全 文 ：第 35 卷第 9 期
2015年 5月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vol.35,No.9
May,2015
http: / / www.ecologica.cn
基金项目:浙江省重大科技专项重点农业项目(2012C12009鄄4); 宁波市海洋藻类资源高效开发利用创新团队项目(2011B81007)
收稿日期:2013鄄08鄄11; 摇 摇 网络出版日期:2014鄄08鄄01
*通讯作者 Corresponding author.E鄄mail: zhupeng@ nbu.edu.cn
DOI: 10.5846 / stxb201308112059
张柏烽, 朱鹏, 严小军, 党晨阳, 吕亚厅, 吴景华.一种快速检测微囊藻毒素 mcyG基因的新技术———环介导恒温扩增.生态学报,2015,35(9):
3104鄄3112.
Zhang B F, Zhu P, Yan X J, Dang C Y, L俟 Y T,Wu J H. A novel assay for rapid detection of microcystin mcyG gene: loop鄄mediated isothermal
amplification.Acta Ecologica Sinica,2015,35(9):3104鄄3112.
一种快速检测微囊藻毒素 mcyG基因的新技术
———环介导恒温扩增
张柏烽, 朱摇 鹏*, 严小军, 党晨阳, 吕亚厅, 吴景华
浙江省宁波大学应用海洋生物技术教育部重点实验室, 宁波摇 315211
摘要:利用环介导恒温扩增(LAMP)技术,以微囊藻毒素(Microcystins,MCs)合成基因簇中的 mcyG 基因为靶序列,设计了 1 套
LAMP 引物,建立了 LAMP 反应体系并进行灵敏度和特异性实验。 结果表明 mcyG 基因的最低检测限为:24 cfu / mL,远低于常
规 PCR(Polymerase Chain Reaction)。 整个检测过程仅需 40 min,且可直接目测结果。 特异性实验中, 13 株淡水常见水华蓝藻
分属:色球藻属(Chroococcus)、念珠藻属(Nostoc)、鱼腥藻属(Anabaena)、束丝藻属(Aphanizomenon)、微囊藻属(Microcystis),其中
10 株呈阳性反应, 3 株为阴性。 在野外样品检测中,来自太湖与黄庆苗池塘的水样 PCR 检测显示阴性反应,而 LAMP 检测均
呈阳性反应,提示此两处水样中可能含有产毒微囊藻,显示出了 LAMP 检测方法良好的野外检测和预警能力。 综合上述,LAMP
检测方法能够快速检测产微囊藻毒素的关键基因,且结果可视化。 该方法简便、快捷、不依赖特殊检测设备,极具推广前景。
关键词:微囊藻毒素; 环介导等温扩增技术; 快速检测
A novel assay for rapid detection of microcystin mcyG gene: loop鄄mediated
isothermal amplification
ZHANG Baifeng, ZHU Peng*, YAN Xiaojun, DANG Chenyang, L譈 Yating,WU Jinghua
Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology, Ningbo University, Ningbo 315211, China
Abstract: Microcystin鄄producing cyanobacteria blooms, as well as their increasing global occurrence, are of worldwide
concern because they have been implicated in the death of animals and humans. Currently, many techniques are used to
evaluate whether toxins are present in water samples, including high鄄performance liquid chromatography (HPLC), mouse
bioassays, protein phosphatase inhibition assays ( PPIA), enzyme linked immunosorbent assay ( ELISA), and mass
spectrometry. While some of these techniques are quite sensitive, they are of use only once the toxin is present in the water
source. However, microcystins remain within cyanobacterial cells until being released in high concentrations during cell
lysis. Hence, identifying potential microcystin鄄producing strains in the environment prior to the release of toxins into the
