全 文 ：第6卷第1期
2008年1月
生物加工过程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
Jan．2008
·27·
argE基因在大肠杆菌中的表达优化
朱大伟，李 环，韦 萍
(南京工业大学 制药与生命科学学院，南京210009)
摘要：N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶可在重组茵B121(DE3)一pET22b-argE中表达。首先确定了该酶的细胞表达定位，
再研究了诱导温度、诱导荆种类及浓度、诱导起始茵体密度、诱导时间等因素对重组茵生长及目的蛋白表达活性的
影响。结果表明，IPTG和乳糖皆可诱导目的蛋白表达，乳耱的诱导效果优于IPTG。在诱导起始0_D‰为O．46时加
入15∥L乳糖，20℃诱导18h最适于目的蛋白的活性表达。表达条件优化后，酶活从1．68U／mL提高至282．99
U／mL。约为原来的168倍。
关键词：argE基因；g-达；诱导剂；优化
中图分类号：Q55 文献标识码：A 文章编号：1672—3678(2008)01—0027一05
Optimizationof hexpressionofargEgeneinE．coli
ZHUDa-wei，LIHuan，WEIPing
(CollegeofLifeScienceandPhammceuticalEngineering，N,mjingUniversityofTechnology，52ing210009，China)
Abstract：N-acetylornithinedeaeetylasewagexpressedinrecombinantbacteriaBL21(DE3)一pET22b·
argE．ThelocationofthetargetproteinWagdetermined．Theffectsofinductionemperature，typeofin—
ducerconcentrationofinducer，initialcelldensity，inductiontimeontheactivityexpressionofthetarget
proteinwerestudied．TheresultsshowedthatbothIPTGandlactosecouldbeinducers，andthei uction
effectoflactosewasbetterthanthatofIPTG．Withtheoptimizedactiveinducingco ditionofadding15
g／Llactoseatinitiated0D鲫of0．46andcultivatingfor18hat20℃，theNAOaseactivityWagin—
creasedby168foldsfrominitial1．68U／mLto182．99U／mL．
Keywords：argEgene；expression；inducer；optimization
氨基酰化酶(aminoaeylage，EC3．5．1．14)为十
大常用酶系之一，主要用于氨基酸的立体拆分，常
见来源为猪肾及米曲霉。猪肾中的酰化酶提取过
程复杂，酶含量及活力较低，且来源受到较大限制。
米曲霉所产的氨基酰化酶为胞外分泌，提取较为简
单，但需浓缩。酶活数量级约在104—105U／g干菌
丝体，发酵周期约60一72h。现已有固定化氨基酰
化酶用于大规模生产部分￡-氨基酸的报道。
大肠杆菌argE编码的Ⅳ-乙酰鸟氨酸脱酰基酶
(N-acetylomithinedeaeetylase，简称NAOase；EC3．5．
1．16)同样具有立体拆分氨基酸的功能，且具有广泛
的底物特异性¨屯J，但和氨基酰化酶相比，对该酶的
研究报道却屈指可数，应用更是空白。国外文献主要
报道了NAOase的纯化、酶学性质及底物特异性u。5】、
基因序列及相应氨基酸组成№。7J、对金属离子的依赖
性、酶的亚基数目旧’5o等方面内容。而国内无相关报
收稿日期：2007-04—16
基金项目：国家973课题资助项目(2003CB7160004)
