全 文 ：第 １３卷第 ３期
２０１５年 ５月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 ３
Ｍａｙ ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０３􀆰 ００７
收稿日期：２０１４－０１－１２
基金项目：国家重点基础研究发展计划（９７３计划）（２０１３ＣＢ７３３６００）；国家高技术研究发展计划（８６３计划）（２０１１ＡＡ０２Ａ２０６）；国家自然科学基
金（２１１０６０６５）
作者简介：吕春微（１９８８—），女，江苏新沂人，硕士研究生，研究方向：微生物细胞生理；李　 霜（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｌｉｓｈｕａｎｇ＠ ｎｊｔｅｃｈ．ｅｄｕ．ｃｎ
耐高糖米根霉菌株的生理特性
吕春微，徐　 晴，陈　 姣，李　 霜
（南京工业大学 生物与制药工程学院 材料化学工程国家重点实验室，江苏 南京 ２１０００９）
摘　 要：高糖发酵是提高产物浓度的常用方法，但天然菌株不能耐受高的糖浓度。 为了解析高糖环境对菌株生理
代谢的影响，以驯化获得的耐高糖菌株和原始菌株为对象，研究不同糖浓度对二者生理特性的影响。 结果发现：与
原始菌株相比，耐高糖菌株细胞膜不饱和脂肪酸的含量、胞内三磷酸腺苷（ＡＴＰ）含量较高，且表现出更强的侧系呼
吸强度。 在此基础上，尝试通过调节碳氮比（Ｃ ／ Ｎ）或添加甘氨酸的方式补足原始菌株的代谢不足。 结果表明：在
１５０ ｇ ／ Ｌ糖质量浓度条件下，调节 Ｃ ／ Ｎ为 ５００ 时，原始菌株富马酸产量可由 ３７􀆰 ４ ｇ ／ Ｌ 增至 ４０􀆰 ２ ｇ ／ Ｌ。 而添加 ０􀆰 ５
ｇ ／ Ｌ甘氨酸，原始菌株富马酸产量可以增至 ４３􀆰 ８ ｇ ／ Ｌ，提高了 １７􀆰 １％。
关键词：米根霉；富马酸；生理代谢；高糖
中图分类号：Ｑ９３９􀆰 ９７　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０３－００３６－０５
Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ａ ｈｉｇｈ⁃ｇｌｕｃｏｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ
ＬＹＵ Ｃｈｕｎｗｅｉ，ＸＵ Ｑｉｎｇ，ＣＨＥＮ Ｊｉａｏ，ＬＩ Ｓｈｕａｎｇ
（Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ⁃Ｏｒｉｅｎｔｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１０００９，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ ｉｓ ａ ｃｏｍｍｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ
ｉｎｄｕｓｔｒｙ． Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｎａｔｕｒａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｃａｎ ｎｏｔ ｗｉｔｈｓｔａｎｄ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ． Ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｉｍ ｏｆ ｅｌｕｃｉｄａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ
ｏｆ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｎ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ｆｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｅｒ Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ，ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ
ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ， ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ （ＡＴＰ） ｌｅｖｅｌ，ａｎｄ ｔｈｅ ｓａｌｉｃｙｌｈｙ⁃ｄｒｏｘａｍｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ
ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｒｅｎｔ ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈ⁃ｇｌｕｃｏｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ ａｔ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ． Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｒｅｎｔ ｓｔｒａｉｎ，ｔｈｅ ｈｉｇｈ⁃ｇｌｕｃｏｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ
ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ ｈｉｇｈｅｒ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｈｉｇｈｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｌｕｉｄｉｔｙ，ｈｉｇｈｅｒ ＡＴＰ ｌｅｖｅｌ ａｎｄ
ｓｔｒｏｎｇｅｒ ｓａｌｉｃｙｌｈｙ⁃ｄｒｏｘｍｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ． Ｔｏ ｃｏｍｐｅｎｓａｔｅ ｔｈｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ ｉｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｏｆ ｔｈｅ
ｐａｒｅｎｔ ｓｔｒａｉｎ， Ｃ ／ Ｎ ｒａｔｉｏ ｗａｓ ａｄｊｕｓｔｅｄ ｏｒ ｇｌｙｃｉｎｅ ｗａｓ ａｄｄｅｄ． Ｉｎ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ １５０ ｇ ／ Ｌ ｇｌｕｃｏｓｅ
ｍｅｄｉｕｍ，ａｎｄ ５００ Ｃ ／ Ｎ，ｆｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄ ｃｏｕｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｆｒｏｍ ３７􀆰 ４ ｔｏ ４０􀆰 ２ ｇ ／ Ｌ． Ｔｈｅ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ０􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ
ｇｌｙｃｉｎｅ ａｌｓｏ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｆｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄ ｂｙ １７􀆰 １％， ｉｔ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｏ ４３􀆰 ８ ｇ ／ Ｌ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ； ｆｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄ； ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ； ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ
　 　 富马酸是一种重要的 Ｃ４ 二羧酸，被广泛应用
于食品、饲料、树脂合成等领域，随着全球石油资源
的不断消耗和枯竭，发酵法生产富马酸愈来愈受到
人们的广泛关注［１－２］。 米根霉被认为是富马酸的最
优生产菌株之一［３］，但在批次发酵中，产物富马酸
的质量浓度较低，仅为 ３０ ｇ ／ Ｌ 左右，增加了后续分
离成本，削弱了生物基富马酸与石油基产品的竞争
优势。
高糖发酵具有产物单位浓度高、设备利用率
高、提取工艺简单等优点，在工业发酵中被广泛应
用。 目前，工业上高糖发酵往往采用流加补料的方
式实现，但这种方式存在底物利用率低、染菌概率
大、需要增加额外能耗及设备投资等问题［４－６］，主要
是自然微生物不能耐受高浓度的底物。 针对这一
问题，研究者多采用菌种诱变选育、高糖驯化等方
式对菌株进行改造，以期提高其糖耐受性。
笔者所在实验室成员在前期研究过程中，亦通
过高糖驯化的方法获得了具有较高葡萄糖耐受能
力的富马酸发酵菌株。 本文中，笔者拟以前期获得
的耐高糖菌株及原始菌株（不耐受高葡萄糖浓度）
为研究对象，对 ２株菌生理代谢差异进行比较，发掘
影响菌株糖耐受性的关键生理因子，揭示微生物在
高糖胁迫下的应激响应机制，以期为进一步提高米
根霉高糖发酵水平奠定理论基础。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料
１􀆰 １􀆰 １　 菌种
耐高糖米根霉（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ Ｈ１５），为 Ｒｈｉｚｏｐｕｓ
ｏｒｙｚａｅ ＭＥ Ｆ１４的突变株，保藏于南京工业大学代谢
工程实验室。
１􀆰 １􀆰 ２　 培养基及培养条件
马铃薯葡萄糖琼脂（ＰＤＡ）斜面培养基（ｇ ／ Ｌ）：
去皮马铃薯 ２００、蔗糖 ２０、琼脂 ２０。 ｐＨ自然。
种子培养基（ｇ ／ Ｌ）：葡萄糖 ３０、尿素 ２０、ＫＨ２ＰＯ４
０􀆰 ６、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０􀆰 １１、ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ４ ０􀆰 ００８ ８；ｐＨ
２􀆰 ５。 培养条件为 ２５０ ｍＬ摇瓶装液量 ５０ ｍＬ，３５ ℃、
２００ ｒ ／ ｍｉｎ，培养 ３０ ｈ。
发酵培养基（ ｇ ／ Ｌ）：葡萄糖 ８０、１２０、１５０，尿素
０􀆰 ２，ＣａＣＯ３为中和剂；ｐＨ 自然。 其他成分与预培养
基相同。 培养条件为 ２５０ ｍＬ摇瓶装液量 ４０ ｍＬ，以
体积分数 １０％接入种子液，于 ３５ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ培养
３～４ ｄ。
１􀆰 ２　 分析方法
１􀆰 ２􀆰 １　 生物量的测定
菌体抽滤，无菌水洗涤，抽干，６０ ℃烘干至恒质
量后称质量，取平均值［７］。
１􀆰 ２􀆰 ２　 葡萄糖浓度的测定
参照文献［８］使用 ＳＢＡ ４０Ｃ 型生物传感分析
仪测定葡萄糖浓度。
１􀆰 ２􀆰 ３　 富马酸产量的测定
由戴安 Ｐ６８０型高效液相色谱检测［８］。 具体条
件：Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ工作站，Ｓｅｐａｘ ＨＰ Ｃ１８ 色谱柱（２５０
ｍｍ×４􀆰 ６ ｍｍ，５ μｍ），流动相为 ０􀆰 １％磷酸 乙腈溶
液（体积比为 ９６􀆰 ５ ∶ ３􀆰 ５），流速 ０􀆰 ６ ｍＬ ／ ｍｉｎ，柱温 ２５
℃，紫外检测波长 ２１０ ｎｍ，进样量 ２０ μＬ。