water body is more useful than detection of toxins. Many microcystin鄄producing strains cannot be differentiated from non鄄
toxic strains by traditional microscopy or with ribosomal gene sequences. Synthetase genes (mcy) are responsible for the
biosynthesis of microcystin and are only present in the genome of toxic strains. Polymerase chain reaction (PCR) assays
based on mcy gene sequences have been reported. Though these assays for rapid, sensitive, and specific detection appear to
be promising, PCR applied as a rapid diagnostic test in the field has been seriously constrained owing to the complexity of
the amplification conditions and the need for specialized high鄄cost instruments. Recently, loop鄄mediated isothermal
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amplification (LAMP), a new technology for amplifying DNA, has been developed. Unlike PCR, which requires special
instruments to control reaction temperature, LAMP requires only a temperature鄄controlled water bath. In this manuscript, we
designed a set of LAMP primers to target the sequence of the mcyG gene, which is responsible for the first step in the
biosynthesis of Adda (3鄄amino鄄 9鄄methoxy鄄 2, 6, 8鄄trim ethyl鄄 10鄄phenyldeca鄄 4, 6鄄dienoic acid), an important part of
microcystin. The conditions of amplification were optimized to implement the sensitivity and specificity experiments. We
found that 61 益 for 40 min was the most suitable reaction condition. We then selected thirteen cyanobacterial strains,
including Microcystis, Aphanizomenon, Chroococcus, Nostoc, Oscillatoria, and Anabaena, to determine the specificity and
sensitivity of the primers in the LAMP reactions. The results of amplification were positive with ten microcystin鄄producing
strains and negative with three non鄄toxic strains, which demonstrated that the primers had suitable levels of specificity. The
sensitivity of LAMP, with a detection limit of 24 cfu / ml, was 1000鄄fold higher than that of PCR. For verifying the
application of this LAMP assay in the aquatic ecosystem, seven environmental samples from ponds and lakes in Ningbo and
one from Tai Lake were analyzed using both the LAMP assay targeting the mcyG gene and a PCR assay. The LAMP assay
