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Screening of Rhizopus oryzae mutants with higher activity of alternative respiration for fumaric acid production

米根霉交替呼吸途径高活性突变株的选育及其对富马酸合成的影响



全 文 :第 13卷第 3期
2015年 5月
生  物  加  工  过  程
Chinese Journal of Bioprocess Engineering
Vol􀆰 13 No􀆰 3
May 2015
doi:10􀆰 3969 / j􀆰 issn􀆰 1672-3678􀆰 2015􀆰 03􀆰 005
收稿日期:2014-03-27
基金项目:国家重点基础研究发展计划(973计划)(2013CB733605);国家高技术研究发展计划(863计划)重点项目(2011AA02A206);国家自
然科学基金(21076104、21106065、21106091)
作者简介:孙小龙( 1989—),女,江苏盐城人,硕士研究生,研究方向:生物基化学品的制备;黄   和 (联系人),教授,E⁃mail: biotech@
njtech􀆰 edu􀆰 cn
米根霉交替呼吸途径高活性突变株的选育及其
对富马酸合成的影响
孙小龙,付永前,徐  晴,李  霜,黄  和
(南京工业大学 生物与制药工程学院 材料化学工程国家重点实验室,江苏 南京 210009)
摘  要:米根霉交替呼吸强度与富马酸合成之间存在重要关联。 以米根霉 F 14 为出发菌株,通过常压室温等离
子体(ARTP)离子诱变技术,筛选出 1株交替呼吸强度增强的突变菌株 S 1。 该菌株的交替呼吸初始强度是出发
菌株 F 14的 3􀆰 5倍,然而,该菌株富马酸积累量(28 g / L)却远低于出发菌株(42 g / L)。 进一步考察突变株 S 1
和出发株 F 14菌株在发酵过程中交替呼吸及富马酸生产强度,总呼吸变化和还原力 NADH / NAD+的变化。 结果
表明:突变株在富马酸发酵初始阶段,过高的交替呼吸强度反而降低了富马酸的生产速率,并导致了发酵后期菌体
的早衰现象。 交替呼吸强度与发酵进程存在适配性,只有当适配性达到最佳状态时,才有利于产物的高效积累。
关键词:米根霉;富马酸;交替呼吸;生产强度
中图分类号:TK6;Q819;S216·2        文献标志码:A        文章编号:1672-3678(2015)03-0026-05
Screening of Rhizopus oryzae mutants with higher activity of alternative
respiration for fumaric acid production
SUN Xiaolong,FU Yongqian,XU Qing,LI Shuang,HUANG He
(State Key Laboratory of Materials⁃Oriented Chemical Engineering,College of Biotechnology and
Pharmaceutical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 210009,China)
Abstract:During fumaric acid fermentation, alternative respiration is associated with fumaric acid
productivity in Rhizopus oryzae􀆰 S⁃1 mutant with higher activity of alternative respiration was screened by
atmospheric and room temperature plasma(ARTP) ion mutagenesis using Rhizopus oryzae F⁃14 as the
original strain. The activity of alternative respiration in S⁃1mutant is 3􀆰 5⁃fold than that of F⁃14. However,
fumaric acid production ( 28 g / L) was much lower than that of the original strain ( 42 g / L). The
relationship between alternative respiration ratio and fumaric acid productivity, the change of total
respiration activity and NADH / NAD+of S⁃1 and F⁃14 in the fermentation process were further studied. At
the initial fermentation stage higher activity of alternative respiration in S⁃1 mutant reduced the fumaric
acid productivity,and ultimately led to the premature aging phenomenon in the fermentation. It means that
the activity of alternative respiration should adapt the fumaric acid productivity.
