全 文 ：第 35 卷第 9 期
2015年 5月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vol.35,No.9
May,2015
http: / / www.ecologica.cn
基金项目:山西省青年科技研究基金项目(2012021026鄄1)
收稿日期:2013鄄11鄄26; 摇 摇 网络出版日期:2014鄄07鄄29
*通讯作者 Corresponding author.E鄄mail: xiaochen@ snnu.edu.cn
DOI: 10.5846 / stxb201311262821
阴环,李晓晨.基于线粒体 DNA序列的秦岭地区淡足青步甲种群遗传结构分析.生态学报,2015,35(9):3052鄄3059.
Yin H, Li X C.Population genetic structure of the ground beetle Chlaenius pallipes from the Tsinling Mountains based on mitochondrial DNA analysis.Acta
Ecologica Sinica,2015,35(9):3052鄄3059.
基于线粒体 DNA 序列的秦岭地区淡足青步甲种群遗
传结构分析
阴摇 环1,李晓晨2,*
1 山西师范大学生命科学学院,临汾摇 041004
2 陕西师范大学生命科学学院,西安摇 710062
摘要:淡足青步甲 Chlaenius pallipes是一类重要的天敌昆虫。 为了揭示秦岭地区淡足青步甲的种群遗传分化和种群历史动态,
对 13个地理种群 151个个体的线粒体 Cox1鄄tRNALeu鄄Cox2片段 DNA序列进行了分析。 序列比对后的全长为 1 602 bp,共检测
到 57个多态性位点,定义 65个单倍型,其中 48个为居群内特有单倍型,17个为居群间共享单倍型。 单倍型多样性指数 Hd为
0.972,核苷酸多样性指数 Pi为 0.0025。 该种群遗传分化明显,但 AMOVA分析结果表明变异主要来源于种群内,占变异总量的
92.10%。 SAMOVA和 PERMUT分析结果均表明秦岭地区的淡足青步甲种群不存在明显的谱系地理结构。 结合中性检验、错配
分布和 BSP 分析结果表明该物种发生过种群扩张,且扩张时间大致在 0.100—0.025 Ma之间。
关键词:淡足青步甲;线粒体 DNA;种群结构;数量扩张;秦岭
Population genetic structure of the ground beetle Chlaenius pallipes from the
Tsinling Mountains based on mitochondrial DNA analysis
YIN Huan1, LI Xiaochen2, *
1 College of Life Sciences, Shanxi Normal University, Linfen 041004, China
2 College of Life Sciences, Shaanxi Normal University, Xi忆an 710062, China
Abstract: The ground beetle, Chlaenius pallipes, belonging to the genus Chlaeniu ( Coleoptera: Carabidae), is widely
distributed in East Asia and overwinters as adults. It is highly abundant in northern China and plays an important role in
agriculture and forest pest control. To understand the population genetic differentiation and demographic history of C.
pallipes from the Tsinling Mountains, a 1,602 bp fragment of mitochondrial DNA (Cox1鄄tRNALeu鄄Cox2) was sequenced for
151 individuals from 13 geographical populations from Gansu, Shaanxi, and Henan provinces. Fifty鄄seven polymorphic sites
were identified, of which 45 are parsimony informative, 11 singleton variable sites, and a 1 bp insertion. These polymorphic
sites defined 65 haplotypes, among which 17 were common and 48 were private with relatively lower frequencies. The
haplotype diversity (Hd = 0.972) was hight but the nucleotide diversity was low (P i = 0.0025). The topologies of the
phylogenetic trees obtained based on maximum likelihood (ML) and Bayesian inference were similar. Both ML tree and
Bayesian inference tree revealed two clades (a and b) from node d on the trees. In the haplotype network, a five median
vector was employed and several loops were constructed and“ star phylogeny冶 patterns were present. Analysis of molecular
variance (AMOVA) suggested that most of the variation was due to within鄄population differences ( 92. 10%), while
differences among populations only contributed 7. 90% of the total. The among鄄population FST value was 0. 07897 (P <
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0郾 01). Consequently, we conclude that there is obvious genetic differentiation in the C. pallipes populations we
investigated. For the spatial analysis of molecular variance (SAMOVA), increasing K values from 2 to 12 were selected; the
FCT values were fairly low and fluctuated. Thus, the SAMOVA tests failed to reveal any meaningful phylogeographic
structure. Furthermore, the results of the PERMUT analysis did not suggest any phylogeographic structure of the populations
sampled based on the mtDNA haplotype data, as total NST(0.114) was not significantly higher than GST(0.101; P > 0.05).