detected amplification in two water samples that the PCR assay did not detect, demonstrating that the LAMP assay is more
effective and more suitable for field testing. The LAMP method is fast, simple, and low in cost making it advantageous for
the detection of potential toxic cyanobacterial blooms. By employing the LAMP assay, workers at the Environmental
Monitoring Station will be able to detect toxic cyanobacterial cells at low levels, before they reach an unsafe concentration.
This will allow the workers, through routine monitoring of potential toxin status in the freshwater, to have enough time to
implement a series of control strategies for avoiding human exposure to cyanobacterial hepatotoxins at dangerous levels.
Key Words: microcystin; loop鄄mediated isothermal amplification method; rapid detection
蓝藻水华是影响人类健康的重要水环境因素,其不仅严重污染环境和影响美观,且其释放出来的蓝藻毒
素也具有致染色体断裂、基因诱变及较高的急性毒性[1,2]。 在自然水体中,蓝藻水华发生后易出现大量可造
成环境危害的微囊藻毒素,这是一类具有生物活性的环七肽化合物,主要为微囊藻属(Microcystis)、鱼腥藻属
(Anabaena)、念珠藻属(Nostoc)和阿氏浮丝藻属(Planktothrix)的种或株系产生[2]。 人与动物饮用或直接皮肤
接触微囊藻毒素污染的水体后,会不同程度地出现腹泻、肠胃炎等症状,长期饮用会导致肝功能损伤甚至死
亡,已有研究表明其与人类原发性肝癌发病率有很大相关性[3鄄4]。 1996 年发生在巴西的导致至少 50 人死于
藻毒素急性中毒的医疗事故中,证实了微囊藻毒素的危害[5]。
微囊藻毒素检测方法分为直接检测和间接检测。 常见的微囊藻毒素直接方法有:细胞毒性实验法、化学
分析法[6]、ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay) [7]及 PPIA(Protein phosphatase inhibition assay) [8]方法。
这些方法对样品与检测环境的要求高,很难被广泛运用于基层的环境监测部门。 同时,这些方法只能检测水
体中已产生并累积到一定程度的微囊藻毒素,无法对微囊藻毒素的产生进行预判。 随着微囊藻毒素生物合成
基因簇的发现[9],可以通过对水体中是否存在微囊藻毒素合成基因进行检测,间接地判断水体中是否存在微
囊藻毒素。 毒素合成基因检测的结果对于水体中微囊藻毒素的产生具有一定的超前性,能将微囊藻毒素的检
测从发生期前移到累积期,从而大大提高对水体中微囊藻毒素的预防能力。 同时许多学者成功地使用 PCR
技术对微囊藻毒素进行快速诊断和检测,但由于 PCR技术本身固有的缺点,如需要整套用于核酸扩增检测的
仪器设备以及繁琐的操作程序等,大大限制了其在微囊藻毒素诊断检测(尤其是快速现场诊断检测)中的应
用。 因此,迫切需要一种快速、简便、灵敏的微囊藻毒素检测方法。
新型的 DNA环介导恒温扩增(LAMP)方法,最初由 Notomi 等人设计并应用于病原微生物的检测[10]。 该
方法通过针对靶基因的 6 个区域而设计 4 种特异性引物,利用具有链置换活性的 Bst DNA聚合酶,在恒温条
件下(60—65 益)高效(0.5—1 h)扩增目标 DNA。 该方法仅需要简单的水浴锅或者加热器,同时其在反应过
程中产生的大量副产物鄄白色焦磷酸镁沉淀可以通过肉眼或者加入钙黄绿素染料观察结果,而且在灵敏度、特
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异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于 PCR技术。 目前,国内外已有较多文献报道了该技术的应用[11鄄13],
但是其大多数只应用于病原微生物检测方面,在微囊藻毒素基因检测方面的应用还未有先例。
本研究以微囊藻毒素合成簇中关键基因 mcyG 为基础,设计筛选了 1 套用于 LAMP 扩增的引物,首次尝
试建立微囊藻毒素 LAMP 间接检测方法,并着重对 LAMP 技术与 PCR 技术在合成毒素基因的检测涉及到的
检测效率、特异性、灵敏度等方面做了比较,验证了该方法在微囊藻毒素检测中的可行性和可靠性。
1摇 材料与方法
1.1摇 菌株和样品
通过查阅文献[14鄄15],选取了淡水常见蓝藻水华的色球藻属(Chroococcus)、念珠藻属(Nostoc)、鱼腥藻属
