１　发酵液生物量的测定
取１０ｍＬ放罐后的裂殖壶菌发酵液置于５０ｍＬ
的离心管中，４０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃去上清液。
用３０ｍＬ的蒸馏水洗涤菌体２次，离心后将菌体均
匀涂布于恒质量的滤纸上，于 １０５℃烘干至恒
质量。
１２２　菌体的酶解
取２５０ｍＬ混匀的裂殖壶菌发酵液于５００ｍＬ烧
杯中，置于恒温水浴中，用１０ｍｏｌ／Ｌ的 ＮａＯＨ调
节ｐＨ，加入适量酶，中速搅拌，酶解一定时间。
１２３　油脂的萃取
酶解结束后，加入发酵液体积１４倍的乙醇沉
析菌体，灭酶活，再分３次各加入发酵液等体积的
正己烷，常温搅拌２ｈ萃取油脂。静置分层后，取
含油的上清液进行真空旋转蒸发除去溶剂。
１２４　油脂的检测
１）提油量的测定　用恒质量的圆底烧瓶收集
油脂的萃取液，旋转蒸发除尽溶剂后称质量。提油
量的计算公式
Ｙ＝ｍＶ （１）
式中：Ｙ为提油量，ｇ／Ｌ；ｍ为油脂质量，ｇ；Ｖ为裂殖
壶菌发酵液体积，Ｌ。
２）过氧化值的测定　采用硫代硫酸钠滴定法，
操作方法及过氧化值的计算参照文献［９］。
３）酸价的测定　采用 ＫＯＨ滴定法，操作方法
及酸价的计算参照文献［９］。
２　结果与讨论
２１　酶解条件的单因素实验
２１１　酶解温度的影响
酶作为一种高效的生物催化剂，其本质大多数
是蛋白质，因此温度对其活性的影响至关重要。根
据所购蛋白酶的性质，选择４５～６５℃为反应温度
进行考察。所用裂殖壶菌发酵液的生物量为
１００ｇ／Ｌ，调节发酵液的ｐＨ为１００，酶用量为生物
量的２％，中速搅拌反应３ｈ，考察酶解温度对油脂
的产量和质量的影响，结果如图１所示。
图１　酶解温度对油脂产量和质量的影响
Ｆｉｇ．１　Ｅｆｅｃｔｓｏｆｅｎｚｙｍａｔｉｃｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｎｏｉｌ
ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｙｉｅｌｄａｎｄｑｕａｌｉｔｙ
由图１可知：随着温度的升高，提油量先增后
减，５５℃时提油量最多，说明该温度下的酶活最
高，菌体的水解程度最大，使得油脂的释放率最
高。与此同时，菌体胞内的蛋白酶等水解酶也会随
温度的升高逐渐被激活进而自溶。就过氧化值而
言，小于等于５５℃的反应温度下均为０，随后逐渐
增加，说明温度升高，油脂的氧化加速。而酸价在
５５℃却是最小的，这间接地证实了裂殖壶菌胞内
的大部分多不饱和脂肪酸是以甘油三酯形式存在
８２ 生　物　加　工　过　程　　 第９卷　
的，油脂产量的增加不会导致酸价的增加。因此，
正交实验的温度选择５０～６０℃。
２１２　酶解ｐＨ的影响
除了温度以外，ｐＨ对酶的影响同样很大，ｐＨ
的偏离会导致酶活性部位结构的改变而影响其活
性。虽然碱性蛋白酶的最适ｐＨ范围为９５～１０５，
但考虑到放罐时裂殖壶菌发酵液的ｐＨ为７～８，因
此选择 ｐＨ的范围为 ８５～１０５，酶解温度设为
５５℃，生物量、反应时间和酶用量同上，考察酶解
ｐＨ对油脂的产量和质量的影响，结果如图２所示。
图２　酶解ｐＨ对油脂产量和质量的影响
Ｆｉｇ．２　ＥｆｅｃｔｓｏｆｅｎｚｙｍａｔｉｃｐＨｏｎｏｉｌ
ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｙｉｅｌｄａｎｄｑｕａｌｉｔｙ
由图２可知：提油量随着 ｐＨ的升高逐渐增加，
在ｐＨ９５处有一个最大值，随后又逐渐减少，可见
该酶的最适ｐＨ为９５，ｐＨ偏低不易使酶充分发挥
催化作用，ｐＨ偏高则会使发酵液中 ＮａＯＨ的 ＯＨ－
与油脂中的游离脂肪酸相结合形成酯，达到可逆的
动态平衡，使其不易酸败，同时提高了抗氧化性能。
最终，正交实验的ｐＨ确定为９０～１００。
２１３　酶解时间的影响
一般而言，酶解反应的时间越长，菌体的水解程
度越大，细胞的破碎程度也就越彻底。但时间过长
