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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第4期
β-丙氨酸是自然界中唯一存在的 β 型氨基酸，
它是一种非蛋白氨基酸，只存在于一些细菌、真菌
和植物中，哺乳动物和人体中不存在［1］。近年来，β-
丙氨酸及其衍生物的研究日趋活跃，在医药、化工、
食品、环境等领域的作用日渐突起。在医药方面，β-
丙氨酸可以用于合成人体必需维生素——泛酸［2］，
以及合成泛酸钙、肌肽、帕米磷酸钠和巴柳氮等［3］；
在食品方面，可用作甜味剂［3］；在化工方面，β-丙
氨酸可以用于电镀［3］；它本身还可以用作铅中毒解
收稿日期 ：2012-11-01
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31070711），新世纪优秀人才项目（NCET-10-0461）
作者简介 ：石增秀，女，硕士研究生，研究方向 ：发酵工程 ；E-mail ：shitouszx@163.com
通讯作者 ：周哲敏，男，教授，研究方向 ：生物酶学、发酵工程 ；E-mail ：zhmzhou@jiangnan.edu.cn
谷氨酸棒杆菌 L-天冬氨酸 α-脱羧酶基因的克隆及
重组酶性质研究
石增秀  崔文璟  周丽  周哲敏
（江南大学生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室，无锡 214122）
摘 要 ： 从谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）中克隆得到 L-天冬氨酸 α-脱羧酶基因 panD。将该基因连接到 pET-
24a 载体上，并在 Escherichia coli BL21（DE3）中实现了成功表达。蛋白电泳检测显示，PanD 自裂解后形成的 α 亚基和 β 亚基，即
PanD 重组酶具有自身加工功能。重组酶的比酶活高达 2.60 U/mg（156 mmol/g·h）。酶学性质研究表明，其最适温度为 55℃，最适
pH 为 7.0。80℃条件下，PanD 的半衰期约为 40 min。在 37℃，pH7.5 条件下，Km 值为 4.26 mmol/L，Vmax 为 35.97 nmol/min，kcat 为 1.02/s，
催化效率 kcat/Km 为 0.24 L/mmol·s。
关键词 ： L-天冬氨酸 α-脱羧酶 谷氨酸棒杆菌 表达 纯化 酶学性质
Cloning and Characterization of L-aspartate-α-decarboxylase from
Corynebacterium glutamicum
Shi Zengxiu Cui Wenjing Zhou Li Zhou Zhemin
（The Key Laboratory of Industrial Biotechnology of the Ministry of Education，School of Biotechnology，
Jiangnan University，Wuxi 214122）
Abstract:  L-aspartate-α-decarboxylase gene panD from Corynebacterium glutamicum was cloned and efficiently expressed in Escherichia
coli BL21（DE3）. The α and β subunits of PanD were observed by Tris-tricine SDS-PAGE, indicating that the PanD was successful processed
by self cleavage. The specific activity of the recombinant enzyme was as high as 2.60 U/mg（156 mmol/g·h）. The optimum temperature was
55℃ and the optimum pH was 7.0. Under the condition of 80℃ , the half-life of PanD was approximately 40 min. Under the condition of 37℃
and pH7.5, the Km value was 4.26 mmol/L, the Vmax value was 35.97 nmol/min, the kcat value was 1.02/s and the catalytic efficiency（kcat/Km）was