(Anabaena)、束丝藻属(Aphanizomenon )、微囊藻属(Microcystis)代表藻种 13 株,其中有毒藻 10 株,无毒藻 2
株,不确定产毒藻 1 株(表 1),均购自中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库(FACHB Collection)。 其
中 Microcystis wesenbergii 908(无毒藻)、Microcystis aeruginosa 925(有毒藻)用于环介导等温扩增技术条件优化
及其灵敏度分析的试验。
藻种采用 BG11 液体培养基培养[16],培养温度 25 益,光照强度 18—27 滋mol m-2 s-1,光暗循环为 L 颐D =
12 h颐12 h,每天摇瓶 1—2 次,静置培养。
1.2摇 微囊藻基因组 DNA的提取
实验室样品摇 采用上海生工的细菌基因组 DNA提取试剂盒进行样品的 DNA抽提,DNA样品经 1%凝胶
检测后-20 益保存备用。
自然水样摇 采集 1 L自然水样先用 500 目的不锈钢筛过滤,滤液再经 0.45 滋m 滤膜抽滤后,收集滤膜用
超纯水洗脱,收集洗脱液于 1.5 mL EP 管,12000 r / min 离心 2 min,弃上清,加入 40 滋L 超纯水悬浮混匀,
-70 益保存 3 min后 40 益保持 1 min,反复冻融 3 次,离心取上清经 1%凝胶检测后-20 益保存备用。
表 1摇 本研究采用的藻种名称和 LAMP(Loop鄄mediated isothermal amplification)检测结果
Table 1摇 Cyanobacterial strains used in this study and LAMP(Loop鄄mediated isothermal amplification) assay specificity of mcyG
藻属
Genus
藻种
Strains
微囊藻毒素
Microcystin
微囊藻毒素基因 LAMP 检测结果
Detection of mcyG gene by LAMP
色球藻属 Chroococcus Chroococcus sp. FACHB-193 + +
念珠藻属 Nostoc Nostoc sp FACHB鄄596 + +
束丝藻属 Aphanizomenon Aphanizomenon flos鄄aquae FACHB鄄1039 + +
微囊藻属 Microcystis Microcystis aeruginosa FACHB鄄 905 + +
Microcystis aeruginosa FACHB鄄 924 + +
Microcystis aeruginosa FACHB鄄925 + +
Microcystis sp.7806 FACHB鄄915 + +
Microcystis aeruginosa FACHB鄄942 + +
Microcystis wesenbergii FACHB鄄929 + +
Microcystis viridis 979 + +
Microcystis鄄flos鄄aquae 1028 + / - -
Microcystis wesenbergii 908 - -
鱼腥藻属 Anabaena Anabaena f los鄄aquae FACHB 245 - -
摇 摇 + / - 表示是否产微囊藻毒素; + / -表示是否存在微囊藻毒素 mcyG基因
1.3摇 引物设计与合成
根据 GeneBank中微囊藻毒素合成簇中的负责合成微囊藻毒素生物活性表达所必须的 Adda(3鄄amino鄄 9鄄
methoxy鄄 2, 6, 8鄄trim ethyl鄄 10鄄phenyldeca鄄 4, 6鄄dienoic acid ) 的 mcyG 基因的已知序列 ( AF183408、
CAIM01000217、AY212249 ),利用 ClustalW比对软件寻找其保守区域,并按环介导恒温扩增技术引物设计原
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则, 针对 mcyG基因的保守区域设计外引物(MCYG鄄F3、MCYG鄄B3)、内引物(MCYG鄄FIP、MCYG鄄BIP)、环引物
(MCYG鄄LF、MCYG鄄LB)一组共 6 条环介导恒温扩增技术扩增特异引物(表 2)。 引物在保守区上的相对位置
见图 1。 引物由上海英骏生物技术有限公司合成。
表 2摇 LAMP (Loop鄄mediated isothermal amplification)方法检测微囊藻毒素的引物序列
Table 2摇 Primers for LAMP (Loop鄄mediated isothermal amplification)amplification of Microcystins
引物
Primer
类型
Type
长度(碱基数)
Length(bp)
序列(5忆鄄3忆)
Sequence(5忆鄄3忆)
MCYG鄄F3 Forward鄄outer primer 18鄄mer CTGAAACTTGCTCGCCAG
MCYG鄄B3 Backward鄄outer primer 25鄄mer CTATCGTATTTTTAGGAATTATGGC
