全 文 ：第 ! 卷第 # 期
$%&% 年 月
生"物"加"工"过"程
6;CE@G@SDK2E3JDF/CDA2DL@GG^ E4CE@@2CE4
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IDC"&%>(5 7`>CGGE>&5*$ ?(5*!>$%&%>%#>%%#
收稿日期"$%&% ?%# ?&.
基金项目"海南省教育厅高等学校科研资助项目#+`$%% ?$($
作者简介"胡文婷#&!&%$&女&山东曹县人&硕士&讲师&研究方向"生物化工& 1^M3CJ";KN@EBCE4e%f&5(>LDM
黑眶蟾蜍皮肤抗菌肽的制备及其性质
胡文婷&&张英霞&&满初日噶$&张"凯(&黄"鑫&&陈敏洁&
#&>海南大学 海洋学院 海洋生物实验教学中心&海口 #*%$$!) $>海南大学 农学院&海口 #*%$$!)
(>海南海灵化学制药有限公司&海口 #*%(&&$
摘"要"收集黑眶蟾蜍皮肤分泌物&经 0@A;3I@VQ $# 去除大分子蛋白后&利用微量测定法进行抗菌活性分析 结
果发现"黑眶蟾蜍皮肤分泌物对革兰氏阳性菌$$$金黄色葡萄球菌(枯草芽孢杆菌的抑制作用较强&对革兰氏阴性
菌中的嗜水气单细胞菌也表现出较强的抑制作用&对溶藻弧菌(副溶血弧菌(河流弧菌(大肠杆菌的抑制相对较弱
利用胰蛋白酶对黑眶蟾蜍皮肤抗菌肽水解后&其抗菌活性消失 将黑眶蟾蜍皮肤抗菌肽在 (* j# i和 A+$h# j
#h% 下保温&发现其抗菌活性成分对热及酸耐受性较强 黑眶蟾蜍皮肤分泌物在低浓度无溶血活性
关键词"抗菌肽)黑眶蟾蜍)皮肤分泌物
中图分类号"8#h)8##5 """"文献标志码"P""""文章编号"&5*$ ?(5*!#$%&%$ ?%%$& ?%.
E409545F.2/5/I942904F.01275/F.J.:42H.56909F.I01742J1]./
10:40F.2/27;0<& )(/*1&+7#$70+
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DKGN3B@2B@MA@23BK2@3EI A+G;DN@I 3EBCMCL2D9C3JGB39CJCBH343CEGBB;@B@MA@23BK2@3EI A+>_BN3GED
;@MDJHGCGFD2FCG; 2@I 9JDDI L@JGDE B;@JDNLDEL@EB23BCDE>
L0G K24I1"3EBC93B@2C3JA@ABCI@):0;&)(/*1&+6#$60+)GaCE G@L2@BCDE
""两栖动物皮肤裸露(湿润&因此相对于其他动
物&皮肤黏液中含有更多分子结构特殊(功能复杂
多样的抗菌活性物质*&+ 其中抗菌肽#3EBC93LB@2C3J
A@ABCI@G$是免疫防卫系统产生的一类对抗外源性病
原体致病作用的防御性多肽活性物质&具有广谱抗
菌活性和抗病毒(抗真菌(抗寄生虫及抗肿瘤等生
物活性&且抗菌肽的独特作用机理使其不易产生抗
药性&对一些农作物和经济作物病原菌亦有作用&
因此有望成为新型的人用或兽用抗菌药物*$ ?(+ 黑
眶蟾蜍&属于两栖纲(无尾目(蟾蜍科(蟾蜍属&广泛
分布于我国南北地区&是常见的蟾蜍品种 中药
,蟾酥-即黑眶蟾蜍或中华大蟾蜍的耳后腺及皮肤
腺分泌的白色浆液加工干燥而成&具有消肿止痛(
解毒辟秽的作用*.+