作者简介：朱大伟(1982一)。女。江苏连云港人，助教，项士研究生，研究方向：酶工程。
联系人：李环，女，副教授，E-mail：lihuaM5678@163．coin
万方数据
·28· 生物加工过程 第6卷第1期
道。另对该酶的研究还具有重要的理论、农林及医药
研究价值㈨。基于此研究背景，本实验以pET22b
(+)为表达载体，构建了可表达NAOase的重组菌
B121(DE3)一pET22b—argE，系统考察了各种因素对
argE基因在LB培养基中表达的影响。
1材料与方法
1．1主要试剂及原料处理
进口蛋白胨，酵母膏(Oxoid公司)；国产蛋白
胨，酵母膏，牛肉膏(中国医药(集团)上海化学试剂
公司)；其余试剂为能够得到的最大纯度产品。
拆分底物Ⅳ-乙酰D，￡．蛋氨酸为四川同晟氨基
酸有限公司产品，纯度>98％，茚三酮显色实验呈阳
性。由于酶活力测定为茚三酮显色法，故需精制去
除底物中残存的蛋氨酸。具体方法为冷水洗涤拆
分底物，过滤取沉淀，再洗涤至上清无色，加适量蒸
馏水加热溶解沉淀，4℃放置至晶体析出。倾去母
液，冷丙酮洗涤沉淀，真空抽滤，低温烘干。以
1．0％的茚三酮乙醇溶液作显色检验，证实无残余蛋
氨酸后作为酶拆分底物。使用时以50mmol／L的磷
酸缓冲液(pH6．98)配成0．06mol／L的溶液，再加
入终浓度为1mmol／L的CoCI，。
1．2实验菌种
基因工程菌B121(DE3)-pET22b—argE，目的基因
argE，表达载体pET22b，T7启动子，表达产物为Ⅳ_乙
酰鸟氨酸脱酰基酶(NAOase)，氨苄抗性。南京工业
大学制药与生命科学学院菌种室自己构建。挑单克
隆，筛选活力最高者作为出发菌株，使用前活化。
1．3培养基
保藏及发酵基础培养基皆为含50斗g／mL羧苄
青霉素的LB培养基。
1．4培养条件
新鲜活化菌种接种于发酵培养基，装液量为
100mL的三角瓶中装15mL。37℃，150r／min振
荡培养2．5h后，加入诱导剂诱导过夜。取样测生
物量、酶活及表达量。重复实验，规律稳定无异常
后作为实验数据。
1．5分析方法
1．5．1菌体生长的生物量
稀释10倍后采用比色法，用DU-650分光光度
计测定D‰。以灭菌后的培养基作为空白。
1．5．2酶的表达量及细胞表达定位
发酵液离心，离心上清，菌体，细胞质可溶部分及
不溶组分经适当处理后分别进行10．0％SDS．PAGE
分析哺J，以确定目的蛋白的细胞表达位置。采用Bio—
Rad凝胶成像系统及Ban&can软件测定重组NAOase
的表达量(目的蛋白占整菌蛋白的百分比)。
1．5．3 目的蛋白的活性测定
茚三酮比色法∽o测蛋白活性。发酵液离心尽
量去除上清，菌泥以0．05mol／L磷酸缓冲液重悬，
适当稀释后制成菌悬液。取菌悬液0．1mL和0．06
mol／L的乙酰蛋氨酸0．9mL于37℃水浴反应30
min。冰水冷却后，迅速加入1mL乙酸缓冲液和1
mL茚三酮显色液，煮沸15min以充分显色。冷却
后以60％的乙醇适当稀释后测其570nm处光吸收
值，由蛋氨酸的标准曲线计算酶转化所生成的蛋氨
酸的量。由于酶分子、菌本身中所含氮及试剂中微
量氮皆会干扰茚三酮显色，样品不同干扰也不尽相
同，故每个样品皆需做空白实验。以零转化时间的
样品同样操作作为空白。
酶活单位定义为在37℃和pH6．98条件下，催
化生成1¨mol的L-Met所需要的酶量。酶的比酶
活定义为每毫升发酵液每小时催化生成L．Met的
Ixmol数o
2结果与讨论
2．1 argE基因的细胞表达定位
活化后的菌种接种于LB发酵培养基，37℃，
150r／min振荡培养3h后，加入1mmol／L的IPTG
在37℃，180r／rain诱导过夜。此时pH6．5～7．O，
OD约3．6，表达量约18％，酶活为1．68U／mL发酵
液。再根据pETSystemMannual旧J，分析目的蛋白
在细胞内外的表达位置。分别对菌体，菌体的培养
外液、细胞质可溶部分(超声上清)及不溶组分(超
声沉淀部分)经适当处理后进行10．O％SDS．PAGE
电泳分析，结果见图1。
从图1可以看出，目的基因在重组菌中为细胞
内表达，且大多不溶存在于超声沉淀中。结合表达