MCYG鄄FIP Forward鄄inner primer 47鄄mer GGTCTCCTAACTTTGCATTTTCCTT
(F1c +TTTT +F2) TTTT GAGGAGAGGTTATAAGAGACGT
MCYG鄄BIP Backward鄄inner primer 46鄄mer GCTTACTTGATGCTTTTGAATGAGT
(B1c +TTTT +B2) TTTT AAATTCATGTTCCCATGGAAT
MCYG鄄LF Loop鄄forward primer 21鄄mer AACAGGCCGAAGAACTTAAGC
MCYG鄄LB Loop鄄backward primer 20鄄mer TAACCATTGCAGAGGTTGGC
图 1摇 6 条引物在 mcyG基因保守区域的相对位置
摇 Fig.1摇 Nucleotide sequences of targets for primers in the LAMP
(Loop鄄mediated isothermal amplification)assay on mcyG gene
1.4摇 微囊藻毒素基因 mcyG的 PCR检测
以 1.3 中设计的环介导恒温扩增引物的外引物
MCYG鄄F3、MCYG鄄B3 作为 PCR 引物对蓝藻模板 DNA
进行扩增,反应各组分终浓度为:10 滋mol / L MCYG鄄F3
和 10 滋mol / L MCYG鄄B3 各 1 滋L,2郾 5 mmol / L dNTPs 2
滋L,5 U / 滋L Ex Taq 酶 (TaKaRa) 0.125 滋L,10伊buffer
2郾 5 滋L,模板 2 滋L,双蒸水定容至 25 滋L体系。 优化后
的 PCR反应条件:预变性 94 益 5 min;94 益 45 s,50 益
45 s,72 益 45 s,35 个循环;72 益延伸 10 min。 扩增产
物采用 2.0%的琼脂糖凝胶电泳检测结果。
1. 5 摇 微囊藻毒素基因 mcyG 的环介导恒温扩增
(LAMP)检测
以 Microcystis wesenbergii 908、Microcystis aeruginosa 925的基因组 DNA作为模板进行扩增条件的优化。 本
研究所使用的 LAMP 法 DNA反应试剂盒与荧光染料钙黄绿素均购自日本荣研化学株式会社;反应各组分终
浓度为:内引物 FIP 和 BIP 各 1.6 滋mol / L,外引物 F3 和 B3 各 0.2 滋mol / L,环引物 LF 和 LB 各 0.8 滋mol / L,
dNTPs 1.4 mmol / L,甜菜碱 0.8 mol / L,Tris鄄HCl (pH值 8.8) 20 mmol / L KCl 10 mmol / L,(NH4) 2SO4 10 mmol /
L,MgSO4 8 mmol / L,Tween20 0.1%,Bst DNA 聚合酶大片段 8 U,DNA模板 2 滋L,钙黄绿素 1 滋L,双蒸水定容至
25 滋L。 阴性对照管不加 DNA模板。 反应条件:61 益恒温保持 40 min后 80 益灭活 10 min。 通过反应物中钙
黄绿素的颜色变化以及后续的 3.0%琼脂糖凝胶电泳进行扩增结果检测。
1.6摇 LAMP 与 PCR的特异性验证
选取 Chroococcus sp. FACHB鄄193、Nostoc sp. FACHB鄄596、Aphanizomenon flos鄄aquae FACHB鄄1039、Microcystis
aeruginosa 905、Microcystis aeruginosa 924、Microcystis aeruginosa 925、Microcystis sp.7806 FACHB鄄915、Microcystis
aeruginosa FACHB鄄942、Microcystis wesenbergii FACHB鄄929、Microcystis viridis 979、Microcystis flos鄄aquae 1028、
Microcystis wesenbergii 908、Anabaena f los鄄aquae FACHB 245共 13 株常见蓝藻用于 LAMP 和 PCR 的特异性验
证试验。 DNA提取方法见 1.2,环介导等温扩增技术与 PCR技术反应体系和条件见 1.5和 1.4.
1.7摇 LAMP鄄AGE与 PCR鄄AGE的灵敏度验证
取 Microcystis aeruginosa 925基因组 DNA原始模板(2.4伊105cfu / mL),以 10倍梯度稀释,选取各个稀释度
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作为模板用于比较文中建立的环介导等温扩增技术和 PCR扩增灵敏度差异。
1.8摇 藻毒素 LAMP 检测方法的野外应用
分别采集位于浙江省宁波的日湖、月湖、四明山水库和宁波大学校园的海运池塘、材化小河、教学楼前池
塘、黄庆苗楼池塘及江苏省太湖 8 个不同地域的水样(表 3),按 1.2 方法提取 DNA 用于优化后的 PCR 和
LAMP 方法检测。
1.9摇 微囊藻产毒量计算
微囊藻产毒量计算公式如下式所示:
M=K伊N / 1000 (1)
式中,M为微囊藻毒素总含量(滋g / L),N为单位体积内的藻细胞数量(cfu / mL), K 为单个藻细胞产微囊藻毒
素量(滋g)。