Keywords:Rhizopus oryzae; fumaric acid; alternative respiration; productivity
    富马酸作为初级代谢产物,在微生物发酵过程
中与能量代谢密切相关。 丝状真菌米根霉(Rhizopus
oryzae)是富马酸发酵研究的主要菌株[1]。 现有研
究发现,丝状真菌体系中除了电子传递呼吸链外,
还存在 2个额外的还原型辅酶(NADH)脱氢酶和 2
个黄素还原酶,它们可以不经过呼吸链而直接把电
子传给氧,促成胞内三磷酸腺苷(ATP)水平低,从而
保证了糖酵解途径(EMP)的畅通,这个过程称为交
替呼吸途径[2-5]。 交替呼吸起到了能量溢流的作
用[2],平衡碳代谢和电子传递的关系,将 ATP 合成
与三羧酸循环(TCA)独立开来,使得 TCA 继续进
行,促进了碳骨架的流通,有利于代谢产物的生
成[6-7]。 在真菌发酵体系中,如柠檬酸、头孢菌素等
发酵过程中,均发现了交替呼吸途径与产物积累具
有重要关联[8-9];王庆昭等[10]通过筛选高强度交替
呼吸活性黑曲霉菌株(水杨氧肟酸(SHAM)敏感型
菌株),获得了高产柠檬酸突变株。
笔者所在课题组的 Gu等[11]在米根霉的富马酸
发酵过程中也发现了交替呼吸途径的存在,并对该
途径的呼吸活性与富马酸积累的相关性以及关键
酶———交替氧化酶及其调控方式进行了研究。 然
而,交替呼吸强度如何影响米根霉合成富马酸的研
究鲜有文献报道。 笔者通过交替呼吸抑制剂水杨
氧肟酸(SHAM)筛选高交替呼吸强度的突变株,并
考察其对富马酸合成的影响。
1  材料与方法
1􀆰 1  菌株 
出发菌株米根霉 Rhizopus oryzae F 14 为保藏
于笔者所在实验室的富马酸高产菌株。
1􀆰 2  培养基
菌种保藏培养基(培养基 A)为 PDA 斜面培养
基(1 L):马铃薯 200 g、葡萄糖 20 g、琼脂 20 g;
筛选培养基(培养基 B):PDA 培养基中添加
SHAM 0􀆰 6 g / L;
孢子萌发培养基(1 L):蛋白胨 2 g、CaCl2 2􀆰 5
g、葡萄糖 60 g;
发酵培养基(1 L):葡萄糖 80 g、尿素 0􀆰 1 g、
MgSO4·7H2O 0􀆰 6 g、ZnSO4·7H2O 0􀆰 018 g、KH2PO4
0􀆰 5 g、FeSO4·7H2O 0􀆰 001 g、CaCO3 50 g。
1􀆰 3  培养条件
米根霉于斜面培养基培养 5~6 d,孢子成熟后,
制备成孢子悬浮液(107 个 / mL)。 取孢子悬液 1 mL
接种至装有 50 mL种子培养基的 250 mL三角瓶中,
200 r / min、35 ℃培养 12 h 后,按 10%接种量(体积
分数),接入发酵培养基(250 mL 三角瓶装 50 mL)
产酸,200 r / min、35 ℃培养 12 h。
1􀆰 4  葡萄糖、富马酸和呼吸强度测定
葡萄糖和富马酸的测定参照文献[12];呼吸强
度分析采用液相氧电极法[13]。
1􀆰 5  米根霉胞内 NADH和 NAD+测定
NADH和氧化型辅酶(NAD+)的测定方法参照
文献[14]。
2  结果与讨论
2􀆰 1  米根霉交替呼吸突变株的选育
2􀆰 1􀆰 1  SHAM浓度的确定
将原始菌株孢子液涂布在添加不同浓度 SHAM
的 PDA 培养基上观察其萌发情况,结果如表 1 所
示。 由表 1 可知:随着 SHAM 浓度的增加,米根霉
孢子萌发数量显著减少,菌丝形态由粗壮发达变为
纤细短小。 当 SHAM 质量浓度为 0􀆰 8 g / L时,孢子
萌发数目明显减少,说明此时药物浓度已经对菌株
生长造成明显的影响,而 0􀆰 6 g / L 之前的药物浓度
对菌株生长及萌发未造成显著影响。 因此,选取
0􀆰 6 g / L 的 SHAM 作为筛选剂量,交替呼吸增强菌
株在此浓度下不萌发,而原始菌株可以正常萌发。
表 1  SHAM浓度对米根霉孢子萌发的影响
Table 1  Effects of SHAM titers on spore germination
ρ(SHAM) / (g·L-1) 菌落数 菌丝形态
0 110 菌丝发达
0􀆰 2 108 菌丝发达
0􀆰 4 106 菌丝发达,稍短
0􀆰 6 102 菌丝细短
0􀆰 8 40 菌丝细短无分叉