0.24 L/mmol·s.
Key words:  L-aspartate-α-decarboxylase Corynebacterium glutamicum Expression Purification Enzymatic properties
毒剂［3］。国内外生产 β-丙氨酸主要采用化学合成
法［4］，生产成本较高，工艺条件苛刻，生产过程对
环境有一定的毒害作用，有大量副产物生成，给后
续的分离纯化带来很大困难［3］。相对于化学合成法，
生物酶催化法具有成本低、收率高、安全、污染少
等优点，但至今鲜有生物酶法制备 β-丙氨酸的报道。
L-天冬氨酸 α-脱羧酶（L-aspartate-α-decarboxy-
lase，EC4. 1. 1. 11，PanD）是泛酸生物合成途径中
有重要作用的调控酶，催化 L-天冬氨酸生成 β-丙氨
2013年第4期 111石增秀等 ：谷氨酸棒杆菌 L-天冬氨酸 α-脱羧酶基因的克隆及重组酶性质研究
酸。利用该酶以 L-天冬氨酸为原料有望实现 β-丙氨
酸的工业生产。Escherichia coli 活性形式的 PanD 是
一类依赖于丙酮酰基的四聚体脱羧酶［5］。E. coli 和
Mycobacterium tuberculosis 来源的 PanD 在体内仅能完
成 10% 左右的自裂解过程，进一步裂解过程需要依
赖 PanM 蛋白（一种可以促进 PanD 自裂解的乙酰基
转移酶同源蛋白）完成［2］。E. coli 中活性 PanD 晶
体结构研究结果表明该酶的 3 个亚基含有丙酮酰基，
该丙酮酰基是 PanD 的结合和催化位点，另外还有
一个亚基是酯基形式，该酯基是 PanD 自裂解加工
过程的一个中间态形式［6］。PanD 的催化反应过程是
丙酮酰基与底物形成希夫碱（schiff base）过渡中间
态［7］，该中间态结构进一步脱去一分子 CO2、产生
一分子 β-丙氨酸，同时完成丙酮酰基的重新形成，
再进行下一轮催化。PanD 这些特殊的结构和活化方
式以及催化方式，也使得相关研究具有较高的理论
价值。
然而，由于在生物体内 PanD 活性较低，对该
酶的研究尚处于理论阶段［8］，要将其进行广泛的应
用首先需提高 PanD 酶的活性。目前研究主要集中
在 E. coli 和 M. tuberculosis 菌株来源的 PanD 酶，虽
前 人 已 经 报 道 过 C. glutamicum 来 源 的 PanD 的 序
列，但是对其酶学性质研究并未报道。国内仅有
浙江工业大学裘娟萍课题组对 PanD 酶进行了克隆
表达，发现 C. crenatum 来源的 panD 基因序列与 C.
glutamicum 来源的序列同源率达到 99%，且蛋白质
序列完全吻合，然而也未对其酶学性质进行报道［9］。
而 C. glutamicum 来 源 的 PanD 不 依 赖 PanM 蛋 白，
可以在体内快速完成自裂解过程［2］，具有更好的应
用前景。本研究克隆表达 C. glutamicum 来源的 L-
天冬氨酸 α-脱羧酶（PanD），旨在获得可产生较高
PanD 酶活的重组菌株，并对重组酶进行分离纯化及
酶学性质研究，添补该项研究的空白。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与质粒 谷氨酸棒杆菌 Corynebacterium
glutamicum ST01 由本实验室从自然界中筛选得到。
Escherichia coli BL21、 质 粒 载 体 pET-24a（+） 为
Novagen 公司产品。
1.1.2 主要试剂与仪器 Pfu DNA 聚合酶、各种限
制性内切酶、T4 DNA 连接酶等均购自日本宝生物工
程（大连）有限公司，基因组 DNA 提取试剂盒、质
粒 DNA 提取试剂盒、胶回收试剂盒和 PCR 产物纯
化试剂盒均来自上海生物工程公司。AKTAXPRESS
蛋白纯化系统，通用电气（中国）医疗器械集团 ；
His Trap FF、His Trap HP 镍柱，通用电气（中国）
医疗器械集团。
1.1.3 引物设计与合成 根据 GenBank 所提供的 C.