表 3摇 野外样品 GPS分布区域
Table 3摇 GPS (Global Positioning System) of field samples
水样
Water samples
位置 Location
北纬 North Latitude 东经 East Latitude
水样
Water samples
位置 Location
北纬 North Latitude 东经 East Latitude
黄庆苗池塘 29毅54忆19.06义 121毅38忆5.76义 日湖 29毅53忆48.84义 121毅33忆38.72义
材化学院池塘 29毅54忆30.32义 121毅37忆53.28义 月湖 29毅52忆7.92义 121毅32忆19.67义
海运学院池塘 29毅54忆30.59义 121毅37忆50.02义 四明山水库 29毅56忆27.84义 121毅3忆48.68义
教学楼池塘 29毅54忆42.86义 121毅37忆57.62义 太湖 31毅17忆20.99义 120毅12忆9.55义
2摇 结果
2.1摇 环介导恒温扩增技术扩增条件的确立
选择 61、63、65 益 3个不同的反应温度进行环介导恒温扩增技术扩增 100 min, 反应进行 30 min 后每隔
10 min进行实时颜色变化记录。 结果见表 4,反应进行 40 min即通过反应管的颜色变化判断产物的有无,在
同样的反应体系下,63 益时反应 40 min后开始出现非特异性扩增现象,65 益时反应 50 min 后出现假阳性现
象,61 益时反应现象正常,随着反应时间的延长在 3种不同的扩增温度条件下均逐渐出现非特异性扩增。 说
明反应时间过长对扩增结果有影响,因此,最终选择 61 益、40 min作为后续 LAMP 扩增的最佳反应条件。
表 4摇 3个不同反应温度下的实时反应结果
Talbe 4摇 Real鄄time color change under three different amplification temperature
反应时间 / min
Amplification time
反应温度 / 益
Amplification temperature
mcyG基因 mcyG gene
Microcystis aeruginosa 925 Microcystis wesenbergii 908 NC
61 - - -
30 63 - - -
65 - - -
61 + - -
40 63 + + -
65 + - -
61 + - -
50 63 + + -
65 + - +
61 + - -
60 63 + + -
65 + - +
61 + - -
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续表
反应时间 / min
Amplification time
反应温度 / 益
Amplification temperature
mcyG基因 mcyG gene
Microcystis aeruginosa 925 Microcystis wesenbergii 908 NC
70 63 + + -
65 + - +
80 61 + - -
63 + + -
65 + - +
61 + - -
90 63 + + -
65 + - +
61 + - +
100 63 + + -
65 + - +
摇 摇 +: 变成绿色即 LAMP 扩增产物生成; “-冶: 保持黄色即未发生 LAMP 扩增; “NC冶: 阴性对照
图 2摇 LAMP与 PCR的特异性验证结果
摇 Fig.2摇 The specificity of microcystin gene shown in LAMP(a、b)
and PCR(c) methods by using mcyG gene as the target sequence
a、b、c分别为 mcyG 基因的 LAMP 可视化结果图、LAMP 电泳图、
PCR( Polymerase Chain Reaction) 电泳图;1鄄 15: Chroococcus sp..
FACHB鄄193, Nostoc sp FACHB鄄596, Aphanizomenon flos鄄aquae
FACHB鄄1039,Microcystis aeruginosa 905,Microcystis aeruginosa 924,
Microcystis aeruginosa 925, Microcystis sp. 7806 FACHB鄄915,
Microcystis aeruginosa FACHB鄄 942,Microcystis wesenbergii FACHB鄄
929, Microcystis viridis 979, Microcystis鄄flos鄄aquae 1028, Microcystis
wesenbergii 908,Anabaena f los鄄aquae FACHB 245 作为反应模板;
16:蒸馏水为模板作阴性对照;M: DM1000 DNA Marker
2.2摇 LAMP 与 PCR的特异性验证
以文中建立的 LAMP 与 PCR 扩增方法对 13 株水
华常见蓝藻进行检测。 结果见表 1 和图 2。 LAMP 扩
增产物通过反应试剂的颜色变化判断(图 2a)和琼脂糖
凝胶电泳检测显示 (图 2b), 10 株产微囊藻毒素的