The results of the neutrality tests on the total indicated that both the Tajima忆s D and Fu忆s FS were negative values, and the
tests for the values are highly significant (P < 0.01), suggesting demographic expansion. Mismatch distribution analysis
revealed a unimodal frequency distribution of pairwise difference in the total population and in each haplogroup. Both the
neutrality tests and mismatch distribution analysis suggested that this species has undergone a demographic expansion.
Furthermore,we used the Bayesian Skyline Plot (BSP) approach to estimated the demographic history of C. pallipes under
BEAST 1.4.7. The demographic expansion time was identified as being between 0.100 Ma to 0.025 Ma. We found evidence
of constant population size before the end of the Last Glacial Maximum (LGM, between 0.020 and 0.018 Ma) developed in
the Tsinling Mountains. Consequently, we suggest that LGM had little effect on the demographic dynamics of C. pallipes.
Key Words: Chlaenius pallipes; mitochondrial DNA; Population genetic structure; demography expansion;
Tsinling Mountains
秦岭位于我国中部,在动物地理区划上地处东洋界和古北界的分界[1],动物区系组成特殊,同时兼具两
大区系的物种组成[1鄄2],具有较高的动、植物多样性[3鄄4]。 秦岭地区经历过第四纪冰期鄄间冰期的反复[5鄄6],这
一气候事件往往在物种遗传变异的分布上留下痕迹[7鄄11]。 目前利用谱系地理学方法来研究物种遗传多样性
的空间分布模式,探讨景观特征对物种的空间分布的影响变得更为广泛[7]。 通常,在一个地形多样的小区域
内广泛采样,并选用进化速率适当的基因作为分子标记,研究结果可以揭示整个景观内地形对遗传多样性和
遗传连续性的影响[12]。 在秦岭地区开展动、植物遗传多样性状况研究,对于揭示历史环境变化对动、植物分
布格局的影响,对未来开展物种资源保护具有指导意义。
淡足青步甲(Chlaenius pallipes Gebler, 1823)隶属步甲科 Carabidae,青步甲属 Chlaenius,以成虫越冬,在
我国北方常大量发生。 成虫可迁飞,广泛分布于东亚地区[13],是一类值得保护利用的天敌昆虫。 目前对于该
种的相关研究主要集中于区系[14]和生物学特性方面[15鄄16],尚无有关遗传学方面的报道。 本研究为揭示淡足