glutamicum L-天冬氨酸 α-脱羧酶基因序列设计引物。
分别在上游引入 Nde Ⅰ酶切位点和保护碱基，下游
引入 Hind Ⅲ酶切位点和保护碱基并且在 C 端引入
His 标签。引物由上海生物工程公司合成。引物序列
为（下划线部分分别为 Nde Ⅰ和 Hind Ⅲ限制性内切
酶酶切位点及多聚 His 标签）：P1 ：5-GGGAATTCC
ATATGATGCTGCGCACCATCCTCG-3 ；P2 ：5-CCAA
GCTTCTATCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCAATGC
TTCTCGACGTCAAAAGCCCGGATCCAGGTA-3。
1.2 方法
1.2.1 panD 基因的克隆 以 C. glutamicum 的基因组
DNA 为模板，以 P1、P2 为引物在 50 μL 反应体系
中扩增。PCR 扩增条件 ：94℃预变性 10 min ；94℃
变性 1 min，56℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，35 个
循环 ；72℃再延伸 10 min ；10℃保温。
1.2.2 panD 表 达 质 粒 的 构 建 将 PCR 扩 增 到 的
panD 基因产物用 Nde Ⅰ和 Hind Ⅲ双酶切后连接到
用同样限制性内切酶酶切的质粒载体pET-24a（+）上，
获得重组质粒 pET24a-panD。
1.2.3 重 组 蛋 白 PanD 的 诱 导 表 达 将 重 组 质 粒
pET24a-panD 转化感受态细胞 E. coli BL21（DE3），
获得 PanD 表达型重组大肠杆菌 BL21/pET24a-panD。
挑取 BL21/pET24a-panD 平板单菌落，接种于 5 mL
含 100 μg/mL 卡那霉素的 LB 培养基，37℃、220 r/min
振荡过夜培养。将 1 mL 上述过夜培养物接种于 100
mL 含 100 μg/mL 卡那霉素的 LB 培养基，37℃、220
r/min 振荡培养至菌液 OD600=0.6，加入 IPTG 至终浓
度 0.6 mmol/L，37℃诱导培养 12 h 左右，收集菌体超
声破碎，通过 Tris-tricine SDS-PAGE 分析鉴定重组蛋
白。Tris-tricine SDS-PAGE 分析方法参见文献［10］。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第4期112
1.2.4 PanD 重组蛋白的纯化 将重组菌体溶于结合
缓 冲 溶 液（10 mmol/L Na2HPO4·12H2O、10 mmol/L
NaH2PO4·2H2O、500 mmol/L NaCl、20 mmol/L
Imidazole），超声破碎，离心，上清用 0.45 μm 滤膜
过滤。用 10 倍柱体积的结合缓冲溶液平衡 1 mL 的
His Trap FF 柱子，取 50 mL 的样品上样，用 10 倍柱
体积的结合缓冲溶液洗去非特异性吸附的蛋白，分
别用 150、300 和 500 mmol/L 咪唑的缓冲液来洗脱
蛋白［11］，每个浓度梯度用 8 倍的柱体积洗脱，按峰
来收集样品，将收集的样品用 SDS-PAGE 分析鉴定。
将上一步收集的 PanD 蛋白样品，经 His Trap HP 进
一步纯化，His Trap HP 柱子的纯化方法同 His Trap
FF 柱子。
1.2.5 蛋白浓度的测定 蛋白质定量采用常规的
Bradford 法［12］。
1.2.6 PanD 的 N 端测序 将纯化后的 PanD 经 Tris-
tricine SDS-PAGE 电泳后，电转移至 PVDF 膜上，进
行蛋白 N 端测序，由上海基康生物技术有限公司完
成测序。
1.2.7 PanD 重 组 蛋 白 的 活 性 测 定 取 900 μL 用
pH7.4 结合缓冲溶液适当稀释的酶液，加入 100 μL
50 mmol/L L-天冬氨酸溶液，37℃反应 10 min。反
应液用苯基异硫酸酯（PITC）衍生，衍生步骤为 ：
取 400 μL 反应液于 1.5 mL 离心管，加入 200 μL 0.1
mol/L PITC 乙腈溶液和 200 μL 1 mol/L 三乙胺乙腈溶
液，充分混匀，避光室温放置 1 h，加入 500 μL 正
己烷溶液，涡旋振荡器振荡 1 min，静置 30-60 min，
吸取下层溶液，用 0.45 μm 有机滤膜过滤［13］。