Chroococcus sp. FACHB鄄 193、 Nostoc sp. FACHB鄄 596、
Aphanizomenon flos鄄aquae FACHB鄄 1039、 Microcystis
aeruginosa 905、 Microcystis aeruginosa 924、 Microcystis
aeruginosa 925、 Microcystis sp. 7806 FACHB鄄 915、
Microcystis aeruginosa FACHB鄄 942、Microcystis wesenbergii
FACHB鄄929、Microcystis viridis 979均呈阳性反应,2株不
产微囊藻毒素的 Microcystis wesenbergii 908、 Anabaena f
los鄄aquae FACHB 245 均 为 阴 性, 产 毒 不 确 定 的
Microcystis鄄flos鄄aquae 1028[14鄄15]也为阴性,无菌水作为阴
性对照也无扩增,特异性良好。 而 PCR 扩增结果显示
(图 2c ), Chroococcus sp. FACHB鄄193、 Microcystis
wesenbergii FACHB鄄929 扩 增 效 率 不 高, Nostoc sp
FACHB鄄596、 Aphanizomenon flos鄄aquae FACHB鄄1039、
Microcystis wesenbergii 908、Anabaena f los鄄aquae FACHB
245出现非特异性扩增现象。 这些表明对于微囊藻毒
素基因 mcyG的检测,LAMP 法相比于 PCR方法具有更
好的特异性,且钙黄绿素的加入使得 LAMP 扩增结果直
观可视。
2.3摇 LAMP鄄AGE与 PCR鄄AGE的灵敏度验证
对 Microcystis aeruginosa 925基因组 DNA(2.4伊105cfu / mL)进行 10倍梯度稀释后作为模块用于 LAMP 和
PCR扩增的灵敏度检测,结果表明:mcyG基因(图 3a 和 b)LAMP鄄AGE 检测的最低模板浓度为 24 cfu / mL,而
相应的 PCR鄄AGE检测的最低模板浓度为 2.4伊104cfu / mL(图 3c),LAMP 比常规 PCR方法灵敏 1000倍。
9013摇 9期 摇 摇 摇 张柏烽摇 等:一种快速检测微囊藻毒素 mcyG基因的新技术———环介导恒温扩增 摇
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摇 图 3摇 LAMP鄄AGE 与 PCR鄄AGE 检测 Microcystis aeruginosa 925
的灵敏度比较
Fig.3摇 The sensitivity of microcystin gene shown in LAMP and
PCR methods
a为加钙黄绿素的 LAMP 检测可视化图,b、c分别为 mcyG 基因的
LAMP 和 PCR检测结果电泳图;1—5:原始浓度为 2.4伊105 cfu / mL
的 Microcystis aeruginosa 925基因组 DNA 分别稀释 100, 101,102,
103,104倍为反应模板. 6:蒸馏水为模板作阴性对照;M: DM1000
DNA Marker
2.4摇 LAMP 与 PCR方法在野外应用的比较
对 8 个来自不同地域的自然水样中的微囊藻毒素
基因 mcyG分别进行 LAMP(图 4a)和 PCR(图 4b)检测
结果显示:8 份野外样品中,来自四明山水库的水样
LAMP 与 PCR 检测均呈阳性反应,太湖水样、黄庆苗池
塘水样 LAMP 均呈阳性反应而 PCR呈阴性反应,其余 5
份野外样品两种检测方法均成阴性反应。 该结果表明
对于微囊藻毒素基因的检测,相对于传统的 PCR 方法,
LAMP 具有更高的灵敏性。 同时,由于钙黄绿素的添加
使得 LAMP 结果直观可视更加利于野外的现场检测。
3摇 讨论
微囊藻毒素一般是由 Adda, D鄄Glu, Mdha, D鄄Ala,
L鄄X, D鄄MeAsp, L鄄Z, 7 种氨基酸形成的环肽化合物,
Sivonen, K和 Botes, D.等人研究表明,对于已知的常见
微囊藻毒素类型,其微囊藻毒素结构中的重要致毒部分
是 Adda氨基酸残基[2,17]。 Adda 合成过程中的第一步
是由 mcyG 基因的 NRPS / PKS ( Nonribosomal peptide鄄
synthetase / Polyketide synthases)杂合酶负责, 且杂合酶
中的腺苷酰化结构域(Adenylation domains)在 Adda 合
成时起从底物中抓取氨基酸作用[18],这对于微囊藻毒
素活性表达是至关重要的,而目前的微囊藻毒素基因检
测常见靶标 mcyA、mcyB、mcyD等并不包括 mcyG[19],本
研究选择了 mcyG基因中的 Adenylation domains区域作
为靶序列,用于微囊藻毒素基因检测。 研究结果表明,
mcyG作为一个新的靶标在微囊藻毒素基因检测中效果
良好。
本研究针对 mcyG中负责特异性识别 Adda侧链的腺苷酰化结构域(Adenylation domain)设计合成了 1 套
适用于 LAMP 扩增检测的引物,并对 LAMP 扩增条件进行了优化。 在此基础上,对 LAMP 和传统的 PCR方法
