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Effect of immobilized cellulase on evaluating hydrolysis efficiency of pretreated cellulose material

固定化纤维素酶对预处理纤维素原料水解效果的影响



全 文 :第9卷第5期
2011年9月
生 物 加 工 过 程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
Vol.9No.5
Sep.2011
doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2011.05.008
收稿日期:2011-01-18
基金项目:国家自然科学基金资助项目(20876078);国家高技术研究发展计划(863计划)资助项目(2006AA020103,2006AA02Z240);NSFC广
东联合基金资助项目(U0733001)
作者简介:吕 浩(1970—),男,江苏南京人,硕士,高级工程师,研究方向:生物分离工程、酶工程;张红漫(联系人),副教授,Email:hmzhang@
njut.edu.cn
固定化纤维素酶对预处理纤维素原料水解效果的影响
吕 浩1,邢楠楠2,林增祥1,3,杜 健1,张红漫4
(1.南京工业大学 生物与制药工程学院,南京 210009;
2.大庆油田有限责任公司 供水公司水源开发研究所,大庆 163453;
3.中国科学院 上海高等技术研究院,上海 201203;4.南京工业大学 理学院,南京 210009)
摘 要:以壳聚糖为载体用交联法制备固定化纤维素酶,考察固定化纤维素酶对蒸爆、球磨、超声波、喷淋、高温预
处理玉米秸秆纤维素原料的酶解效果。结果表明:物料经蒸爆预处理后酶水解效率最高可以达到95%,球磨预处
理水解效率次之,达到60%。用电镜和FTIR对处理前后秸秆结构进行表征分析,证明预处理对物料的物理结构
及化学组成有一定的影响。蒸爆法和球磨法可以使物料致密的天然结构彻底破坏,从而增加物料的比表面积;蒸
爆预处理可以使纤维素内部氢键和官能团改变,使物料更易于酶解。
关键词:壳聚糖;水解;固定化;预处理;玉米秸秆
中图分类号:Q55    文献标志码:A    文章编号:1672-3678(2011)05-0038-05
Efectofimmobilizedcelulaseonevaluatinghydrolysis
eficiencyofpretreatedcelulosematerial
LHao1,XINGNannan2,LINZengxiang1,3,DUJian1,ZHANGHongman4
(1.ColegeofBiotechnologyandPharmaceuticalEngineering,NanjingUniversityofTechnology,Nanjing210009,China;
2.WaterSupplyCompanyWaterResourcesInstitute,DaqingOilfieldCo.Ltd.,Daqing163453,China;
3.ShanghaiAdvancedResearchInstitute,ChineseAcademyofSciences,Shanghai201203,China;
4.ColegeofScience,NanjingUniversityofTechnology,Nanjing210009,China)
Abstract:Celulasewasimmobilizedbychitosangelbeadsusingthecrosslinkingembeddingmethod.
Theimmobilizedenzymewasusedtohydrolyzecelulicmaterialcornstoverpretreatedbysteamexplo
sion,balmiling,ultrasonic,spray,andhightemperatureprocesses.Resultsshowedthatthesteamex
plosionpretreatmentcouldobtainthebestenzymatichydrolysiseficiency,glucoseyieldreached95%;
thebalmilwassecondtoit,glucoseyieldreached60%.Meanwhile,thecelulosestructuresbefore
andafterpretreatmentwerecharacterizedbyelectronmicroscopyandFTIR.Itindicatedthatthephysical
structureandchemicalcompositionofpretreatedmaterialschangedsignificantly.Thesteamexplosion
methodandthebalmilingmethodcouldmakethenaturalstructureofthematerialcompletelydestroy
thusincreasingthesurfacearea.Theinternalhydrogenbondsandfunctionalgroupsofcelulosehadbeen
changedduringthecourseofsteamexplosion,itcausedthematerialmoreeasilytobehydrolized.
