全 文 :第9卷第5期
2011年9月
生 物 加 工 过 程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
Vol.9No.5
Sep.2011
doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2011.05.008
收稿日期:2011-01-18
基金项目:国家自然科学基金资助项目(20876078);国家高技术研究发展计划(863计划)资助项目(2006AA020103,2006AA02Z240);NSFC广
东联合基金资助项目(U0733001)
作者简介:吕 浩(1970—),男,江苏南京人,硕士,高级工程师,研究方向:生物分离工程、酶工程;张红漫(联系人),副教授,Email:hmzhang@
njut.edu.cn
固定化纤维素酶对预处理纤维素原料水解效果的影响
吕 浩1,邢楠楠2,林增祥1,3,杜 健1,张红漫4
(1.南京工业大学 生物与制药工程学院,南京 210009;
2.大庆油田有限责任公司 供水公司水源开发研究所,大庆 163453;
3.中国科学院 上海高等技术研究院,上海 201203;4.南京工业大学 理学院,南京 210009)
摘 要:以壳聚糖为载体用交联法制备固定化纤维素酶,考察固定化纤维素酶对蒸爆、球磨、超声波、喷淋、高温预
处理玉米秸秆纤维素原料的酶解效果。结果表明:物料经蒸爆预处理后酶水解效率最高可以达到95%,球磨预处
理水解效率次之,达到60%。用电镜和FTIR对处理前后秸秆结构进行表征分析,证明预处理对物料的物理结构
及化学组成有一定的影响。蒸爆法和球磨法可以使物料致密的天然结构彻底破坏,从而增加物料的比表面积;蒸
爆预处理可以使纤维素内部氢键和官能团改变,使物料更易于酶解。
关键词:壳聚糖;水解;固定化;预处理;玉米秸秆
中图分类号:Q55 文献标志码:A 文章编号:1672-3678(2011)05-0038-05
Efectofimmobilizedcelulaseonevaluatinghydrolysis
eficiencyofpretreatedcelulosematerial
LHao1,XINGNannan2,LINZengxiang1,3,DUJian1,ZHANGHongman4
(1.ColegeofBiotechnologyandPharmaceuticalEngineering,NanjingUniversityofTechnology,Nanjing210009,China;
2.WaterSupplyCompanyWaterResourcesInstitute,DaqingOilfieldCo.Ltd.,Daqing163453,China;
3.ShanghaiAdvancedResearchInstitute,ChineseAcademyofSciences,Shanghai201203,China;
4.ColegeofScience,NanjingUniversityofTechnology,Nanjing210009,China)
Abstract:Celulasewasimmobilizedbychitosangelbeadsusingthecrosslinkingembeddingmethod.
Theimmobilizedenzymewasusedtohydrolyzecelulicmaterialcornstoverpretreatedbysteamexplo
sion,balmiling,ultrasonic,spray,andhightemperatureprocesses.Resultsshowedthatthesteamex
plosionpretreatmentcouldobtainthebestenzymatichydrolysiseficiency,glucoseyieldreached95%;
thebalmilwassecondtoit,glucoseyieldreached60%.Meanwhile,thecelulosestructuresbefore
andafterpretreatmentwerecharacterizedbyelectronmicroscopyandFTIR.Itindicatedthatthephysical
structureandchemicalcompositionofpretreatedmaterialschangedsignificantly.Thesteamexplosion
methodandthebalmilingmethodcouldmakethenaturalstructureofthematerialcompletelydestroy
thusincreasingthesurfacearea.Theinternalhydrogenbondsandfunctionalgroupsofcelulosehadbeen
changedduringthecourseofsteamexplosion,itcausedthematerialmoreeasilytobehydrolized.