量及酶活测定结果，高的表达量而低酶活，单位表
达量的活性极低，说明在该诱导条件下只有少量目
的蛋白以有活性的可溶性胞质形式表达。这可能
由于pET表达系统强的启动子和较高的诱导温度
导致目的蛋白的表达速度过快，来不及正确加工及
折叠所致。在重组菌构建完毕的情况下，只能改变
万方数据
2008年1月 朱大伟等：argE基因在大肠杆菌中的表达优化 ·29·
1—全细胞蛋白；2一超声上清；3一超声沉淀；4一发酵液上清
图l argE基因的表达分析
Fig．1ExpressionanalysisofargEgene
诱导条件来控制表达速度，故考虑降低诱导温度及
诱导剂用量。
2．2诱导温度的影响
先考察诱导温度对目的蛋白表达及可溶性
的影响。同2．1操作，诱导温度分别降低为30，
20。16及12℃，离心取菌体，测重组菌的生物量
及酶活，并与37℃相比较，结果如图2所示。可
以看出，随诱导温度的增加，重组菌的生物量逐
渐增大，到30℃后增幅缓慢。而酶活曲线的规
律明显不同于生长曲线，在20℃出现最大值，达
到69．67U／mL，温度再高则出现高生物量而低
酶活的情况。所有考察范围的酶活均高于37℃
时的1．68U／mL。这表明降低诱导温度可有效降
低表达速度，从而提高可溶性活性表达的比例。
图2诱导温度对重组菌生物量及酶活的影响
Fig．2EffectsofinductionemperaturesOll
biomassndNAOaseactivity
o
龟
●
已
蜒
溢
为进一步考察诱导温度对重组NAOase的整菌
表达量及可溶和不可溶表达部分比例的影响，分别
对不同温度下的整菌蛋白及超声上清(细胞质可
溶)和沉淀部分(不可溶)进行SDS—PAGE电泳，结
果(图3)表明高的诱导温度利于重组NAOase总量
的表达，而不利于活性表达。诱导温度越高，重组
NAOase酶的整菌表达量越大，活性表达的比例越
小，以不可溶的包涵体形式表达的比例越大。该结
论和酶活测定结果相吻合。
图中字母含义：C一超声沉淀；S一超声上清
图3诱导温度对重组NAOase表达的影响
Fig．3EffectsofinductiontemperaturesonNAOaseexpression
综上所述，目的蛋白的表达形式存在可溶和不
可溶两种表达形式，酶活为可溶部分表现出来的活
力。以后的发酵可根据需要来选定诱导温度。本
文研究目的为得到高活力的酶，故选用20℃诱导。
2．3 诱导剂种类及用量的综合影响
2．3．1IPTG浓度对生物量、酶活及表达量的影响
IPTG可以直接进入宿主菌细胞内来发挥诱导
作用，是一种非常有效的诱导剂，极少量的IPTG就
能稳定的诱导出目的蛋白，一般用量在O．2—1．0
mmol／L之间。IPTG浓度对目的蛋白表达的综合影
响结果见表1。
表1 IFFG用量的综合影响
Table1 ComprehensiveeffectofIPTGconcentrations
万方数据
· 30· 生物加工过程 第6卷第1期
结果表明，当不加IPTG时，该菌生长正常，但
不能表达重组NAOase，充分证明该酶为IPTG诱导
产生的酶，这也和重组质粒的构建设想相吻合。加
入IPTG后，由于菌本身不能利用IPTG，而由IPTG
作为诱导剂高效启动外源基因argE的表达需要消
耗能量，和菌的生长存在竞争关系，故菌的生长量
稍有下降。这也同时说明重组菌B121(DE3)一
pET22b—argE表达外源基因产生的重组NAOase对
菌的生长无毒害作用，否则会引起生物量的大幅下
降。从表1也可看出，IPTG是一种非常有效的诱导
剂，0．1mmol／L的加入量即可达到较好的诱导效
果。以活性表达为基准，最适用量为0．2mmol／L。
2．3．2乳糖浓度对生物量、酶活及表达量的影响
在T71ac启动子中，除了昂贵的IPTG可作为诱
导物外，乳糖，别乳糖及酶作用的底物等等也有可
能起到同样的诱导作用。由于酶作用底物的存在
会干扰活力测定，而乳糖来源易得、质量稳定且价
格较低，故以乳糖代替IPTG作为诱导剂，考察乳糖
的诱导效果，结果见图4。
图4乳糖质量浓度对生物量及酶活的影响
Fig．4EffectsoflactoseconcentrationsOn