在特异性和灵敏度两个方面进行了比较。 实验结果显示相对传统的 PCR 技术,LAMP 技术在恒温条件(61
益)下即可发生反应,且反应时间短,加入钙黄绿素染料后在反应开始 40 min 后即可通过肉眼观察颜色变化
从而判断是否发生 LAMP 扩增。 两种方法的特异性比较发现,LAMP 方法对 13 株自然水体常见蓝藻种类的
检测结果与文献已报导的结果一致[14鄄15]。 而传统的 PCR检测结果却有部分藻种出现扩增效率不高与非特异
性扩增现象,这表明本研究所建立的 LAMP 方法具有比传统 PCR更强的特异性。
以 Microcystis aeruginosa 925作为研究对象比较了 LAMP 和 PCR方法在检测微囊藻产毒基因 mcyG 中的
灵敏度。 结果发现目前 LAMP 最低检测限为 24 cfu / mL,而 PCR方法则为 2.4伊104 cfu / mL。 LAMP 扩增灵敏
度比传统 PCR扩增方法提高了 3 个数量级。 Chen 等[14]人研究发现 Microcystis aeruginosa 925 的单个藻细胞
产微囊藻毒素量为 1.37伊10-7滋g,目前微囊藻毒素 ELISA检测试剂盒与 LC鄄MS等检测方法的定性检出限一般
在 0.05 ppb以上[14,20鄄22],因此,如果以 Microcystis aeruginosa 925作为检测对象,根据文中公式(1)可推算出其
在理想状态下 ELISA或 LC鄄MS方法所需的最低细胞浓度应为 365 cfu / mL,而实际检测中,由于要考虑到各种
环境因素的影响,实际所需的细胞浓度要远远大于 365 cfu / mL。 因此,相对 ELISA 或 LC鄄MS 方法,LAMP 方
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图 4摇 LAMP与 PCR检测自然水样的结果比较
Fig.4摇 Detection of the mcyG gene in water samples
a为加钙黄绿素后的 LAMP 检测可视化图,b 为 PCR 检测结果电泳
图; 1—8:日湖、月湖、四明山水库、太湖、材化小河、海运池塘、黄庆
苗池塘、教学楼池塘水样为模板;9:蒸馏水为模板作阴性对照;M:
DM1000 DNA Marker
法同样也具有很高的灵敏度(表 5)。 另外,中国与世界
卫生组织规定的生活饮用水标准规定饮用水中该毒素
含量上限为 1 滋g / L,同样以有毒微囊藻 Microcystis
aeruginosa 925作为检测对象,根据文中公式(1)可推算
出当水体中含有产毒藻细胞数为 7.30伊103cfu / mL 以上
时,理论上对人体是有害的。 由于 LAMP 方法检测的所
需藻细胞数仅仅为 24 cfu / mL 远远低于蓝藻水华暴发
并达到有害饮用水标准的藻细胞浓度,因此,这将使我
们能更早的监测到水体中潜在的产毒微囊藻,将传统的
微囊藻毒素检测从暴发期前移到累积期,从而大大提高
自然水体尤其是饮用水体中微囊藻毒素的预警能力。
4摇 结论
本研究首次将 LAMP 技术应用于微囊藻毒素基因
检测,建立了微囊藻毒素生物合成基因 mcyG 的 LAMP
检测方法。 运用该方法可快速对水体中的微囊藻毒素
生物合成基因进行检测,进而对水体中是否存在具体产
毒能力的微囊藻藻株作出判断。 众所周知,微囊藻毒素具有胞内合成、死亡释放的特性,这往往导致毒素在水
体中的释放是暴发式的。 本文所建立的 LAMP 方法由于具有高灵敏度、高特异性、操作简单、结果直观可视的
特点十分便于野外现场检测。 因此,运用本文所建立的 LAMP 方法可对自然水体中具有潜在产微囊藻毒素能
力的蓝藻进行现场实时监测,将微囊藻毒素监测从暴发期前移到累积期,从而大大提高自然水体尤其是饮用
水体中微囊藻毒素的预警能力,这对保障自然水体尤其是饮用水体的安全性有着重要的意义。
表 5摇 LAMP、PCR与毒素检测模板数量级比较
Table 5摇 Limit of detection for LAMP, PCR and LC鄄MS / ELISA (Liquid chromatography鄄mass spectrometry / Enzyme linked immunosorbent)
藻细胞数 /
(个 / mL)
Cells
聚合酶链反应
Polymerase Chain
Reaction (PCR)
环介导等温扩增反应
Loop鄄mediated isothermal
amplification(LAMP)
间接竞争酶联免疫法 /
液相色谱鄄串联质谱法
Enzyme鄄linked immunosorbent
assay / Liquid chromatograph鄄
mass spectrometer
(ELISA / LC鄄MS)
饮用水标准(中国、
国际卫生组织)
The standards of drinking
water (China、World Health
Organization)
101 - + - -
102 - + - -
103 - + + +
104 + + + +
105 + + + +
106 + + + +
>106 + + + +
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