Keywords:chitosan;hydrolysis;immobilized;pretreatment;cornstover
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  纤维素原料经过水解糖化、发酵,可以转化为
生物燃料、生物材料等各类化学品。限制纤维素生
物转化的主要因素就是木质纤维类原料的水解率
低及酶的成本较高,导致其经济竞争性不强,这也
是当前主要的研究难点和重点[1-4]。
  木质纤维中纤维素、半纤维素和木质素通过共
价键或非共价键紧密结合在一起,以及纤维素本身
的结晶结构,使得纤维素酶和半纤维素酶难以触及
水解。预处理可部分去除木质素和半纤维素等成
分,破坏纤维素的结晶结构,增加生物质材料的多
孔性,增加酶和原料的接触面积,提高酶的可及
性,从而提高水解效率,缩短反应时间和降低生产
成本。目前常用的预处理方法有机械粉碎[5]、蒸汽
爆破[3,6]、超声波处理[7-8]、稀酸喷淋[9]、液态高温
水处理[9]、稀酸处理[9]等。纤维素原料的酶解糖化
过程是整个工艺过程中的关键环节之一,利用纤维
素酶水解纤维素原料,条件温和、专一性强、水解
效率高,是理想的水解方法。但实际上纤维素酶价
格昂贵、消耗量大、成本高,针对这一问题,采用固
定化技术将纤维素酶固定在载体上,可以达到简化
工艺、降低成本的目的[10-12]。
  笔者所在课题组目前已经对固定化纤维素酶
的制备,以及固定化纤维素酶的性质进行了相应的
研究与应用[5,12-14]。笔者在前期研究基础上,进一
步考察固定化纤维素酶对预处理之后玉米秸秆作
为底物的酶水解效果。
1 材料与方法
11 材料
  ZSL 1300纤维素酶(山东泽生生物科技有限
公司);玉米秸秆原料组分含量:纤维素378%,半
纤维素281%,木质素183%;壳聚糖(脱乙酰度≥
900%);3,5 二硝基水杨酸(DNS),化学纯(百灵
威科技有限公司);其他试剂均为分析纯。
12 仪器
  752型紫外可见分光光度计(上海精密科学仪
器有限公司);SBA 40C型生物传感分析仪(山东
省科学院生物研究所);DSHZ 300A型旋转式恒温
振荡器(太仓市实验设备厂);BT00 300M型蠕动
泵(保定兰格恒流泵有限公司);傅立叶红外光谱仪
(Avatar360),美国Nicolet公司。
13 壳聚糖载体的制备
  用质量分数为2%的醋酸溶液配制质量浓度为
25g/L的壳聚糖溶液,用此壳聚糖溶液滴入成型剂
内形成直径约为40mm的载体小球。成型剂为体
积分数30%的乙醇溶液与质量分数10%的 NaOH
溶液配制成的混合溶液。载体制作过程设备装置
图参照文献[14],将制好的载体用水冲洗至 pH呈
中性,加入体积分数5%的戊二醛溶液。室温静置
过夜后,将小球漂洗数次。加入泽生原酶液,静置
11h后用水漂洗,待用。
14 原料预处理
  原料预处理方法经过优化分析后,采用最优的
预处理条件,具体步骤与条件参数为1)蒸汽爆破预
处理:玉米秸秆在蒸爆机内204℃、17MPa维压5
min;2)球磨预处理:原料粒径05mm,转速340r/min,
原料量3400g,装球量15个(Ф=100mm),交替时间
5min;3)超声波预处理:时间14min,功率880W,底
物15%(质量分数),原料粒径135mm;4)高温预
处理:秸秆原料与水的固液比为1∶18(g/mL),温度
180℃,10min;5)稀酸喷淋预处理条件:10%
H2SO4,10∶1(mL/g)的固液比,90℃,90min
[15-16]。
15 酶解
  按照酶解体系,秸秆底物质量分数为10%,称取
预处理后的原料,装入100mL三角瓶中,加入一定量
的005mol/L柠檬酸缓冲液(pH48),以预处理玉
米秸秆质量(1g)为基准,分别按15U的酶量加入固
定化纤维素酶,置50℃的恒温振荡器中酶解,定点取