biomassndNAO鹳eactivity．
，
龟
●
量
妲
溢
一般情况下，酶的表达量受表达产物本身的特
性、表达载体、宿主菌及培养条件等因素的综合影响，
会有一最高值。在不形成包涵体的情况下，相应酶活
力也达到峰值。从图4可以看出，在考察的乳糖质量
浓度范围内，生物量基本稳定。在0～5．0g／L的低
乳糖质量浓度范围内，随乳糖浓质量度增加，酶活也
随之快速增加。再增大乳糖质量浓度，酶活增加缓
慢，当质量浓度高至15．0g／L时，活力达最大值。当
乳糖质量浓度高于15．0g／L，酶活力随之缓慢下降并
最终达到一稳定值。即高质量浓度的乳糖对菌的生
长无抑制作用，而对酶活性有一定抑制作用。这可能
由于除了作为表达载体，17启动子的诱导物外，高质
量浓度的乳糖也同时开启了宿主菌B121(DE3)和表
达载体的乳糖操纵子。乳糖分解产生葡萄糖，葡萄糖
的阻遏效应开始表现，抑制了目的蛋白的表达。乳糖
最适用量为15．0g／L，此时酶活为145．24U／mL，超
过了IPTG最适用量时92．61U／mL的酶活力。故以
后实验选择乳糖为诱导剂。
2．4诱导起始OD值对生物量、酶活及表达量的影
响
诱导剂加入时间不同，重组菌所处的生长周期
也不同，表达出的目的蛋白的量及活性也不同。改
变乳糖的加入时机，分别在重组菌生长0，1．0，2．0，
3．0，4．0，5．0h后加入15．0g／L的乳糖，20℃诱导
过夜。结果显示最适的诱导时机为2．0h，对应
叩㈣约0．87。再详细考察2．0h附近的数据点。
以乳糖加入前的菌生长时间为横坐标，此时对应的
DD鲫及诱导结束后的酶活为纵坐标作图，结果如图
5所示。
图5诱导起始OD值对生物量、酶活的影响
Fig．5Effectsofinitiatedb眦fiadensity
onbiomassndNAOaseactivity．
，
■
暑
●
o
鼍
蝗
槛
可以看出，诱导起始019值对酶活影响较大，在
重组菌生长1．75h后再加入乳糖，诱导效果最好。
此时诱导起始生物量为0．46，重组菌刚刚进入对数
生长前期。以后的实验控制在重组菌生长至对数
生长前期加入。
2．5诱导时间对生物量、酶活及表达量的影响
根据以上实验结果，以进口的LB培养基为发酵培
养基，装液量为100mL摇瓶中15mL，接种，37℃，180
r／min振荡培养1．75h后，加人15．0s／L乳糖在22℃
诱导，不同时间取样，考察诱导时间对重组菌生物量、
酶活及表达量的影响，结果如图6和图7所示。
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2008年1月 朱大伟等：argE基因在大肠杆菌中的表达优化 ·31·
图6诱导时间对生物量及酶活的影响
Fig．6EffectsofinducingtimeOilthe
biomasandNAOaseactivity
，
龟
●
o
喜
溢
图7诱导时间对表达量的影响
Fig．7EffectsofinducingtimeonNAO鹳eexpressionlevel
从图6可以看出，在0—8h的诱导时间范围
内，随诱导时间延长，生物量快速增加，诱导6h后，
目的蛋白开始表达，8h有明显表达。菌体表达外
源基因的过程需要消耗能量，因此诱导8h后，生物
量增加缓慢，而酶活及表达量随诱导时间的增加迅
速增加。诱导18h时，酶活力最高，再延长诱导时
间，酶活又开始下降。最适诱导时间为18h。
3结论
目的基因argE可在LB培养基中有效表达，证
实了质粒构建的正确性。重组Ⅳ．乙酰鸟氨酸脱酰
基酶为诱导酶，且大部分以包涵体形式存在于不
溶胞质中，降低温度可以显著提高可溶性表达的
比例，诱导温度为20℃时，酶活力最高。IPTG是
一种常用的诱导剂，0．2mmol／L的浓度即可达到
最佳诱导效果。乳糖可以代替昂贵的IPTG起到
有效的诱导作用，15．0g／L的乳糖可使菌的生物
量和产酶达到最佳。诱导起始OD值及诱导时间
也是影响目的蛋白表达的重要因素。诱导起始菌
密度0D啪为O．46，诱导时间为18h时最利于酶的
活性表达。
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