Keywords:chitosan;hydrolysis;immobilized;pretreatment;cornstover
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纤维素原料经过水解糖化、发酵,可以转化为
生物燃料、生物材料等各类化学品。限制纤维素生
物转化的主要因素就是木质纤维类原料的水解率
低及酶的成本较高,导致其经济竞争性不强,这也
是当前主要的研究难点和重点[1-4]。
木质纤维中纤维素、半纤维素和木质素通过共
价键或非共价键紧密结合在一起,以及纤维素本身
的结晶结构,使得纤维素酶和半纤维素酶难以触及
水解。预处理可部分去除木质素和半纤维素等成
分,破坏纤维素的结晶结构,增加生物质材料的多
孔性,增加酶和原料的接触面积,提高酶的可及
性,从而提高水解效率,缩短反应时间和降低生产
成本。目前常用的预处理方法有机械粉碎[5]、蒸汽
爆破[3,6]、超声波处理[7-8]、稀酸喷淋[9]、液态高温
水处理[9]、稀酸处理[9]等。纤维素原料的酶解糖化
过程是整个工艺过程中的关键环节之一,利用纤维
素酶水解纤维素原料,条件温和、专一性强、水解
效率高,是理想的水解方法。但实际上纤维素酶价
格昂贵、消耗量大、成本高,针对这一问题,采用固
定化技术将纤维素酶固定在载体上,可以达到简化
工艺、降低成本的目的[10-12]。
笔者所在课题组目前已经对固定化纤维素酶
的制备,以及固定化纤维素酶的性质进行了相应的
研究与应用[5,12-14]。笔者在前期研究基础上,进一
步考察固定化纤维素酶对预处理之后玉米秸秆作
为底物的酶水解效果。
1 材料与方法
11 材料
ZSL 1300纤维素酶(山东泽生生物科技有限
公司);玉米秸秆原料组分含量:纤维素378%,半
纤维素281%,木质素183%;壳聚糖(脱乙酰度≥
900%);3,5 二硝基水杨酸(DNS),化学纯(百灵
威科技有限公司);其他试剂均为分析纯。
12 仪器
752型紫外可见分光光度计(上海精密科学仪
器有限公司);SBA 40C型生物传感分析仪(山东
省科学院生物研究所);DSHZ 300A型旋转式恒温
振荡器(太仓市实验设备厂);BT00 300M型蠕动
泵(保定兰格恒流泵有限公司);傅立叶红外光谱仪
(Avatar360),美国Nicolet公司。
13 壳聚糖载体的制备
用质量分数为2%的醋酸溶液配制质量浓度为
25g/L的壳聚糖溶液,用此壳聚糖溶液滴入成型剂
内形成直径约为40mm的载体小球。成型剂为体
积分数30%的乙醇溶液与质量分数10%的 NaOH
溶液配制成的混合溶液。载体制作过程设备装置
图参照文献[14],将制好的载体用水冲洗至 pH呈
中性,加入体积分数5%的戊二醛溶液。室温静置
过夜后,将小球漂洗数次。加入泽生原酶液,静置
11h后用水漂洗,待用。
14 原料预处理
原料预处理方法经过优化分析后,采用最优的
预处理条件,具体步骤与条件参数为1)蒸汽爆破预
处理:玉米秸秆在蒸爆机内204℃、17MPa维压5
min;2)球磨预处理:原料粒径05mm,转速340r/min,
原料量3400g,装球量15个(Ф=100mm),交替时间
5min;3)超声波预处理:时间14min,功率880W,底
物15%(质量分数),原料粒径135mm;4)高温预
处理:秸秆原料与水的固液比为1∶18(g/mL),温度
180℃,10min;5)稀酸喷淋预处理条件:10%
H2SO4,10∶1(mL/g)的固液比,90℃,90min
[15-16]。
15 酶解
按照酶解体系,秸秆底物质量分数为10%,称取
预处理后的原料,装入100mL三角瓶中,加入一定量
的005mol/L柠檬酸缓冲液(pH48),以预处理玉
米秸秆质量(1g)为基准,分别按15U的酶量加入固
定化纤维素酶,置50℃的恒温振荡器中酶解,定点取
样,酶解液离心取上清液测糖含量(g/L)。
酶解液总糖浓度的测定:采用DNS显色法。将
酶解液离心,取上清液1mL,加入3mLDNS沸水浴
5min,冷却后定容至25mL,于550nm波长处测量
其吸光度值。
酶解液葡萄糖质量浓度用生物传感分析仪
测定。
16 秸秆原料纤维结构形态分析
光学显微镜观察:利用光学显微镜技术直接
观察纤维素原料天然形态结构,可以直接反映原
料在酶解体系中的真实物性状态,取预处理后的
秸秆原料,在水溶液中悬浮置载玻片上,加盖盖玻
片,置 LeicaDM1000显微镜,40倍 放 大 进 行
观察[17]。
17 纤维素原料红外光谱分析
利用傅里叶红外光谱仪[18],分析纤维素和糖类
的功能基及结构的变化规律。
93 第5期 吕 浩等:固定化纤维素酶对预处理纤维素原料水解效果的影响
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2 结果与讨论
21 预处理方法对固定化纤维素酶水解的影响
秸秆原料经过不同预处理后用固定化纤维素
酶水解,在相同的酶解条件下,酶解液中葡萄糖质
量浓度和总糖质量浓度如图 1、图 2所示。由图 1
和图2可知:不同的预处理方法对原料的酶解效率
影响不同,纤维素酶解糖化率最高的是蒸爆法预处
理,其他依次为球磨法预处理、超声波预处理、高温
预处理和喷淋预处理。
图1 预处理方法对秸秆原料酶解效果的影响(葡萄糖)
Fig.1 Efectsofpretreatmentmethodsonenzymatic
hydrolysisofcornstover(glucose)