样,酶解液离心取上清液测糖含量(g/L)。
  酶解液总糖浓度的测定:采用DNS显色法。将
酶解液离心,取上清液1mL,加入3mLDNS沸水浴
5min,冷却后定容至25mL,于550nm波长处测量
其吸光度值。
  酶解液葡萄糖质量浓度用生物传感分析仪
测定。
16 秸秆原料纤维结构形态分析
  光学显微镜观察:利用光学显微镜技术直接
观察纤维素原料天然形态结构,可以直接反映原
料在酶解体系中的真实物性状态,取预处理后的
秸秆原料,在水溶液中悬浮置载玻片上,加盖盖玻
片,置 LeicaDM1000显微镜,40倍 放 大 进 行
观察[17]。
17 纤维素原料红外光谱分析
  利用傅里叶红外光谱仪[18],分析纤维素和糖类
的功能基及结构的变化规律。
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2 结果与讨论
21 预处理方法对固定化纤维素酶水解的影响
  秸秆原料经过不同预处理后用固定化纤维素
酶水解,在相同的酶解条件下,酶解液中葡萄糖质
量浓度和总糖质量浓度如图 1、图 2所示。由图 1
和图2可知:不同的预处理方法对原料的酶解效率
影响不同,纤维素酶解糖化率最高的是蒸爆法预处
理,其他依次为球磨法预处理、超声波预处理、高温
预处理和喷淋预处理。
图1 预处理方法对秸秆原料酶解效果的影响(葡萄糖)
Fig.1 Efectsofpretreatmentmethodsonenzymatic
hydrolysisofcornstover(glucose)
图2 预处理方法对秸秆原料酶解效果的影响(总糖)
Fig.2 Efectsofpretreatmentmethodsonenzymatic
hydrolysisofcornstover(totalsugar)
  由图 1、图 2可以看出:蒸爆处理酶解效果最
好,主要原因是蒸爆预处理方法在高温高压条件下
不仅将纤维素致密的天然结构彻底破坏,将细胞纤
维内纤维素的氢键和酯键破坏,增加其孔径和孔
穴,同时使其暴露出更多的游离羟基等亲水性基
团,使得物料更容易被酶解。而且固定化纤维素酶
不同于游离纤维素酶,其催化活性位点在固定化载
体表面,蒸爆处理后的原料与载体表面具有更大的
接触面积,从而更有利于原料酶解。
22 秸秆原料纤维结构形态分析
  图3是经过不同预处理的秸秆原料40倍放大
图片。由图3可以看出:未经过球磨处理的原料天
然结构致密,通过高温预处理、喷淋预处理后的纤
维素原料表观形态没有发生显著的变化。经过蒸
汽爆破处理后得到的原料都变成松散的细纤维,原
有致密的天然纤维束结构彻底打碎,原料比表面积
大大增加。经过球磨处理后变为松散的状态,这表
明原料经过球磨机的挤压碾磨过程之后,原有致密
的纤维束被破坏了,结构变得更加松散,纤维素的
比表面积大大增加,原料的酶解率大为提高。超声
波处理后秸秆发生了明显的细纤维化作用,纤维细
胞壁上微纤维暴露,纤维表面起毛、分丝帚化,分离
出大量的细小纤维,并可观察到微纤维被超声波冲
散分开成单根或丝束。
23 预处理原料的FTIR分析
  由于秸秆中纤维素的官能团和化学键在红外
光谱中的特定频率可以参照文献[17],因此通过红
外光谱可以分析纤维素中存在的官能团以及它们
在预处理前后的变化。预处理前后玉米秸秆中纤
维素的红外光谱图见图4。
  参照木质纤维素的红外光谱特征吸收峰及其对
照结构图谱表[17],比较图4中不同预处理的秸秆原
料FTIR谱图可知:预处理秸秆原料在3400cm-1处
可以明显地看出,氢键的吸收峰是依次减弱的,这表
明氢键的结合力是依次减弱的。1600~870cm-1处
的共振峰可以用来研究和区分纤维素变体的晶形,在
1160cm-1附近是纤维素的—C—O—C的不对称伸
缩振动吸收峰,在1318cm-1附近是纤维素和半纤维
素的—C—H振动吸收峰,在895cm-1附近是糖苷键
振动的特征峰。