青步甲种群遗传分化和种群数量动态历史,选用进化速率适中,且被广泛应用于步甲种内遗传分化和系统发
育研究中的线粒体 Cox1鄄tRNALeu鄄Cox2基因片段[17鄄20]作为分子标记,对采自于秦岭地区 13个地理种群的 151
个体进行了测序分析。
1摇 材料与方法
1.1摇 样品来源
本研究所用样品取自 2009—2011年采集于秦岭地区 13个地理种群的 151头淡足青步甲成虫标本,标本
相关采集地信息、所采数量详见图 1和表 1。 所有标本浸泡于无水乙醇中于-20 益保存备用。
1.2摇 DNA提取、PCR扩增和测序
取步甲的翅下肌肉少许置入 1.5 mL 的 EP 管中,在管中加入适量 SDS 裂解液之后,进行充分研磨匀浆,
然后加入蛋白酶 K (与 SDS体积比为 49颐1),50 益水浴过夜,采用标准的苯酚鄄氯仿抽提法进行抽提之后,用 4
益异丙醇沉淀 DNA,70%乙醇洗涤,然后倒置于无菌超净工作台干燥,最后溶解于 20—30 滋L无菌 ddH2O中,
-20 益保存备用。 DNA检测采用 1%琼脂糖凝胶电泳检测法。
参考 Emerson等[18]上游引物序列为:C1鄄J鄄 2092 5忆AGTTTTAGCAGGAGCAATTACTAT3忆;下游引物为:TK鄄
N鄄3782 5忆GAGACCATTACTTGCTTTCAGTCATCT3忆(上海生工生物公司合成)。 每一样品的扩增体系为 25 滋L,
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反应体系为 10伊PCR buffer 2.5 滋L,dNTP2.0 滋L,10 mol / 滋L 引物各 1.0 滋L,约 50 ng / 滋L 模板 DNA 1.0 滋L,
TaqDNA聚合酶 1.25 U,去离子水补充至 25 滋L。 扩增条件为:94 益预变性 2 min后,按以下参数进行 40个循
环: 94 益变性 1 min,50 益退火 1 min,72 益延伸 2 min,最后一个循环之后在 72 益再延伸 10 min。 PCR扩增
产物用 1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测,然后送往上海生工生物公司进行纯化、回收和正反链双向测序。 测
序试剂为 BigDye Terminator v3.1,测序仪器为 ABI鄄PRISM3730全自动 DNA测序仪。
图 1摇 采样点分布图
Fig.1摇 Locations of sampled populations
图中采样点代号对应的种群地理信息见表 1
表 1摇 淡足青步甲采集地信息、样本量和单倍型分布
Table 1摇 Sampling locations, sample size, and haplotypes of C. pallipes
采样点
Sampling location
代号
Code
样本量
Sample
number
纬度 / ( 毅)
Latitude(N)
经度 / ( 毅)
Longitude(E)
单倍型(个体数)
Haplotypes (number
of individuals)
Pi Hd
甘肃临夏县 LX 6 35.49 102.99 T4( 1)、 T13 ( 2)、 T23 ( 1)、 T38(1)、T55(1) 0.0022 0.942
甘肃漳县 ZJ 25 34.81 104.15
T1 ( 2)、 T7 ( 1)、 T14 ( 1)、 T20
(2)、T22(1)、T24(4)、T25(1)、
T39(1)、T40( 1)、T41( 1)、T43
(1)、T45(1)、T48(3)、T55(1)、
T62(2)、T63(1)、T64(1)
0.0028 0.960
甘肃西和县 XH 1 33.87 105.16 T46(1) N.A. N.A.