图2 预处理方法对秸秆原料酶解效果的影响(总糖)
Fig.2 Efectsofpretreatmentmethodsonenzymatic
hydrolysisofcornstover(totalsugar)
由图 1、图 2可以看出:蒸爆处理酶解效果最
好,主要原因是蒸爆预处理方法在高温高压条件下
不仅将纤维素致密的天然结构彻底破坏,将细胞纤
维内纤维素的氢键和酯键破坏,增加其孔径和孔
穴,同时使其暴露出更多的游离羟基等亲水性基
团,使得物料更容易被酶解。而且固定化纤维素酶
不同于游离纤维素酶,其催化活性位点在固定化载
体表面,蒸爆处理后的原料与载体表面具有更大的
接触面积,从而更有利于原料酶解。
22 秸秆原料纤维结构形态分析
图3是经过不同预处理的秸秆原料40倍放大
图片。由图3可以看出:未经过球磨处理的原料天
然结构致密,通过高温预处理、喷淋预处理后的纤
维素原料表观形态没有发生显著的变化。经过蒸
汽爆破处理后得到的原料都变成松散的细纤维,原
有致密的天然纤维束结构彻底打碎,原料比表面积
大大增加。经过球磨处理后变为松散的状态,这表
明原料经过球磨机的挤压碾磨过程之后,原有致密
的纤维束被破坏了,结构变得更加松散,纤维素的
比表面积大大增加,原料的酶解率大为提高。超声
波处理后秸秆发生了明显的细纤维化作用,纤维细
胞壁上微纤维暴露,纤维表面起毛、分丝帚化,分离
出大量的细小纤维,并可观察到微纤维被超声波冲
散分开成单根或丝束。
23 预处理原料的FTIR分析
由于秸秆中纤维素的官能团和化学键在红外
光谱中的特定频率可以参照文献[17],因此通过红
外光谱可以分析纤维素中存在的官能团以及它们
在预处理前后的变化。预处理前后玉米秸秆中纤
维素的红外光谱图见图4。
参照木质纤维素的红外光谱特征吸收峰及其对
照结构图谱表[17],比较图4中不同预处理的秸秆原
料FTIR谱图可知:预处理秸秆原料在3400cm-1处
可以明显地看出,氢键的吸收峰是依次减弱的,这表
明氢键的结合力是依次减弱的。1600~870cm-1处
的共振峰可以用来研究和区分纤维素变体的晶形,在
1160cm-1附近是纤维素的—C—O—C的不对称伸
缩振动吸收峰,在1318cm-1附近是纤维素和半纤维
素的—C—H振动吸收峰,在895cm-1附近是糖苷键
振动的特征峰。
蒸爆预处理玉米秸秆 FTIR图谱可以看出:秸
秆在在1730cm-1处有吸收峰,这里主要是聚木糖
的— C O伸展振动,经蒸爆后的玉米秸秆随压力
增加在此处的吸收峰大大减弱,说明蒸汽爆破与高
温预处理对去除半纤维素有着明显作用。波数
1000~1630cm-1范围为纤维素和木质素的
—C—O和—CH2基团特征峰,有不同程度的增加,
说明高温使得部分溶出的木质素同半纤维素的重
新形成了类木质素物质。此处的纤维素基团也随
保压时间增加而增加,因此其在此处的吸光度增
加。相同的保压时间下,虽然在1641、1562、1062
和786cm-1附近芳香核和木质素红外特征吸收峰
04 生 物 加 工 过 程 第9卷
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在1512和1641cm-1特征峰增强,但随着压力的提
高增幅却在降低。说明芳香环随压力升高而减少,
也就是木质素会减少。660、559、528和466cm-1处
的吸收峰减弱,说明高压下处理后小分子物质减
少,这可能是部分木质素高压下部分醚键断裂,反
应活性增强,与降解的半纤维素形成了腐殖酸类物
质(与木质素不可分)的结果。1421cm-1纤维素特
征吸收峰增强,896cm-1附近是 β D 葡萄糖苷特
征吸收峰,此处的吸收峰随着压力的增加吸收峰减
弱,这说明纤维素在汽爆过程中结构变化不大[19]。
图3 秸秆原料经不同方法预处理后的纤维结构显微镜图(×40)
Fig.3 Micromorphologyofcornstoverpretreatedbydiferentmethods(×40)
图4 秸秆预处理前后红外光谱
Fig.4 FTIRspectraofpretreatedcornstover
3 结论
1)不同的预处理方法对原料的酶解效率影响
不同,酶解糖化率最高的是蒸爆法预处理,其次为
球磨法预处理、超声波预处理、高温预处理和喷淋
预处理。
2)处理对物料的物理结构及化学组成有一定
的影响,蒸爆法和球磨法可以使物料致密的天然结
构彻底破坏从而增加物料的比表面积,蒸爆预处理
可以使纤维素内部氢键和官能团改变使物料更易
于酶解。
参考文献:
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櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒
104107.
国外动态
日本科学家发现基因开关可决定生殖细胞性别
动物的生殖细胞与体细胞不同,有雌雄之别,可分为精子和卵子2种。由于生殖细胞是在移动到卵巢和
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基因是决定生殖细胞性别的“开关”。原始生殖细胞在移动到卵巢或精巢前,已经有了差异,SxL的基因决定
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(胡晓丽)
24 生 物 加 工 过 程 第9卷
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