β-丙氨酸衍生产物用 HPLC 进行测定。色谱柱
为 La Chrom C18（5 μm，4.6×250 mm）；流 动 相 A
液 为 80%（V/V） 腈 水 溶 液，B 液 为 97∶3（V/V，
pH=6.5）的 0.1 mol/L 乙酸钠 - 乙腈溶液 ；采用梯度
洗 脱 ：0-15 min，B 液 由 95% 下 降 到 65% ；15-20
min，B 液由 65% 上升到 95% ；20-30 min，B 液梯
度不变。检测波长为 254 nm，柱温为 40℃。所测得
的 β-丙氨酸衍生产物的含量等同于衍生前的 β-丙氨
酸含量，从而计算酶活［14］。
酶活定义 ：在 37℃，pH7.4 的条件下，每分钟
转化底物 L-天冬氨酸生成 1 μmol 产物 β-丙氨酸所需
的酶量为一个酶活力单位 1 U。
1.2.8 PanD 的酶学性质研究
1.2.8.1 最 适 温 度 的 测 定 分 别 于 16 ℃、28 ℃、
37℃、45℃、55℃、65℃、80℃和 90℃温度下测定
PanD 的活性，并以 PanD 的比酶活对温度作图。
1.2.8.2 最适 pH 值的测定 分别于 pH4.0、pH5.0、
pH6.0、pH7.0、pH8.0 和 pH9.0 条件下测定 PanD 的
活性，并以 PanD 的比酶活对 pH 值作图。pH4.0 和
pH5.0 采 用 的 缓 冲 溶 液 为 50 mmol/L NaAC-HAC，
pH5.0、pH6.0、pH7.0、pH8.0、pH9.0 采用的缓冲溶
液为 66.7 mmol/L NaHPO4-KH2PO4。
1.2.8.3 热稳定性的测定 置 PanD 于 80℃水浴保
温，每隔 10 min 取样冰浴终止反应，检测酶活，并
以相对酶活的百分比对保温时间作图。
1.2.8.4 反应动力学参数的测定［15］ 在 37℃、pH7.4
条件下，酶液与不同浓度的底物 L-天冬氨酸（终浓
度 1、2、3 和 4 mmol/L）反应，测定其酶反应的初
始速率，以双倒数作图法确定 Km 和 kcat。
2 结果
2.1 panD基因的克隆
通过 PCR 方法，从谷氨酸棒杆菌基因组中扩增
得到约 450 bp 的基因片段，大小与预期相符（图 1-A）。
该基因经测序验证，确定为 C. glutamicum 的 panD
基因。重组质粒 pET24a-panD 经双酶切，得到了大
小约为 450 bp 的目的条带（图 1-B），表明外源基因
已经成功连接到表达载体上。
M 1
500
250
A
bp
100
750
1000
1200
2 M B
bp
5000
4000
100
250
500
750
1000
3000
2000
M ：DNA Marker ；1 ：panD PCR 产物 ；2 ：pET24a-panD 经 Nde Ⅰ和
Hind Ⅲ双酶切结果
图 1 panD 基因的 PCR 扩增产物（A）及 pET24a-panD
质粒双酶切验证（B）电泳图
2013年第4期 113石增秀等 ：谷氨酸棒杆菌 L-天冬氨酸 α-脱羧酶基因的克隆及重组酶性质研究
2.2 PanD在大肠杆菌中的表达
PanD 蛋白首先会形成无活性的 PanD 前体 π 蛋
白，然后发生自身裂解，产生有活性形式的 α 亚基
和 β 亚基。将重组质粒 pET24a-panD 转化感受态细
胞 E. coli BL21（DE3），获得 PanD 表达型重组大肠
杆菌 BL21/pET24a-panD。将重组菌株诱导表达 12
h 后，经 Tris-tricine 电泳检测，结果（图 2）显示，
所表达 PanD 蛋白自身裂解后形成 α 亚基（其 C 端
含有 His 标签，大小约为 12.4 kD）和 β 亚基（大小
约为 2.8 kD），β 亚基在 Tris-tricine 凝胶上发生一定
的迁移是由于分子量小的蛋白形成球形，其较高的
多肽内部的电荷不能被结合的 SDS 电荷所覆盖，所
以偏离了相对迁移率和分子量对数的相互关系。电
泳结果表明，在大肠杆菌中成功表达了具有自身
加工功能的异源 PanD。β 亚基 N 端测序，结果为
MLRTI，与 GenBank 报道的谷氨酸棒杆菌中 PanD
氨基酸序列一致。
2.3 PanD的分离纯化
PanD 重组酶经 His Trap FF 和 His Trap HP 镍柱
纯化 SDS-PAGE 电泳分析结果（图 3）表明，两步
纯化获得了较纯的目的蛋白（图 3 中泳道 2 和泳道
3 在 14.2-20.0 kD 之间较淡的条带，是没有进行自