  蒸爆预处理玉米秸秆 FTIR图谱可以看出:秸
秆在在1730cm-1处有吸收峰,这里主要是聚木糖
的— C O伸展振动,经蒸爆后的玉米秸秆随压力
增加在此处的吸收峰大大减弱,说明蒸汽爆破与高
温预处理对去除半纤维素有着明显作用。波数
1000~1630cm-1范围为纤维素和木质素的
—C—O和—CH2基团特征峰,有不同程度的增加,
说明高温使得部分溶出的木质素同半纤维素的重
新形成了类木质素物质。此处的纤维素基团也随
保压时间增加而增加,因此其在此处的吸光度增
加。相同的保压时间下,虽然在1641、1562、1062
和786cm-1附近芳香核和木质素红外特征吸收峰
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在1512和1641cm-1特征峰增强,但随着压力的提
高增幅却在降低。说明芳香环随压力升高而减少,
也就是木质素会减少。660、559、528和466cm-1处
的吸收峰减弱,说明高压下处理后小分子物质减
少,这可能是部分木质素高压下部分醚键断裂,反
应活性增强,与降解的半纤维素形成了腐殖酸类物
质(与木质素不可分)的结果。1421cm-1纤维素特
征吸收峰增强,896cm-1附近是 β D 葡萄糖苷特
征吸收峰,此处的吸收峰随着压力的增加吸收峰减
弱,这说明纤维素在汽爆过程中结构变化不大[19]。
图3 秸秆原料经不同方法预处理后的纤维结构显微镜图(×40)
Fig.3 Micromorphologyofcornstoverpretreatedbydiferentmethods(×40)
图4 秸秆预处理前后红外光谱
Fig.4 FTIRspectraofpretreatedcornstover
3 结论
  1)不同的预处理方法对原料的酶解效率影响
不同,酶解糖化率最高的是蒸爆法预处理,其次为
球磨法预处理、超声波预处理、高温预处理和喷淋
预处理。
  2)处理对物料的物理结构及化学组成有一定
的影响,蒸爆法和球磨法可以使物料致密的天然结
构彻底破坏从而增加物料的比表面积,蒸爆预处理
可以使纤维素内部氢键和官能团改变使物料更易
于酶解。
参考文献:
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104107.
国外动态
日本科学家发现基因开关可决定生殖细胞性别
动物的生殖细胞与体细胞不同,有雌雄之别,可分为精子和卵子2种。由于生殖细胞是在移动到卵巢和
精巢后才分化为卵子和精子,这种性别差异产生的过程令人很感兴趣。日本自然科学研究机构基础生物学
研究所小林悟研究小组在《科学》杂志网络版上发表论文说,他们通过对果蝇的研究发现,一个名为 SxL的
基因是决定生殖细胞性别的“开关”。原始生殖细胞在移动到卵巢或精巢前,已经有了差异,SxL的基因决定
了这种差异。SxL是已知的果蝇体内与性别相关的基因。研究小组确认:抑制SxL基因的表达,原始生殖细
胞就会朝着精子的方向发育;反之,这个基因如果得到表达,原始生殖细胞会向着卵细胞的方向发育。哪怕
是雄性果蝇的原始生殖细胞,如果SxL基因得到充分表达,也会发育成卵原细胞,移植到雌性果蝇卵巢后会
继续发育成有效的卵细胞,这一发现将来也许能够用于控制生殖细胞的性别。
金纳米粒子为肿瘤的治疗带来希望
Southampton大学物理学讲师AntoniosKanaras博士率领的研究小组已经开发出了肽功能化的金纳米材
料,它可以破坏癌肿瘤的血液供应。小剂量的金纳米粒子可以激活或抑制参与血管生成相关基因,这是一
个为大多数类型的癌症供应氧气和营养物质的复杂过程,金颗粒可作为细胞显微外科的有效工具,通过应
用激光照射,可以使用纳米粒子破坏血管内皮细胞,这是切断肿瘤血液供应的一项措施,或故意打开细胞膜
以有效地传递药物。
(胡晓丽)
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