甘肃岷县 NH 3 34.46 104.23 T45(1)、T54(2) 0.0004 0.667
甘肃迭部县 DB 20 34.06 103.32
T5 ( 1)、 T8 ( 2)、 T11 ( 1)、 T25
(1)、T26(1)、T28(8)、T29(2)、
T30(1)、T58(2)、T59(1)
0.0022 0.837
甘肃舟曲县 ZQ 3 33.69 104.49 T21(2)、T27(1) 0.0004 0.667
甘肃两当县 LDY 5 33.93 106.42 T5 ( 1)、 T8 ( 1)、 T25 ( 1)、 T47(1)、T64(1) 0.0030 1.0
陕西略阳县 LYX 5 33.52 105.91 T6(2)、T8(1)、T56(1)、T57(1) 0.0033 0.900
陕西宁陕县 NSX 4 33.55 108.55 T9( 1)、 T11 ( 1)、 T21 ( 1)、 T53(1) 0.0021 1.0
陕西西安 CA 16 34.15 108.90
T1( 1)、 T10 ( 1)、 T12 ( 1)、 T37
(1)、T47(2)、T49(3)、T52(4)、
T55(1)、T60(2)
0.0022 0.908
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续表
采样点
Sampling location
代号
Code
样本量
Sample
number
纬度 / ( 毅)
Latitude(N)
经度 / ( 毅)
Longitude(E)
单倍型(个体数)
Haplotypes (number
of individuals)
Pi Hd
陕西洛南 LN 19 34.08 110.48
T1 ( 4)、 T3 ( 1)、 T19 ( 1)、 T31
(2)、T32(1)、T34(1)、T42(2)、
T45(2)、T49( 2)、T50( 1)、T51
(1)、T60(1)
0.0022 0.942
河南卢氏县 LS 31 34.25 111.01
T1(8)、T2(2)、T3(1)、T17(1)、
T31(1)、T33( 3)、T34( 3)、T36
(1)、T42(1)、T44(1)、T45(4)、
T60(1)、T61( 1)、T64( 2)、T65
(1)
0.0020 0.910
河南栾川县 LC 13 33.82 111.46 T1( 3)、 T15 ( 1)、 T16 ( 1)、 T18(1)、T21(2)、T35(2)、T49(3) 0.0026 0.897
总计 151 65haplotypes in total 0.0025 0.972
摇 摇 表中出现的采样点代号与图 1对应;Pi,核苷酸多样性;Hd,单倍型多样性;加粗体为居群独有单倍型
1.3摇 DNA序列分析
利用 ClustalX1.83[21]进行序列比对,并用 BioEdit5.0.6 (http: / / iubio.bio. indiana.edu / molbio / seqpup / ) 软
件进行手工矫正和剪切。 利用 DnaSP4.10[22]软件统计单倍型多样性和核苷酸多样性的分布特征。 单倍型系
统发育分析采用 PAUP伊4.0[23]构建最大似然法(ML)树,并利用 MrBayes3.0[24]软件构建贝叶斯(Bayesian)树。
选用采自于秦岭地区的脊青步甲(C. costiger)的两个个体(登录号:JN644139鄄JN644140)作为外群。 运行
ModelTest[25]软件选择最优替换模型,最终选择了 GTR+I+G 模型。 ML 树各节点的支持率根据各单倍型
bootstrap 1 000次重复抽样后获得;对 MCMC 变量运行 4 条马尔科夫链,以随机树为起始树,共运行 125万代,
每 100代进行 1 次抽样,似然值用 Tracer v.1.5[26]观察,去掉似然值不稳定的树作为 burn-in 值,最终去掉
3125棵树。 根据剩余的样本构建一致树,将所得结果进行统计,获得系统树的支系结构以及各支系的后验概
率。 同时,利用 Network4.5.0.2[27]软件通过 Median鄄Joining模型[28]构建了所有单倍型的网状支系图。 其中,空
位处理为第五形状,对于多个碱基的插入、缺失或突变都被认为是通过一步突变形成。
应用 Arlequin3.11[29]软件进行分子变异分析(AMOVA)、中性检验和错配分布分析。 错配分布分析模型
假设为快速扩张模型,模型的有效性采用离差平方和(SSD)和 Harpending忆s raggedness index(R)进行评估,以