1􀆰 0 30 菌丝极细短
1􀆰 2 18 菌丝纤细成点
2􀆰 1􀆰 2  交替呼吸增强菌株的选育
取新鲜米根霉菌株 F 14 斜面,适量生理盐水
洗下孢子并调整成密度约 105 个 / mL 孢子液,取 10
μL孢子液涂布于直径 8 mm 小铁片上,无菌条件下
72  第 3期 孙小龙等:米根霉交替呼吸途径高活性突变株的选育及其对富马酸合成的影响
自然晾干。 常压室温等离子体(ARTP)离子机室温
诱变,气流量(QHe)= 10􀆰 0 L / min,照射距离 2 mm,
电功率 100 W,以时间控制辐射剂量。 无菌水洗涤
照射以后的铁片,并稀释至合适浓度,取 200 μL 稀
释液涂布于培养基 B,35 ℃恒温培养 12 h,用打孔
器将已萌发菌落挑走舍弃,平板继续放置 35 ℃恒温
箱培养至 18 h,挑出生长延迟的菌落,即为疑似交替
呼吸突变株初筛菌,将其移至培养基 A,35 ℃恒温
培养至孢子成熟,准备进一步验证。
从筛选平板上初筛出 60 株菌株,收集孢子,
调整至密度约 107个 / mL 的孢子悬液,取 1 mL 孢
子悬液接种于种子培养基内, 35 ℃、200 r / min 摇
瓶培养 12 h 后,取样测定菌体的基础交替呼吸强
度,从中筛选出 10 株交替呼吸强度相对较高的菌
株,进一步开展富马酸发酵,结果见表 2。 由表 2
可知:10 株 SHAM 敏感型菌株的基础交替呼吸强
度比出发株提升 1 倍以上,达到了总呼吸强度的
32% ~52%;而富马酸的产量反而有所下降,并未
达到通过增加交替呼吸强度来提高富马酸产量的
预想。 菌株 S 1 的基础交替呼吸强度达到了总呼
吸的 52%,是出发菌株的 3􀆰 5 倍,而富马酸产量却
下降了 36%。
表 2  诱变菌株初始交替呼吸强度和富马酸产量
Table 2  The alternative respiration ratio and fumaric acid production of mutants
菌株 基础交替呼吸强度 / %
ρ(富马酸) /
(g·L-1)
转化率 /
(g·g-1) 菌株
基础交替
呼吸强度 / %
ρ(富马酸) /
(g·L-1)
转化率 /
(g·g-1)
S 1 52 28 0􀆰 41 S 31 44 32 0􀆰 45
S 4 45 33 0􀆰 45 S 43 35 39 0􀆰 48
S 12 38 37 0􀆰 46 S 46 37 37 0􀆰 41
S 17 40 34 0􀆰 44 S 52 32 39 0􀆰 51
S 19 45 32 0􀆰 43 F 14 15 44 0􀆰 59
S 24 48 30 0􀆰 40
图 1  S 1与 F 14的糖耗与产酸曲线
Fig􀆰 1  Glucose consumption and fumaric acid
production of S⁃1 and F⁃14
2􀆰 2  突变株 S 1与原始菌株 F 14的富马酸发酵
进程
    考察米根霉交替呼吸突变株 S 1 与原始菌株
F 14的富马酸合成过程中糖耗和富马酸生成情
况,结果见图 1。 由图 1 可知:在发酵前期,S 1糖
耗与 F 14 相比相对较快;当发酵进入到 24 h 以
后,糖耗开始减慢,并逐渐低于 F 14;发酵结束后,
S 1富马酸的产量为 28 g / L,远远低于 F 14 富马
酸的产量(42 g / L),发酵液中残糖高达 18 g / L。
2􀆰 3  交替呼吸强度与富马酸生产强度的关联性
考察菌株 S 1 和 F 14 发酵过程中的交替呼
吸强度与富马酸生产强度之间的关系,结果见图 2。
由图 2可知:在产酸发酵前期(0 ~ 24 h),交替呼吸
强度与富马酸生产速率在表观上具有一致性,当交
替呼吸强度达到最大时(发酵 24 h),生产速率也达
到最大值,这与 Xu等[12]之前得到的结论基本吻合。
S 1菌株在发酵前期的交替呼吸强度明显高于原
始菌,这也验证了在发酵前期突变株 S 1糖耗快于
出发株 F 14(图 1),但 S 1 菌株的富马酸生产强
度却低于 F 14;发酵中后期(24~60 h),S 1 的交
替呼吸强度迅速下降,下降幅度大于F 14,在发酵
28 h左右,F 14的交替呼吸强度开始大于 S 1,此
时 F 14富马酸生产强度始终高于 S 1。 突变株