会导致胞内的其他共溶物质逐渐渗出，增加油脂中
的杂质含量，对于实际生产而言，还会增加能耗。因
此，选择２～４ｈ为反应时间，酶解温度设为５５℃，
ｐＨ为９５，生物量和酶用量同上，考察酶解时间对
油脂的产量和质量的影响，结果如图３所示。
由图３可知：在最佳温度和ｐＨ的条件下，提油
量得到了进一步增加，且相对稳定，在２５和３５ｈ
处各有一个高峰值。但是，随着反应时间的增加，
油脂中的多不饱和脂肪酸通过搅拌与空气中的 Ｏ２
不断接触，使得过氧化值迅速增加，酸价也逐渐增
加。因此，正交实验的时间选择为２～３ｈ。
图３　酶解时间对油脂产量和质量的影响
Ｆｉｇ．３　Ｅｆｅｃｔｓｏｆｅｎｚｙｍａｔｉｃｔｉｍｅｏｎｏｉｌ
ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｙｉｅｌｄａｎｄｑｕａｌｉｔｙ
２１４　酶用量的影响
酶用量与发酵液的底物浓度存在一定的关系，
酶用量偏少无法有效地破碎细胞，酶用量偏多可能
会导致产物抑制而影响酶的活性。因此，选择酶用
量的范围为生物量的１％～３％，酶解反应温度设为
５５℃，ｐＨ９５，中速搅拌反应２５ｈ，生物量同上，
考察酶用量对油脂的产量和质量的影响，结果如图
４所示。
图４　酶用量对油脂产量和质量的影响
Ｆｉｇ．４　Ｅｆｅｃｔｓｏｆｅｎｚｙｍｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎｏｉｌ
ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｙｉｅｌｄａｎｄｑｕａｌｉｔｙ
由图４可知：随着酶用量的提高，提油量逐渐
增加。酶用量为 ２％时，提油量最大；酶用量再增
加，提油量逐渐减少。由此可见，最佳酶用量为
２％，此时，酶与底物能够最有效地结合，充分地水
解细胞，释放油脂。然而，过氧化值的变化趋势与
提油量相反，酶用量为２％时，该值最小。酸价呈
逐渐上升的趋势，酶用量为１５％ ～２５％时，该值
变化微小。因此，正交实验的酶用量选择为生物量
的１５％～２５％。
２２　酶解条件的正交试验
在上述单因素实验的基础上，考虑到各因素之
９２　第３期 吕　浩等：酶法破碎裂殖壶菌提取胞内油脂
间的相互关系，选用四因素三水平Ｌ９（３
４）进行正交
试验，进一步确定酶解反应的最优条件。各因素水
平实验方案及结果如表１所示，提油量的极差分析
如表２所示。
表１　正交试验结果
Ｔａｂｌｅ１　Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｒｅｓｕｌｔｓ
序号 Ａ温度／℃
Ｂ
ｐＨ
Ｃ
时间／ｈ
Ｄ
ｗ（酶）／％
ρ（油脂）／
（ｇ·Ｌ－１）
１ １（５０） １（９０） １（２） １（１５） ６１９９
２ １ ２（９５） ２（２５） ２（２） ７４８８
３ １ ３（１００） ３（３） ３（２５） ７０２３
４ ２（５５） １ ２ ３ ７５８７
５ ２ ２ ３ １ ７０９３
６ ２ ３ １ ２ ７６６１
７ ３（６０） １ ３ ２ ７４８８
８ ３ ２ １ ３ ７２３３
９ ３ ３ ２ １ ７１１８
　
表２　极差分析
Ｔａｂｌｅ２　Ｒａｎｇｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｒｅｓｕｌｔｓ
因素 Ａ Ｂ Ｃ Ｄ
均值１ ６９０３３ ７０９１３ ７０３１０ ６８０３３
均值２ ７４４７０ ７２７１３ ７３９７７ ７５４５７
均值３ ７２７９７ ７２６７３ ７２０１３ ７２８１０
极差 ５４３７ １８００ ３６６７ ７４２４
　
　　由表２可知：酶解反应的４个影响因素的主次
顺序依次为酶用量、温度、时间、ｐＨ，最佳的酶解反
应条件为Ａ２Ｂ２Ｃ２Ｄ２，即：５５℃，ｐＨ９５，搅拌反应
２５ｈ，酶用量２％。
表３　方差分析
Ｔａｂｌｅ３　Ｖａｒｉａｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｒｅｓｕｌｔｓ
因素 偏差平方和 自由度 Ｆ比 Ｆ临界值 显著性
Ａ ４６５２０ ２ ７３３９ ９０００
Ｂ ６３３９ ２ １０００ ９０００
Ｃ ２０２００ ２ ３１８７ ９０００
Ｄ ８４９２７ ２ １３３９８ ９０００
"
误差 ６３４ ２
　
由表３所得的显著性，是以次要影响因素 ｐＨ
为误差所在列（Ｐ＝０１０）。
２３　酶解条件的重复验证实验
将正交试验获得的酶解最佳反应条件进行重复
验证，３次平行实验得出的平均提油量为（８１５３±
０３３）ｇ／Ｌ，过氧化值为０１５，酸价为０２４。而同等
条件下，菌体自溶的提油量仅为（３６２９±０１５）ｇ／Ｌ，
过氧化值为０４１，酸价为０１７，从而充分体现了酶
法提油的优越性。
３　结论
通过单因素和正交试验考察酶法破碎裂殖壶
菌提取胞内油脂的影响因素，４个主要的影响因素
的主次顺序依次为酶用量、温度、时间、ｐＨ，最佳的
酶解反应条件为５５℃、ｐＨ９５、搅拌反应２５ｈ，酶
用量为菌体生物量的２％。通过进一步的重复验证
实验，证实了最佳酶解条件的优越性，酶法的提油
量高达（８１５３±０３３）ｇ／Ｌ，过氧化值仅为 ０１５，
酸价为０２４，对工业化生产起到了一定的参考作
用。从生产成本和产品附加值的角度出发，可适当
降低温度，缩短时间，兼顾能耗的节约以及油脂的
质量。然而，酶法会导致过度的细胞破碎，释放大
量的胞内物质，给下游的分离纯化操作增加了一定
的难度，值得进一步研究。
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ｔｉｏｎｃｏｎｔｒｏｌｓｔｒａｔｅｇｙｆｏｒｅｆｉｃｉｅｎｔｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃａｃｉｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｂｙＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍｓｐ．［Ｊ］．ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ，２０１０，８７：１６４９１６５６．
［４］　ＱｕＬ，ＪｉＸＪ，ＲｅｎＬＪ，ｅｔａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｏｆｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ
ａｃｉｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍｓｐ．ｕｓｉｎｇａｔｗｏｓｔａｇｅｏｘｙｇｅｎ
ｓｕｐｐｌｙｃｏｎｔｒｏｌｓｔｒａｔｅｇｙｂａｓｅｄｏｎｏｘｙｇｅｎｔｒａｎｓｆｅｒｃｏｅｆｉｃｉｅｎｔ［Ｊ］．
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［６］　ＡｎｔｏｎＰＪＭ．Ｐｒｏｃｅｓｓｓｃａｌｅｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ［Ｊ］．Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＡｄｖａｎｃｅｓ，１９９５，１３（３）：４９１５５１．
［７］　武汉友芝友保健乳品有限公司．生物酶法破壁用于二十二碳
六烯酸油脂生产方法：中国，１０１３０７３４１Ａ［Ｐ］．２００８１１１９．
［８］　湖北福星生物科技有限公司．用裂殖壶菌发酵生产二十二碳
六烯酸的方法：中国，１０１５１９６７６Ａ［Ｐ］．２００９０９０２．
［９］　中华人民共和国卫生部．ＧＢ／Ｔ５００９．３７—２００３ 食用植物油
卫生标准的分析方法［Ｓ］．北京：中国标准出版社，２００４．
０３ 生　物　加　工　过　程　　 第９卷