全 文 ：第5卷第4期
2007年11月
生物加工过程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
NOV．2007
·65·
三．天冬氨酸的清洁提取工艺
章燕，徐虹，李莎
(南京T-业大学制药与生命科学学院，南京210009)
摘耍：针时L一天冬氨酸酶法制备过程中用硫酸调pH存在的环境污染问题，探讨了利用富马酸提取L-Asp的方
法，结果表明最佳提取条件为结晶温度90℃、富马醢加入量为底物溶液中富马酸量的065倍、最终冷却至37℃。
比较硫酸和富马酸两种提取L-Asp方法发现，后者的废水排放量度废水处理费用仅为前者的1／6，是一种清洁经济
的提取I艺。
关键词：厶乏毒氧酸；富马酸；结晶；清洁工艺
中围分类号：TQ93 文献标识码：A 文章编号：1672—3678(2007)04—0065—05
AcleanprocessforeparatingL-asparticacid
ZHANGYah，XUHong，LISha
(CollegeofLifeScienceandPharmaceuticalEngineering，NanjingUniversityofTechnology，N舯jin9210009，China)
Abstract：Inorderto educethpollutionfr mtheprocessofenzymaticproductionofL—asparticac dsep-
aratedbysuffuricacid，anewmethodWaSdevelopedfordepositeandrecoveryofL-asparticacidbyfu-
marieacid．Theoptimicalresultswereachievedwhenthecrystallizationtemperaturewag90qc．thea—
mountof headdedfumarieacidWas0．65timesthetotalmountoffumaricacidcontainedthesub-
strate．andthesolutionWascooledto37℃．Acomparisonbetweenthemethodf rseparatingL—Aspby
sulfuricacidandthemethodbyfumaricacidwascarriedOut．Theresultshowedemissionofwastewater
andcostofwastewatertreatmentw rereducedby6times，whichjustifiedthmethodf rseparating￡一Asp
byfumaricacidisaclean deconomicalone．
Keywords：L—asparticacid；fumacicacid；crystallization；cleanmethod
￡一天冬氨酸(L-Asp)是一种重要的氨基酸，广泛
应用于医药、化工、食品等领域。工业上通常采用
L一天冬氨酸酶催化富马酸加氨的方法生产L—Asp。
在该工艺中，L-Asp的提取是用硫酸将pH8．5左右
的酶转化液调至其等电点2．8，结晶沉淀后，再经过
滤、干燥得到成品⋯。据统计，每生产1t的L-Asp，
需要消耗0．7t的浓硫酸、产生6—7m3的酸性废
水，同时废水中还含有500kg左右的硫酸铵。并且
该废水必须处理后才能排放，一定程度上降低了工
厂的经济效益，有些工厂采取浓缩的方法对废水中
的铵盐进行回收，但消耗了不少的能源。
目前已有一些专利“。1报道采用将富马酸加入
到酶转化液中提取L-Asp的方法，晶体分离后的母
液补加富马酸和氨水后，可以继续作为底物进行下
一次的酶反应，该方法得到的晶体纯度高，但提取
率比较低。
收稿日期：2(X)7-01·19