本文通过对黑眶蟾蜍皮肤腺体黏膜抗菌活性
成分的分离&在以常见致病菌对抗菌肽的活性进行
筛选的同时&以海产动物常见有害菌种为受试菌种
进行筛选&并对其理化特性进行了初步检测分析&
以期为黑眶蟾蜍的综合开发利用提供资料
C?材料与方法
CMC?材料
黑眶蟾蜍&采自于海南省北部地区的池塘中&
在实验室养殖 $% I
抗菌活性测定所用菌株"革兰氏阳性菌&金黄
色葡萄球菌# 76*-%8/&$&$$0+*0"(0+$(枯草芽孢杆菌
#:*$#/0++0E6#/#+$和革兰氏阴性菌&溶藻弧菌#@#E"#&
*/.#1&/86#$0+$(副溶血弧菌#@#E"#&-*"*%*()&/86#$0+$(
河流弧菌 #@#E"#&;/09#*/#+$(嗜水气单胞菌 #,("&A
)&1*+%8"&-%#/* $( 大肠杆菌 #G+$%("#$%#* $&/#$)
0@A;3I@VQ $# 为<;32M3LC3公司产品)其他试剂为
分析纯
CMA?方法
&h$h&"皮肤分泌物的收集
取黑眶蟾蜍&用超纯水清洗皮肤&置于带盖的玻
璃容器中&滴加适量的无水乙醚&密闭容器& j$ MCE&
可见泡沫状物质从黑眶蟾蜍的皮肤中分泌出来&收集
分泌物用体积分数为 $g的乙酸溶液. i浸提&$ ;&
&$ %%% 27MCE离心&% MCE&取上清冷冻干燥
&h$h$"凝胶过滤层析
将上述粗提品用超纯水溶解后上样于 0@A;3I@V
Q $#凝胶过滤柱#柱规格&5 MMm5%% MM$&用超纯
水以流速%h# MZ7MCE洗脱&每&% MCE收集J管&紫外检
测仪测其波长$!% EM处的吸光度&收集洗脱峰&冷冻
干燥&得黑眶蟾蜍皮肤抗菌肽&?$% i保存备用
&h$h("微量测定法检测抗菌活性
黑眶蟾蜍皮肤抗菌肽抗菌活性检测在 5 孔细
胞培养板上完成 取对数生长期菌液&用液体培养
基调整菌液密度为 &%# 个7MZ 每孔加入%
#
Z菌
悬液& 再加入 &%
#
Z的黑眶蟾蜍抗菌肽粗品
#&% M47MZ&%h$$
#
M滤膜过滤除菌$&每个试样重
复 ( 次 以加入生理盐水孔为阴性对照孔 将 5
孔板(% i轻微震荡孵育 &% j&. ; 利用酶标仪测
定各孔5%% EM光吸收值#H?
5%%
$
抑菌率l*& ?#H?
5%%
#试样$ ?H?
5%%
#对照$$+ m
&%%g
*#+
&h$h."抗菌活性成分的温度稳定性测定
将黑眶蟾蜍皮肤抗菌肽 #&% M47MZ$分别于
(*(#%(*% 和# i保温&% MCE后&迅速置冰盒中冷
却&按上述方法用金黄色葡萄球菌检测抑菌活性&
用生理盐水作阴性对照
&h$h#"抗菌活性成分的 A+稳定性测定
将黑眶蟾蜍皮肤抗菌肽中加入不同量& MDJ7Z
三氟乙酸#A+分别调至 #h%(.h%((h%(和 $h#$&静置
(% MCE&冷冻干燥后&用双蒸水定容至原质量浓度
#&% M47MZ$&按上述方法用金黄色葡萄球菌检测抑
菌活性
&h$h5"胰蛋白酶水解
取&% M47MZ黑眶蟾蜍皮肤抗菌肽& MZ&加入
$#%
#
4胰 蛋 白 酶& 混 匀& (* i 孵 育 & ;& . i
&# %%% 27MCE&离心&% MCE&取上清液&按上述方法用
金黄色葡萄球菌进行抗菌试验
&h$h*"溶血活性测定
从尼罗罗非鱼#H"(&$%"&)#+1#/&6#$0+$尾静脉取血&
血液置于预先放阿氏液#@#阿氏液$k@#血液$ l&k&$