上所有参数通过 1000次重复抽样获得。 采用 SAMOVA1.0[30]进行单倍型空间遗传结构分析。 并根据不同的
组数(K值)计算相应的 FCT值。 在本次研究中 K 值分别为 2 到 12 的整数,且运算进行 1 000 次置换检验,同
时,采用 PERMUT[31鄄32]软件估测步甲种群是否具有谱系地理结构并统计种群总的遗传多样性指数(HT)和居
群内平均遗传多样性指数(HS)。
利用 BEAST 1. 4. 7[33]进行了 Bayesian Skyline Plot (BSP)分析[34],选用了 GTR+I +G 模型,Number of
Gamma Categories设置为 4,采用逻辑松散分子钟(Uncorrelated Lognormal),组数为 15(group = 15),马尔科夫
链(MCMC)的长度为 250 000 000,抽样频率为 1 000。 突变率采用 And俨jar等[35]在 GTR+I+G模型下得到的步
甲线粒体 DNA碱基对平均替换率 2.68% / Ma。
2摇 结果与分析
2.1摇 mtDNA遗传多样性和系统发育
共获得了 13个居群 151个成虫个体标记序列,该序列长 1 602 bp,其中包括 882 bp 的 mtCoI基因、658 bp
的 mtCoII基因和 62 bp的 tRNALeu间隔区。 检测到 57个多态性位点,包括 45 个简约信息位点、11 个单变异
位点和发生在 tRNALeu序列上的一个碱基插入位点。 共定义 65个单倍型,分别编号为 T1、T2、…、T65。 所涉
及的单倍型已上交 GenBank数据库保存, 序列号为 JN644074-JN644138。 所有单倍型中有 48个(73.85%)是
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出现频率较低的居群内特有单倍型,17 个(26.15%)是居群间共享单倍型(表 1)。 种群单倍型多样性指数
(Hd)较高为 0.972,而核苷酸多样性指数(P i)为 0.0025。 PERMUTE统计得到种群总的遗传多样性指数(HT =
0.985)和居群内平均遗传多样性指数(HS = 0.885)都很高。
构建的 ML树与 Bayesian树具有极为相似的分支(图 2和图 3),结果显示单倍型在节点 d 处明显分化出
两支(a支和 b支),其它单倍型位于进化树的根部,被认为是分化较早的单倍型。 通过自动引用 5 个中间载
体(mv1鄄5),Network软件构建了单倍型网状支系图(图 4)。 网状支系图基本呈星状分布。
图 2摇 基于淡足青步甲 mtDNA 65个单倍型构建的ML树
Fig.2 摇 Maximum likelihood tree of 65 mtDNA haplotypes of C.
pallipes
图 3摇 基于淡足青步甲 mtDNA 65个单倍型构建的 Bayesian树
Fig. 3 摇 Bayesian inference tree of 65 mtDNA haplotypes of C.
pallipes
2.2摇 遗传结构和谱系地理学分析
AMOVA结果显示种群变异主要来源于种群内,占到总变异量的 92.10%,种群间的变异量仅为 7.90%(表
2)。 统计得到的遗传分化指数 FST在种群间为 0.07897,经置换检验达到极显著水平(P <0.01),认为淡足青
步甲种群遗传分化明显。 SAMOVA检验结果显示估算的 FCT值在 K = 2 到 K = 12 的设定中呈平稳波动状态,
没有明显的增大。 因此通过 SAMOVA检验没有对淡足青步甲种群找到合适的分组方法,表明该种群不存在
明显的谱系地理结构。 同时,PERMUT分析得到的种群遗传分化指数 NST和 GST的值分别为 0.114 和 0.101,
NST值没有显著地大于 GST值(P > 0.05),参考 Pons 和 Petit[32]认为 PERMUT 分析结果与 SAMOVA 检验结果
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一致。
表 2摇 淡足青步甲的 AMOVA 结果
Table 2摇 Results of analysis of molecular variance of C. pallipes
变异来源
Source of variation df
方差平方和
Sum of squares
变异组成
Variance
componentes