基盒项目：国家“973”硬目(2BOTCBTl4304)
作者简介：章燕(1982一)．士，浙江宁波人，硕士研究生，研究方向：发酵厦酶工程。
鞋襄人：橹虹，教授．博士生导师，E-mail：xuh@哪uLedu∞
万方数据
·66· 生物加工过程 第5卷第4期
本文研究了利用富马酸提取／,-Asp的工艺，探
索了该提取过程的最佳提取条件，希望能解决硫酸
提取工艺存在的废水处理困难问题，同时，从经济
效益出发，适当地利用硫酸提取工艺来提高L-Asp
的提取率。
1材料与方法
1．1材料
1．1．1菌种
大肠杆菌EA-1，本实验室筛选”1。
1．1．2培养基
培养基为富马酸钠5∥L，富马酸铵10∥L，牛
肉膏log／L，玉米浆10g／L，MgS04．7H2059／L，
K2HPO,2g／L，氨水调pH至7．0。
1．1．3底物溶液
底物：富马酸150g／L，Mgso。．7H200．25g／L，
氨水调pH至8．5，37qc，备用。
1．2方法
1．2．1培养方法
将菌种接种到种子培养基中，37℃，220r／mln
培养24h。培养结束后，培养液用1mol／LHCL调
pH5．0，升温到45℃，保温1h，冷却至室温，离心收
集菌体。
1．2．2大肠杆菌细胞的固定
离心收集的6g湿菌体，悬浮于15mL的生理
盐水，45℃保存，备用。取2．4g卡拉胶溶于45mL
80℃生理盐水，冷却至45℃，得到卡拉胶溶液。将
上述收集的菌体与卡拉胶溶液混匀，放人盘中铺
平，4℃凝胶强化，把所形成的凝胶浸于0．3mmol／L
溶液中。取出凝胶切成5mm×5mm大小的小块，
即得含天冬氨酸酶的固定化大肠杆菌细胞。
1．2．3酶法转化反应
200mL的底物溶液中加入固定化大肠杆菌细
胞，于37℃进行转化反应，待底物溶液中的富马酸
质量浓度降到0．2％以下，结束反应。
1．2．4L—Asp的提取
(1)酶法转化液预处理
将转化液升温至70℃，加入质量分数为0．2％
活性炭脱色20rain，再经过滤收集滤液。
(2)利用硫酸提取L-Asp
将滤液升温至90气，在搅拌条件下，缓慢均匀
地加入硫酸，直到溶液pH2．8，停止加酸，冷却至室
温2h后，滤取结晶，干燥2—3h，即得L-Asp晶体。
(3)利用富马酸提取￡-Asp及提取条件的优化
将滤液升温至一定温度，然后加入一定量的富
马酸，迅速搅拌溶解后．开始有L-Asp晶体析出，在
该温度下继续缓慢搅拌30min，此时析出了大量的
L—Asp晶体，然后缓慢冷却至一定温度，在该温度下
继续缓慢搅拌30rain，完成L-Asp晶体的沉淀。经
过滤、干燥得L—Asp晶体。
(4)L—Asp提取方案的设计
配制200mL的底物溶液，含天冬氨酸酶的固定
化大肠杆菌细胞催化富马酸加氨转化为L-Asp，转
化液经活性炭脱色后，采用富马酸调pH方法的优
化条件结晶提取L-Asp，抽滤、干燥得L—Asp晶体；母
液回收，补加富马酸，将母液再次配成200mL的底
物溶液，进行第二次的酶反应，如此反复循环5次
后，第六次的转化液脱色后，加热至90℃，采用硫酸
调pH至L·Asp等电点的方法结晶沉淀L-Asp(如图
1)。
(5)分析方法
富马酸含量测定：紫外可见分光光度法，于240
nm处测定其吸收值”J。
L·Asp纯度测定：Agilentl200高效液相色谱仪，
WatersAtlantisdCl851zm舭．6lmx250mm分析
酶r色翟竺L燃‰应一广—+干燥得卜A叩晶体反复循环5次 一⋯j⋯“
硫酸调pIt覃ff．--Asp等电点一脱色一抽墟———’干燥得厶^sp晶体， 图I L-Asp的提取方案
Fig．1Amethodforseparating
万方数据
2007年11月 章燕等：L天冬氨酸的清洁提取工艺
柱，L—Asp(Sigma公司)。流动相：0．03mol／L
KH2P04一H3P04缓冲液(pH2．5)；检测波长：210