１􀆰 ２􀆰 ４　 细胞膜脂肪酸的测定
细胞膜脂肪酸样品的制备按照文献［９］的方
法进行。 气相色谱分析条件： Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｎｎｉｇａｎ
ＧＣ２０００ ＤＳＱ型气相色谱仪，色谱柱 ＤＢ ５ＭＳ（３０
ｍｍ× ０􀆰 ３２ ｍｍ，０􀆰 ２５ μｍ）；载气 Ｈｅ，载气流量 １
ｍＬ ／ ｍｉｎ。 升温程序：初始温度 ８０ ℃，以 ４０ ℃ ／ ｍｉｎ
速率升温，升到 ２００ ℃，然后继续以 １０ ℃ ／ ｍｉｎ 速
率升温到 ３００ ℃。 传输线温度 ２５０ ℃，电离方式
ＥＩ，７０ ｅＶ，扫描范围 ５０ ～ ６００ ａｕｍ。 接口温度 ２５０
℃，进样温度 ２５０ ℃。
１􀆰 ２􀆰 ５　 三磷酸腺苷（ＡＴＰ）含量的测定
胞内样品的制备根据文献［１０］的方法进行改
进。 取菌体 １ ｍＬ 于 － ４０ ℃甲醇中猝灭 ５ ｍｉｎ，
－８ ℃ ５ ０００ ｇ 离心 ５ ｍｉｎ，加入 １ ｍＬ ５０％高氯酸
冰浴 １０ ｍｉｎ，滴加一定量的 Ｋ２ＣＯ３中和，５ ０００ ｇ离
心 １０ ｍｉｎ。 上清液用于检测 ＡＴＰ。 高效液相色谱
检测，戴安 Ｐ６８０，Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ 工作站，Ｓｅｐａｘ ＨＰ
Ｃ１８ 色谱柱（２５０ ｍｍ×４􀆰 ６ ｍｍ，５ μｍ）。 流动相为
磷酸 盐 缓 冲 液 （ １０􀆰 ９３ ｇ ＮａＨ２ ＰＯ４ 和 ３􀆰 ０４ ｇ
Ｎａ２ＨＰＯ４溶于纯水中，加入四丁基溴化铵 ３􀆰 ２２ ｇ，
调节 ｐＨ为 ６􀆰 ５，真空抽滤定容至 １ Ｌ）和乙腈（体
积比为 ８６ ∶ ４）；流速 １ ｍＬ ／ ｍｉｎ；检测波长 ２５４ ｎｍ；
柱温 ３５ ℃。
１􀆰 ２􀆰 ６　 渗透压的测定
发酵液渗透压采用 ＯＳＭＯＭＡＴ０３０ 冰点渗透压
仪测定［１１］。
１􀆰 ２􀆰 ７　 侧系呼吸强度测定
发酵 ３６ ｈ，采用液相氧电极 Ｃｈｌｏｒｏｌａｂ ３ 测
定［１２］。 测定呼吸速率 １ ～ ２ ｍｉｎ 后，取 ３０ ｇ ／ Ｌ 的水
杨氧肟酸（ＳＨＡＭ）３０ μＬ，继续测定 １ ～ ２ ｍｉｎ，记录
加入菌体初始的呼吸速率 Ｒ１及加入 ＳＨＡＭ 之后的
呼吸速率 Ｒ２，侧系呼吸强度由式（１）计算。
侧系呼吸强度 ＝ （Ｒ１ － Ｒ２） ／ Ｒ１ ×１００％ （１）
７３　 第 ３期 吕春微等：耐高糖米根霉菌株的生理特性
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 高低糖条件下菌株发酵特性的比较
分别将耐高糖菌株及原始菌株接入葡萄糖质
量浓度为 ８０、１２０和 １５０ ｇ ／ Ｌ的发酵培养基中培养，
考察其生长情况，结果见图 １。 由图 １ 可知：在低糖
浓度下，２株菌的发酵差异不明显。 发酵 ６０ ｈ时，富
马酸产量约为 ２９ ｇ ／ Ｌ。 但随着糖浓度的增加，２ 株
菌差异逐渐显现。 当糖质量浓度为 １２０ ｇ ／ Ｌ 时，耐
高糖菌株的整体发酵时间为 ８４ ｈ，发酵结束时，富马
酸产量达 ３７􀆰 ７ ｇ ／ Ｌ，而原始菌株发酵 １２０ ｈ 后葡萄
糖才被完全消耗，富马酸产量为 ３１􀆰 ０３ ｇ ／ Ｌ。 当糖质
量浓度增至 １５０ ｇ ／ Ｌ 时，发酵 １０８ ｈ，耐高糖菌株富
马酸产量达 ４１􀆰 ６ ｇ ／ Ｌ，而此时原始菌株富马酸产量
仅为 ３５􀆰 ３６ ｇ ／ Ｌ。 表明在高糖浓度下，经多次传代驯
化后的富马酸生产菌细胞代谢可能发生了变化，从
而能够耐受外界较高的糖浓度。
２􀆰 ２　 菌株耐高糖生理特性的研究
２􀆰 ２􀆰 １　 高糖环境对细胞膜脂肪酸组分的影响
细胞膜是菌体应对环境变化的第一道屏障，决
定了糖是否能够顺利进入细胞，参与代谢。 在对耐
高糖菌株生理代谢的研究中，考察高糖胁迫条件下
原始菌株与耐高糖菌株细胞膜组分的变化，结果见
表 １。 由表 １可知：随着糖浓度的增加，２ 株菌总不
饱和脂肪酸（ＴＵＦＡ）含量及不饱和与饱和脂肪酸的
质量比例 （Ｕ ／ Ｓ） 均逐渐上升，而总饱和脂肪酸