的离心管中&$ #%% 27MCE离心&% MCE&用生理盐水
洗涤至上清液不再呈红色为止 将洗涤好的红细
胞加生理盐水稀释成悬浮液#稀释度为&k&%$ 分
别取&%%
#
Z不同质量浓度的黑眶蟾蜍皮肤抗菌肽
#终质量浓度 & j&% M47MZ$&加入含& MZ红细胞
悬浮液的试管中&以加入&%%
#
Z质量浓度为 %h&g
0R0 的试管为阳性对照 # &%%g溶血$&以加入
&%%
#
Z生理盐水的试管为阴性对照&于(* i保温
(% MCE& $ #%% 27MCE 离 心 # MCE& 取 上 清 液& 于
#.% EM测定光吸收值 溶血活性与#.% EM光吸收
值成正比*5+
A?结果与讨论
AMC?黑眶蟾蜍皮肤抗菌肽的制备
黑眶蟾蜍皮肤分泌物乙酸浸提后经 0@A;3I@V
Q $#柱层析分离后显示有 $ 个峰#图 &$&第一峰蛋
白吸收峰为大分子物质& 第二峰的相对分子质量相
$$ 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
对较小&为小肽类物质&将 ($ j.# 管收集合并 经
过此步分离可去除试样中的大分子蛋白和小分子
盐类&得到黑眶蟾蜍皮肤分泌物中的小肽成分
图 C?黑眶蟾蜍皮肤分泌物凝胶层析曲线
T.;=C?,263J/:-42J5F2;45J271]./10:40F.2/2/
!09-5I0O %WA@
""根据黑眶蟾蜍皮肤分泌物凝胶层析曲线第二
峰的峰形推测&该峰可能为包含几种小肽组分的混
合物 目前除在树蛙#5>+8/9*6#* 0>+>;DJ92DDaC$的
皮肤分泌物中只分离出一种抗菌肽#92@[CECE1&$外&
其他的蛙科动物大多都可以合成和分泌多种有活
性的组分**+ 已经从梭蛙#5>-*/0+6"#+Z@6DEB@$的
皮肤分泌物中分离出 $$ 种抗菌肽&从东北林蛙
#5>8E&3+4#QqEB;@2$皮肤分泌物中分离出 &$ 种
抗菌肽*!+ 6DEJDE等*+预测&在大约# %%%种的两栖
类动物的皮肤分泌液中存在 &% 万种以上不同的抗
菌肽
AMA?抗菌活性
黑眶蟾蜍皮肤抗菌肽#终质量浓度& M47MZ$对
革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有一定的抑制作
用#表 &$ 由表 & 可知&对革兰氏阳性菌的抑制作
用较强&对金黄色葡萄球菌的抑菌率达到了
*%h#g 对革兰氏阴性菌中的嗜水气单胞菌的抑菌
率为 .#h*g&对溶藻弧菌(副溶血弧菌(河流弧菌(
大肠杆菌的抑菌率相对较弱&均不超过 (%g
将黑眶蟾蜍皮肤分泌物用胰蛋白酶水解后&测
定其抑制金黄色葡萄球菌的活性&发现其抑制活性
完全丧失&说明黑眶蟾蜍皮肤分泌物中含有的抑菌
活性成分为蛋白类物质
AMQ?抑菌活性的热稳定性
黑眶蟾蜍皮肤抗菌肽#终质量浓度& M47MZ$分
别在 (*(#%(*% 和# i下保温&其抑菌率变化见图
$ 由图 $ 可知&其抑菌率分别为 *%h5g(5h!g(
5*h$g(5$h.g&表明该抗菌肽具有较强的耐热性
表 C?黑眶蟾蜍皮肤抗菌肽对不同细菌的抑制率
D5H60C?)/-.H.F.2/45F01275/F.J.:42H.56909F.I01742J
1]./27;0<& )(/*1&+7#$70+2/I.7040/F625F04.5
菌株 抑菌率7g
金黄色葡萄球菌 *%h#