S 1在发酵初期通过较强的交替呼吸作用虽然能
提高糖耗速率,但并不利于富马酸的高效积累,其
82 生  物  加  工  过  程    第 13卷 
原因可能与发酵早期细胞的能量储备及代谢调控
有关;突变株在发酵中后期交替呼吸强度迅速下降
来调节能量平衡,从而影响后期的糖耗及产物合
成。 可见,交替呼吸的调节对富马酸合成有影响,
集中在发酵中后期进行调节,将更有利于富马酸的
生成。
图 2  交替呼吸及富马酸生产强度的关系
Fig􀆰 2  Time courses of alternative respiration ratio and
fumaric acid productivity of S⁃1 and F⁃14
2􀆰 4  菌株 S 1与 F 14总呼吸强度的比较
考察 S 1和 F 14 这 2 株菌株总呼吸强度的
变化情况,结果见图 3。 由图 3可知:S 1 的总呼吸
强度随着发酵的进行而下降,当进入到中后期,开
始迅速下降;虽然 F 14也呈现下降的趋势,但是下
降幅度明显小于 S 1。 分析原因认为,米根霉在发
酵初期,标准呼吸将提供充足的能量以供应菌体生
长以及酶系的调节,如果发酵前期供氧不足,在发
酵后期,菌体代谢体系将调整交替呼吸与标准呼吸
平衡,从而导致交替呼吸迅速下降,这也可能是糖
耗以及富马酸生产强度明显慢于 F 14的原因。 通
过比较 2株菌的总呼吸情况进一步发现,S 1 发酵
过程中存在提前衰老现象,因而科学并合理地调节
胞内能量代谢来提高菌体的产物积累速率就显得
尤为重要。
2􀆰 5  胞内还原力的比较
通过胞内还原型辅酶(NADH)和氧化型辅酶
(NAD+)的摩尔比值来进一步考察 S 1和 F 14发
图 3  菌株 S 1与 F 14总呼吸曲线
Fig􀆰 3  Time courses of the total respiratory
rate of S⁃1 and F⁃14
酵过程中胞内还原力的变化,结果见图 4。 由图 4
可知:同交替呼吸变化趋势一样,发酵前期,S 1和
F 14 胞内还原力逐渐上升,S 1 的 n(NADH) /
n(NAD+)高于 F 14,而此时 S 1菌株的糖耗速率
也大于 F 14,随着发酵的进行,S 1和 F 14的胞
内还原力逐渐下降,而 S 1的胞内还原力开始低于
图 4  菌株 S 1与 F 14 NADH / NAD+曲线
Fig􀆰 4  Time courses of NADH / NAD+
ratio of S⁃1 and F⁃14
F 14,而此时 S 1 菌株的糖耗速率也小于F 14。
整个过程中存在着相似的规律,胞内还原力越高,
糖耗越快。 这可能是跟富马酸发酵过程的碳代谢
和能量供应有关。 Lambers[2]研究发现,交替呼吸链
每传递 2个电子只产生 1 分子 ATP; 而经典呼吸每
传递 2个电子可产生 2􀆰 5 分子 ATP;当经典呼吸强
度较大时,胞内 ATP 含量增多,ATP 会对 EMP 途径
中的关键酶———磷酸果糖激酶起到抑制作用,从而
抑制 EMP 途径,并最终降低还原力 n ( NADH) /
n(NAD+),反之,当交替呼吸强度较大时,电子通过
交替呼吸链时产生较少的 ATP,从而保证了 EMP 的
畅通,所以胞内还原力 n(NADH) / n(NAD+)的值较
大,糖耗较快。
92  第 3期 孙小龙等:米根霉交替呼吸途径高活性突变株的选育及其对富马酸合成的影响
3  结论
通过 SHAM敏感型突变株的筛选,获得了 1株基
础交替呼吸强度大幅增加的米根霉突变菌株S 1,该
菌株的基础交替呼吸强度是出发菌株F 14的 3􀆰 5
倍;然而,该菌株富马酸积累量(28 g / L)却远低于出
发菌株(42 g / L)。 突变株在富马酸发酵初始阶段过
高的交替呼吸强度反而降低了富马酸的生产速率,
并导致了发酵后期菌体的早衰现象。 因此,针对富
马酸发酵过程需调节菌株在不同阶段的交替呼吸
强度,而非仅仅增加基础交替呼吸强度。
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(责任编辑  荀志金)
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