（ＴＳＦＡ）则逐渐下降，且存在明显差异。 当糖质量浓
度为 ８０ ｇ ／ Ｌ 时，耐高糖菌株中 ＴＵＦＡ 质量分数为
６０􀆰 ５４％，较原始菌株（４８􀆰 ７６％）高 １１􀆰 ７８％，而 Ｕ ／ Ｓ
较原始菌株高 ６１％；当葡萄糖质量浓度高达 １５０
ｇ ／ Ｌ时，耐高糖菌株与原始菌株细胞膜脂肪酸组分
的差异愈加明显，耐高糖菌株中 ＴＵＦＡ 比原始菌株
质量分数高出 １７􀆰 ２９％，Ｕ ／ Ｓ 比例较原始菌株提高
了 １０８％。 上述结果表明，在响应外界高糖环境时，
　 　 　 　 　
菌株细胞膜的脂肪酸组分发生改变，不饱和脂肪酸
组分增多，增加细胞的流动性，促进底物进入细胞，
更好地适应外界环境。
图 １　 不同初糖浓度条件下原始菌株与耐高糖
菌株富马酸发酵曲线
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ｆｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｐａｒｅｎｔ
ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ｈｉｇｈ⁃ｇｌｕｃｏｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ｕｎｄｅｒ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ
表 １　 不同糖浓度条件下，原始菌株与耐高糖菌株细胞膜脂肪酸成分的变化
Ｔａｂｌｅ １　 Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｒｅｎｔ ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ｈｉｇｈ⁃ｇｌｕｃｏｓｅ
ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ
ρ（葡萄糖） ／
（ｇ·Ｌ－１） 菌株
质量分数 ／ ％
Ｃ１８ ∶ ０ Ｃ１８ ∶ １ Ｃ１８ ∶ ２ Ｃ１８ ∶ ３ Ｃ２０ ∶ ０ Ｃ２０ ∶ １ ＴＵＦＡ ＴＳＦＡ
Ｕ ／ Ｓ
８０
原始菌株 ２６􀆰 ９７ ２􀆰 １４ ７􀆰 ３９ ４１􀆰 ４５ １６􀆰 ９０ ５􀆰 １７ ４８􀆰 ７６ ５１􀆰 ２４ ０􀆰 ９５
耐高糖型菌株 １４􀆰 ６３ ２􀆰 ６４ ７􀆰 ６７ ５２􀆰 １４ １７􀆰 １６ ５􀆰 ７６ ６０􀆰 ５４ ３９􀆰 ４６ １􀆰 ５３
１５０
原始菌株 ２５􀆰 ０６ ２􀆰 ０７ ７􀆰 ４５ ４４􀆰 ７０ １５􀆰 １２ ５􀆰 ６０ ５２􀆰 ３７ ４７􀆰 ６３ １􀆰 １０
耐高糖型菌株 ３􀆰 ４４ ２􀆰 ８４ ７􀆰 １４ ６１􀆰 ９８ １９􀆰 ７６ ４􀆰 ８４ ６９􀆰 ６６ ３０􀆰 ３４ ２􀆰 ２９
８３ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
２􀆰 ２􀆰 ２　 高糖环境对胞内 ＡＴＰ 含量的影响
ＡＴＰ 是胞内的能量货币，是细胞代谢的重要参与
者。 考察了在不同底物浓度下，原始菌株与耐高糖菌
株胞内 ＡＴＰ 的变化，结果见表 ２。 由表 ２ 可知：在同
一糖浓度下，耐高糖菌 ＡＴＰ 含量明显高于原始菌株，
且随着糖浓度的增加，２株菌胞内 ＡＴＰ 含量差异逐渐
增大，在 ８０ ｇ ／ Ｌ葡萄糖条件下，原始菌胞内 ＡＴＰ 含量
为 ０􀆰 ３７ ｎｍｏｌ ／ ｍｇ，耐高糖菌为 ０􀆰 ４１ ｎｍｏｌ ／ ｍｇ；当糖质
量浓度增加到 １５０ ｇ ／ Ｌ 时，原始菌胞内 ＡＴＰ 为 ０􀆰 ４４
ｎｍｏｌ ／ ｍｇ，耐高糖菌为 ０􀆰 ７６ ｎｍｏｌ ／ ｍｇ。 产生这种现象
的原因可能是随着糖浓度的增加，糖酵解和三羧酸循
环（ＴＣＡ）等途径调控作用显现，并伴随着胞内 ＡＴＰ
再生速度的显著加快［１３］。 而耐高糖菌株胞内较高的
ＡＴＰ 为细胞在高糖环境下提供了更多的代谢动力，从
而实现对外界不良环境的抵御。
表 ２　 不同糖浓度条件下原始菌株与耐高糖
菌株的胞内 ＡＴＰ浓度