枯草芽孢杆菌 #.h*
副溶血弧菌 &.h$
溶藻弧菌 $&h*
河流弧菌 &#h
嗜水气单胞菌 .#h*
大肠杆菌 $!h5
图 A?温度对黑眶蟾蜍皮肤抗菌肽抑菌活性的影响
T.;=A?#70:F127F0J9045F3402/F-0
5/F.H5:F04.565:F.N.FG
AMQ?抑菌活性的酸稳定性
黑眶蟾蜍皮肤抗菌肽#终质量浓度& M47MZ$在
A+$h#((h%(.h% 和 #h% 的条件下保温后&考察其抑
菌率变化#图 ($ 由图 ( 可知&其抑菌率分别为
##h.g(#!h5g(5%h#g和 5(h$g&表明该抗菌肽具
有较强的耐酸性
图 Q?9"对黑眶蟾蜍皮肤抗菌肽抑菌活性的影响
T.;=Q?#70:F1279"2/F-05/F.H5:F04.565:F.N.FG
AMR?溶血活性
测定发现黑眶蟾蜍皮肤抗菌肽在终质量浓度
($"第 # 期 胡文婷等"黑眶蟾蜍皮肤抗菌肽的制备及其性质
小于5 M47MZ时&未观察到溶血活性 该质量浓度
远大于能观察到抑菌活性的质量浓度 当质量浓
度超过5 M47MZ时&具有轻微的溶血活性&且随剂量
的增加&溶血率也相应增加&故其溶血活性显现一
定的量效关系
Q?结?论
&$通过对黑眶蟾蜍皮肤分泌物的提取制备&得
到了其中的小肽成分 抑菌试验结果表明"黑眶蟾
蜍皮肤分泌物中的抗菌活性肽对革兰氏阳性菌和
革兰氏阴性菌均有抑制作用&对水产病害菌中嗜水
气单细胞菌也表现出较强的抑菌作用
$$将黑眶蟾蜍皮肤抗菌肽用胰蛋白酶水解后&
其抑制金黄色葡萄球菌活性完全丧失&说明黑眶蟾
蜍皮肤分泌物中含有的抑菌活性成分为蛋白类物
质 对该组分在不同的温度及酸性条件下保温后
检测其抗菌活性&其抑制细菌的活性变化不大&说
明该组分对温度及酸具有较好的耐受性 符合抗
菌肽的耐热及耐酸特点
($溶血试验表明&低质量浓度下黑眶蟾蜍皮肤
抗菌肽对真核生物的血细胞不具有溶解作用&这表
明它对真核细胞的损伤较小甚至可能没有损伤&使
用安全&为黑眶蟾蜍皮肤抗菌肽的开发应用奠定了
基础
.$通过浸提和凝胶层析将黑眶蟾蜍皮肤分泌
物中的小肽与其他物质进行了初步的分离&但是根
据 0@A;3I@VQ $#柱层析的峰形显示&推测所获得
的黑眶蟾蜍皮肤分泌物中的小肽为多种成分的混
合物&因此下一步工作准备将已获得的抗菌肽进一
步纯化&对其中包含的单一组分进行研究
参考文献"
*&+"姜丽丽&尚德静>中国林蛙皮肤抗菌肽抗菌的特性*S+>动物学
杂志& $%%.&(#5$"*%1*$>
SC3E4ZCJC& 0;3E4R@`CE4>PEBCMCL2D9C3J3LBC[CBHDFGaCE 3EBCMCL2D1
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A@ABCI@G2@J3B@I BD923IHaCECE 3EI E@K2DM@ICE ,CGDJ3B@I F2DMB;@
GaCE G@L2@BCDEGDFB;@ED2B; 3M@2CL3E
*+"6DEJDE Sb& cDJDI:C@`@a S& ,DNDBEH,>PEBCMCL2D9C3JA@ABCI@G
F2DMW3ECI F2D4G" B3VDEDMCL3EI A;HJD4@E@BCLM32a@2G3EI 3AD1
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