nnl；流速：0．8mL／min；进样量：20p,L。
旋光度测定⋯：JascoP．1020旋光仪，C=0．08
g／mL，6mol／LHCl。
2结果及讨论
2．1利用富马酸提取L-Asp条件的优化
分别考察了结晶温度、富马酸加入量、冷却温
度这三个因素对L-Asp提取过程的影响。
2．1．1结晶温度和富马酸加入量的影响
在不同的结晶温度和富马酸加入量条件下。L
Asp的提取率及纯度如表1所示。
表1 结晶温度和富马酸加入量对L-Asp提取的影响
Table1 Effectof emperaturendthamountoffumarie
acidaddedontheseparatingL-Asp
注：富马酸加入倍数=富马酸加人量／底物溶液中富马
酸的初始量
由于结晶温度和富马酸加入量对L-Asp提取的
影响是密切相关的，随着结晶温度的升高，溶液中
能溶解的富马酸的量也相应增加。一旦加入的富
马酸不能完全溶解，将导致析出的L-Asp晶体中混
有富马酸晶体，L-Asp晶体纯度下降。由表1得结
晶温度90℃、富马酸加入量为底物溶液中初始富马
酸量的0．65倍，是利用富马酸提取L-Asp的最佳
条件。
另外，表1表明利用富马酸提取L—Asp的提取
率较低，这是由于加人的富马酸量不足以使溶液的
pH达到L-Asp等电点。吴月等”o研究了硫酸调pH
沉淀L—Asp的过程，发现溶液pH由4．3下降到
3．72这一过程中，产生的过饱和大，能析出大量的
L-Asp晶体，继续加硫酸使溶液pH至L-Asp等电
点，完成L．Asp晶体的沉淀。在采用富马酸提取L．
Asp的过程中，实验测得的pH为3．8左右，因此只
能使部分的L-Asp晶体析出，其余的仍留在溶液中。
2．1．2冷却温度的影响
在不同的冷却温度下，L-Asp的提取率及纯度
如表2所示。
表2冷却温度对L-Asp提取的影响
Table2 EffectofcoolingtemperatureonseparatingL-Asp
L—Asp的溶解度随着温度的降低而降低，所以
冷却温度50℃时，提取率相对较低；但是，当冷却温
度为25℃时，尽管L-Asp的提取率有所增加，但其
纯度下降，这是由于随着温度的降低，原先完全溶
解的富马酸有所析出，导致L-Asp的纯度的下降。
故冷却温度选择37℃，即酶反应温度。
2．2最优条件下提取L-Asp结果
利用上述得到的富马酸提取L-Asp的最优条件
结晶沉淀L-Asp的结果见表3，连续5次得到的￡-
Asp比旋光度[a]”介于+24．8。一+25，8。之间，
符合USP23产品质量标准。
表3采用富马酸提取L-Asp
Table3 DepositingL-Aspbyusingfumarleacld
批次 1 2 3 4 5
转化率／％ 99．叮 98．84 98．9 9874 9876
晶体干质量7922．51 23．85 24．2326．9424．18
提取率／％ 66．0370．04 71．2 79．2671．13
纯度／％ 99．9 99．9 99．9 99．9 999
毕j学度 +25．36。+24．98。+25．3胪+25．ol。+25．35。
注：提取率(％)=晶体干质量／(底物溶液中富马酸物
质的质量x天冬氨酸相对分子质量x转化率)x100％
万方数据
·68· 生物加工过程 第5卷第4期
2．3两种提取方案比较
考虑到利用富马酸提取L—Asp的提取率较低，
所以此方法反复循环5次后，第六次改用硫酸调pH
至L．Asp等电点的方法来完全沉淀溶液中的￡一Asp
(图1)。
由表4所示的结果表明，6次200mL的底物溶
液共计180g的富马酸，经转化、提取后，富马酸提
取方案得到的L-Asp量和硫酸提取方案相当，而前
者所消耗的硫酸量、排放的废水量以及排放的废水
中含有的硫铵量都仅约为后者的17％。按表4的
结果推算，生产1t的L-Asp，硫酸提取方案需消耗