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ＡＴＰ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｐａｒｅｎｔ ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ｈｉｇｈ⁃ｇｌｕｃｏｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ
ｓｔｒａｉｎ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ
ρ（葡萄糖） ／
（ｇ·Ｌ－１）
ＡＴＰ 含量 ／ （ｎｍｏｌ·ｍｇ－１）
原始菌株 耐高糖菌株
８０ ０􀆰 ３７ ０􀆰 ４１
１５０ ０􀆰 ４４ ０􀆰 ７６
２􀆰 ２􀆰 ３　 高糖环境对细胞呼吸特性的影响
考察高糖浓度对发酵液的渗透压，结果见表 ３。
由表 ３可知：当糖质量浓度由 ８０ ｇ ／ Ｌ 增至 １５０ ｇ ／ Ｌ
时，发酵液的渗透压由 １􀆰 ３６ ｋＰａ增至 ２􀆰 ４４ ｋＰａ。 高
渗环境可能会引起胞内活性氧（ＲＯＳ）水平的变化，
从而使细胞遭受毒害，减少 ＲＯＳ 的产生，成为提高
菌体抵御高渗环境的关键。 电子传递链复合物Ⅲ
是 ＲＯＳ的主要产生位点，产生２０％～８０％的超氧阴
离子 Ｏ－２·，而本课题组 Ｇｕ等［１４］在前期研究中发现，
米根霉产富马酸的过程中除了电子传递链还存在
着 １条侧系呼吸途径，该途径能够绕过复合物Ⅲ和
Ⅳ，由交替氧化酶（ＡＯＸ）直接将泛醌的电子交给终
端受体 Ｏ２（图 ２），有助于降低胞内 ＲＯＳ 的产生，从
而有望增强菌株的抗胁迫能力。 基于这一认识，笔
者对原始菌株及耐高糖菌株在不同糖浓度下的侧
系呼吸强度进行了测定，结果见表 ４。 由表 ４ 可知：
随着糖浓度的增加，细胞侧系呼吸强度逐渐增强。
而在同一糖浓度下，耐高糖菌株的侧系呼吸强度明
显高于原始菌株，当糖质量浓度达 １５０ ｇ ／ Ｌ 时，耐高
糖菌株的侧系呼吸强度为 ４６􀆰 ７％，而原始菌株仅为
３８􀆰 ５％。 此实验结果进一步证实了侧系呼吸途径在
减少 ＲＯＳ产生中的重要作用。
表 ３　 不同糖浓度条件下发酵液渗透压的变化
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｏｓｍｏｌａｌｉｔｙ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ
ρ（葡萄糖） ／ （ｇ·Ｌ－１） 发酵液渗透压 ／ ｋＰａ
８０ １􀆰 ３６
１５０ ２􀆰 ４４
图 ２　 标准呼吸链和侧系呼吸链酶系［１４］
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｅｎｚｙｍｅｓ ｏｆ ＣＮ⁃ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ＳＨＡＭ⁃ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ［１４］
９３　 第 ３期 吕春微等：耐高糖米根霉菌株的生理特性
表 ４　 不同糖浓度条件下原始菌株与耐高糖菌株
侧系呼吸强度的变化
Ｔａｂｌｅ ４　 Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ＳＨＡＭ⁃ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｒｅｎｔ
ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ｈｉｇｈ⁃ｇｌｕｃｏｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ｕｎｄｅｒ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ
ρ（葡萄糖） ／
（ｇ·Ｌ－１）
侧系呼吸强度 ／ ％
原始菌株 耐高糖菌株
８０ ３３􀆰 ６ ３７􀆰 １
１５０ ３８􀆰 ５ ４６􀆰 ７