裂解的 π-蛋白），可以用于进一步的酶学性质研究。
各步的纯化效率如表 1 所示。
α
β
M 1 kD
10.0
4.6
1.7
17.0
26.0
42.0
M ：蛋白质分子质量标准 ；1 ：BL21/pET24a-panD 的细胞破碎上清
图 2 BL21/pET24a-panD 表达产物的 Tris-tricine 电泳鉴定
14.2
20.0
27.0
36.0
50.0
90.0
118.0
kD M 1 2 3
αӊส
βӊส
M ：蛋白质分子质量标准 ；1 ：细胞破碎液 ；2 ：经 Histrap FF 柱
子纯化样品 ；3 ：经 Histrap FF 和 Histrap HP 柱子纯化样品
图 3 重组 PanD 纯化过程的 SDS-PAGE
表 1 L-天冬氨酸 α-脱羧酶的纯化总表
Purification step Total activity（U） Total protein（mg） Specific activity（U/mg） Purification fold Yield（%）
Crude enzyme 66.33 295.90 0.23 1 100
Histrap FF crude kit 42.61 20.81 2.05 8.85 64.2
Histrap HP crude kit 17.32 6.66 2.60 11.30 40.6
2.4 重组PanD的酶学性质
2.4.1 PanD 的 最 适 温 度 PanD 蛋 白 在 不 同 的 温
度下的酶活如图 4 所示。可见该酶的最适温度为
55℃，温度超过 65℃和低于 20℃时，酶活急剧下降。
该最适温度性质与 E. coli PanD 的最适温度（55℃）
一致［11］。
2.4.2 PanD 的最适 pH 重组酶在不同的 pH 条件下
的酶活如图 5 所示，表明该酶在 pH4-7 范围内酶活
不断上升，pH 值低于 5.0 时酶活迅速降低，其最适
pH 值为 7.0 左右。
2.4.3 PanD 的热稳定性研究 重组酶在 80℃水浴
放置不同时间酶活百分比变化如图 6 所示。该酶在
80℃放置随着保温时间的延长，活性有明显下降趋
势。保温 30 min 之内，酶的活性缓慢下降，保温
40-70 min 之间，酶的活性急剧下降。在 80℃时，
PanD 的半衰期约为 40 min。
2.4.4 PanD 的酶学常数测定 以 L-天冬氨酸为底
物，在不同浓度下测定 L-天冬氨酸 α-脱羧酶的活性，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第4期114
图 4 PanD 的最适温度 图 5 PanD 的最适 pH
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0 20 40 60 80 100
R
el
at
iv
e
ac
tiv
ity
%

Temperature ć
0
20
40
60
80
100
120
0 2 4 6 8 10
pH
R
el
at
iv
e
ac
tiv
ity
(
%
)
从而计算出反应动力学常数。结果（图 7）显示，
该酶的米氏常数 Km 为 4.26 mmol/L，最大反应速率
Vmax 为 35.97 nmol/L·min，转化数 kcat 为 1.02/s，酶
的催化效率为 kcat/Km 为 0.24 L/mmol·s。
图 6 PanD 的热稳定性
0
20
40
60
80
100
120
20 40 60 80
Time (min)
R
el
at
iv
e
ac
tiv
ity
(%
)
0
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0.16
-0.5 0 0.5 1 1.5
1/S mmol/L1
1/
V
nm
ol
1 m
in

根据 1/V =Km /Vmax（1+ ［S］）+1/Vmax 方程绘制曲线，X 轴截距（-1/Km）=-0.2344；
Y 轴截距（1/Vmax）=0.0278
图 7 双倒数曲线图
3 讨论
早在 1996 年，美国 NSC 技术有限公司扩增表
达了 E. coli 来源的 panD 基因，并测得该菌粗酶液
酶活为（37℃、pH7.0 条件下）0.115 mmol/g·h［8］。
Williamson［11］、Cronan［15］ 等 先 后 报 道 的 E. coli
PanD 的最适 pH 是 6.8-7.5，Chopra 等［15］报道的 M.