0．7t的浓硫酸，排放6m3的酸性废水以及约500kg
的硫铵；而富马酸提取方案仅消耗0．117t的硫酸，
排放lm3的废水以及0．086kg的硫酸铵，显然，富
马酸提取方案能很大程度上改善利用硫酸提取￡一
Asp工艺带来的环境污染问题，是一种清洁的提取
工艺。工业上对该酸性废水一般采用中和、生化处
理后排放，也有企业采用直接蒸发浓缩法回收废水
中高浓度的硫铵，但较高的能耗使企业难以承受，
与硫酸提取方案相比，采用富马酸提取方案废水处
理费用仅为其1／6，在改善原有提取工艺带来的环
境污染问题的同时提高了工厂的经济效益。
2．4 L-Asp的晶体形状
分别采用富马酸和硫酸调pH的方法提取得到
的L·Asp晶体形状不同(图2)，前者的晶体呈针状，
该晶体形状与专利”1报道的一致；后者呈颗粒状。
导致晶型的差别可能是由于两者调酸速率的不同，
在采用富马酸调pH过程中，添加的富马酸同体迅
速溶解，使结晶液pH迅速下降，易形成针状晶体。
而在采用硫酸调pH过程中缓慢匀速的滴加速度使
析出的L-Asp晶体呈颗粒状”1。
袭4两种方案提取L-Asp情况比较
Table4 ComparisonofdepositingL-Aspbytwoprlx：e$1$
图2不同方法提取得到的L-Asp昌体形状Cx40)
Fig2 FormsofL-Aspcrystalsbydifferentd positingways
万方数据
2007年11月 章燕等：￡一天冬氨酸的清洁提取工艺
3结论
研究了利用富马酸提取L-Asp的工艺，确定了
结晶温度90℃、富马酸加人量为底物溶液中初始
富马酸量的0．65倍、最终冷却至37"C是该工艺的
最佳提取条件。由该方法得到的三一Asp晶体，纯度
达99．9％，比旋光度[d]芋为+24．80一+25．8。，
产品质量符合USP23标准。并在该方法的基础上
设计了一套提取方案，不仅解决了单独利用富马
酸提取L-Asp提取率低的问题，而且，相比单独利
用硫酸提取L-Asp工艺，该方案大幅度地减少了硫
酸的用量、铵盐的生成量及废水的排放量．很好地
解决了现有提取工艺存在的问题，是一种清洁经
济的提取工艺。
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CNl01016472：四氯化钛催化高酸值废弃油脂制备生物柴油的方法
本发明公开了一种四氯化钛催化高酸值废弃油脂制备生物柴油的方法，主要包括以下步骤：(1)向废弃
油脂中加入质量分数为0．5％一1．5％的活性炭制得预处理废弃油脂；(2)将预处理废弃油脂和甲醇、四氯
化钛加入反应器中，混合均匀后，常压下加热并维持在65—70。C，搅拌回流反应3—8h，反应物静置后分为
上下两层．上层为含少量甲醇和四氯化钛的高级脂肪酸甲酯液体；(3)将上层液体在65—70℃条件下常压
蒸馏脱除残留的甲醇，剩余物为含有四氯化钛(TICl4)的脂肪酸甲酯，用水洗至中性，除去杂质，干燥后即制
得生物柴油。本发明生产工艺简单，同时酯化、酯交换，污染较小，反应过程中和后处理过程中基本没有皂
化现象的发生．产品收率高、质量好。
CNl01016474：用固体酸预处理高酸值油脂制备生物柴油的方法
这是一种利用固体酸预处理高酸值油脂制备生物柴油的方法，在固体酸催化剂存在的条件下，将高酸
值油脂与一元醇在常压和50～90℃温度下，进行酯化预处理反应，反应停止后，过滤出固体酸催化剂，再生
重复使用，过滤液中加入碱NaOH或KOH催化剂进行酯交换反应制出生物柴油；所说的固体酸催化剂选自
H·ZSM-5型分子筛或掺杂有辅助成分Ga：0，或AI：O，的复合氧化物so：‘／ZrO：或W0，／ZrO：，其中Gaz03或
AI：0，的掺杂量是ZrO：摩尔数的1％一9％。本发明利用固体酸催化剂降低原料油脂的酸值，无腐蚀、无污
染、易分离、简化了工艺步骤，使后续碱催化酯交换反应容易进行。
(张春鹏)
万方数据