２􀆰 ３　 外源添加对米根霉高糖发酵产富马酸的影响
菌种选育是目前提高菌株糖耐受性的主要方
法，但菌种选育的随机性较大，且存在传代多次后
退化的潜在风险。 若能够通过简单的发酵工艺调
控，即能增强菌株对高糖的耐受性，将极大地简化
工艺，提高效率。 笔者拟基于上述对菌株耐高糖机
制的解析，探讨利用外源添加的方法补充原始菌株
在生理代谢上的不足，以期提高菌株糖耐受能力。
２􀆰 ３􀆰 １　 调节 Ｃ ／ Ｎ，提高米根霉产富马酸过程的糖耐
受性
高氮含量能够激活 ＴＣＡ 循环的关键酶柠檬酸
合酶，从而有望合成更多的 ＡＴＰ，供菌体抵御外界
环境胁迫。 以原始菌株为研究对象，分别考察不同
Ｃ ／ Ｎ条件下，米根霉发酵产富马酸的性能，结果见
图 ３。 由图 ３可知：随着 Ｃ ／ Ｎ的升高，菌株的耗糖速
率逐渐加快，Ｃ ／ Ｎ为 ５００条件下，富马酸的发酵时间
比 Ｃ ／ Ｎ 为１ ５００时缩短了 １２ ｈ，同时富马酸产量由
３７􀆰 ４ ｇ ／ Ｌ增加至 ４０􀆰 ２ ｇ ／ Ｌ。 表明通过 Ｃ ／ Ｎ的调节能
够有效增强菌株的高糖耐受性。
图 ３　 高糖条件下不同 Ｃ ／ Ｎ对富马酸发酵的影响
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｃ ／ Ｎ ｒａｔｉｏｓ ｏｎ ｆｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｕｎｄｅｒ ｈｉｇｈ⁃ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
２􀆰 ３􀆰 ２　 添加甘氨酸，提高米根霉糖耐受性
氨基酸代谢与胞内能量代谢密切相关，能够增
强己糖路径（ＥＭＰ）与三羧酸循环（ＴＣＡ），从而提高
细胞代谢活力，增加细胞抵御不良环境的能力。 而
甘氨酸（Ｇｌｙ）可以在微生物胞内积累到较高浓度而
对胞内其他微生物生理过程没有明显的负面影响。
因此，笔者尝试在高糖发酵初期添加甘氨酸，考察
甘氨酸对富马酸发酵的影响，结果见图 ４。 由图 ４
可知：以未添加甘氨酸的为对照，加入 ０􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ 甘氨
酸的菌株糖耗及产酸速率得到提高，发酵周期缩短
２４ ｈ，富马酸产量由 ３７􀆰 ４ ｇ ／ Ｌ 增加至 ４３􀆰 ８ ｇ ／ Ｌ。 表
明甘氨酸能够促进细胞能力代谢，提高细胞抵御高
糖压力的能力。
图 ４　 高糖条件下添加甘氨酸对富马酸发酵的影响
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｉｎｅ ｏｎ ｆｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｕｎｄｅｒ ｈｉｇｈ⁃ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
３　 结论
通过比较原始菌株与耐高糖菌株的代谢差异，
发现耐高糖菌株细胞膜不饱和脂肪酸含量较高，胞
内 ＡＴＰ 含量增加，抵御 ＲＯＳ 的侧系呼吸途径增强，
表明耐高糖菌株具有更好的流动性、更大的细胞代
谢动力以及抵御高渗环境的能力，从而使得细胞在
高糖条件下具有较优的发酵性能。 基于这一发现，
在高糖质量浓度（１５０ ｇ ／ Ｌ）下，通过调节 Ｃ ／ Ｎ 或添
加甘氨酸以弥补细胞的能量不足。 当 Ｃ ／ Ｎ 为 ５００
时，原始菌株发酵周期可缩短 １２ ｈ，富马酸产量由
３７􀆰 ４ ｇ ／ Ｌ增加至 ４０􀆰 ２ ｇ ／ Ｌ，当添加 ０􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ 甘氨酸
时，原始菌株发酵周期可缩短 ２４ ｈ，富马酸产量由
３７􀆰 ４ ｇ ／ Ｌ增加至 ４３􀆰 ８ ｇ ／ Ｌ。 表明通过外源添加的方
法可以提高细胞的代谢动力，缓解高糖胁迫。
（下转第 ５４页）
０４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