tuberculosis PanD 的最适 pH 是 7.0，与本研究结果一
致。Chopra 等［15］扩增了致病菌 M. tuberculosis 来源
的 panD 基因，并在 E. coli BL21（DE3）中表达，粗
酶液酶活达到 0.035 mmol/g·h，纯酶比活可达 126
mmol/g·h。在 1999 年，德国 Dusch 等［16］首次克隆
了 C. glutamicum 来源的 panD 基因，并将该基因分
别在 E. coli 和 C. glutamicum 体系里表达，在 tac 启
动子（pZ8-1 系列载体）作用下，粗酶液活性分别
可达 0.027 mmol/g·h 和 2.073 mmol/g·h。本研究克
隆了 C. glutamicum 来源的 panD 基因，并在 E. coli
BL21（DE3）中以及 T7 强启动子启动下，高效表达
出具有自身加工功能和 β-丙氨酸合成活性的 PanD
重组酶，粗酶液活性为 13.9 mmol/g·h，纯酶活性
可达到 156 mmol/g·h，是上述研究的 70 余倍，是
现有报道中所获得活性最高的，这与 C. glutamicum
panD 基因的 SD 序列和 PanD 酶的翻译后剪辑调控
更佳有关。
此外，本研究首次系统地报道了在 E. coli 中表
达的 C. glutamicum 来源的 PanD 重组酶的酶学性质。
虽 然 C. glutamicum 来 源 的 PanD 氨 基 酸 序 列 与 E.
coli 和 M. tuberculosis 来源的 PanD 氨基酸序列的同
源性较低（分别为 39.71% 和 58.99%），但是本研究
2013年第4期 115石增秀等 ：谷氨酸棒杆菌 L-天冬氨酸 α-脱羧酶基因的克隆及重组酶性质研究
所表达的重组酶的最适温度和最适 pH 与这两个酶
的性质相似，这也为 PanD 酶的分子结构研究提供
了参考材料。同时，发现 C. glutamicum 来源的重组
PanD，在 80℃下其半衰期约为 40 min，具有较好的
热稳定性，以上性质也在生物酶法制备 β-丙氨酸等
领域的应用具有较大价值。
据 报 道 重 组 E. coli PanD 的 Km 为 151 μmol/L，
kcat 为 0.57/s，重组 M. tuberculosis PanD 的 Km 为 219.6
μmol/L 和 kcat 为 0.65/s
［8］。而本研究中重组 C. gluta-
micum PanD 的 Km 值要比报道中两组重组菌高，kcat
的变化却不大。这些差异可能是酶的来源菌株不同
而引起的。该结果为 PanD 的理论研究及进一步工
业应用，尤其是为生物法制备 β-丙氨酸及其衍生物
提供了技术支撑。
由于 PanD 会发生一个自身裂解反应，由无活
性的酶原 π-蛋白，裂解生成有活性基团丙酮酰基的
α 亚基和 β 亚基，α 亚基的丙酮酰基才是催化基团，
这种有趣的现象促使我们进一步对影响该酶自身裂
解反应的氨基酸进行研究，相关研究正在进行。
4 结论
本研究实现了谷氨酸棒杆菌的 panD 基因在大
肠杆菌中的高活性表达（酶活提高为现有研究的 70
余倍）。PanD 重组酶的最适温度和最适 pH 分别为
55℃、pH7.0，与 E. coli 和 M. tuberculosis 来源的相似，
kcat 的变化也不大，而 Km 值要比这两组重组菌的高。
重组酶在 80℃下仍具有较好的稳定性。
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（责任编辑 马鑫）