变异百分比
Percentage
of variation / %
FST
种群间 Among population 12 43.38 0.16Va 7.90 0.07897**
种群内 Within population 138 256.90 1.86Vb 92.10
总 Total 150 300.28 2.02
摇 摇 ** P < 0.01
图 4摇 淡足青步甲 mtDNA 65个单倍型的网状支系图
Fig.4摇 Network of 65 mtDNA haplotypes of C. pallipes
图中每一个圆代表一个单倍型,圆大小与单倍型频率呈正比
2.3摇 种群数量动态历史
中性检验结果表明,步甲总种群 Fu忆s FS指数值和
Tajima忆s D指数值分别为-25.7459 和-1.8572,均达到
极显著性负值(P<0.01)。 经检验,离差平方和(SSD)
和 Harpending忆s raggedness index(R)指数均没有达到显
著性水平(P>0.05),表明该物种经历过种群快速扩张。
错配分布分析结果在总种群显示出单峰分布(图 5),同
样表明该物种经历过种群扩张。 BSP 分析结果表明秦
岭地区淡足青步甲种群扩张时间大致发生在 0. 1—
0郾 025 Ma,之后种群数量基本保持平稳,但在 0.002 Ma
开始出现种群数量明显下降的趋势。
3摇 讨论
与同域分布的耶屁步甲 Pheropsophus jessoensis[36]和
赤胸梳爪步甲 Dolichus halensis(Schaller) [37]比较,淡足
青步甲种群具有比较高的 HT、Hs 和 Hd值,但核苷酸多
样性指数(P i )值相对较低(P. jessoensis:HT = 0. 960,
Hs = 0. 880,Hd = 0. 963,P i = 0. 0037;D. halensis:HT =
0705,Hs = 0.612,Hd = 0.769,P i = 0.0033;淡足青步甲:
HT = 0郾 985,Hs = 0.885,Hd = 0.972,P i = 0.0025)。 特有
单倍型比例高达 73.85%,造成淡足青步甲具有高的 Hd
值,但这些单倍型往往出现频率低,且分布范围狭窄。
高的 Hd值伴随着低的 P i值,说明该种群可能经历过“瓶
颈效应冶,之后伴随着快速种群增长的历史事件,但扩张历史较短,核苷酸变异积累不充分[7]。 Avise[7]和
Hewitt[10]则认为遗传分化较高的类群,种内往往有多个特有单倍型存在,这一结果可能是由于气候导致的居
群反复收缩与扩张所致。 ML和 Bayesian系统发育树树形成的 a 枝和 b 枝所包含的单倍型极为相似,但两支
均没有与地理分布建立关联性。 一个“星状系统发育(star phylogeny)冶往往代表着一个经历“种群瓶颈冶之后
扩张的种群[38]。 构建的网状支系图基本呈星状分布说明该种群经历过种群扩张。
Avise认为共域分布的近缘物种往往具有共同的谱系地理模式[7]。 AMOVA分析结果表明淡足青步甲遗
传分化明显,但绝大多数的遗传变异来自于居群内,占总变异量比例高达 92.10%,而居群间遗传变异所占的
比例小。 此外,SAMOVA分析和 PERMUTE分析结果一致表明秦岭地区的淡足青步甲种群不存在明显的谱系
地理结构,在该地区分布的 P. jessoensis种群和 D. halensis种群同样具有这一遗传结构特征[36鄄37]。 P. jessoensis
7503摇 9期 摇 摇 摇 阴环摇 等:基于线粒体 DNA序列的秦岭地区淡足青步甲种群遗传结构分析 摇
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图 5摇 淡足青步甲种群的错配分布图
Fig.5摇 Mismatch distribution analysis for C. pallipes population
成虫不善飞翔,而 D. halensis 和淡足青步甲个体小,不
善于进行远距离迁飞,理论上讲,这三种步甲不但受限
于自身的扩散能力,而且受到山脉形成的天然屏障的阻
隔,种群间的基因交流不频繁,从而会导致种群间产生
遗传分化。 但研究发现这三种步甲种群的遗传分化主
要体现于种群内,种群间并没有形成明显的谱系地理结
构。 自然因素(比如风力)和人为因素都可能促进种群
间的基因交流,降低遗传分化程度。 同时,秦岭地区在
第四纪经历了不止一次冰期[5],冰期后,继“奠基者效
应冶之后的往往是种群扩张。 冰期—间冰期反复出现,
往往会导致物种不止一次的扩张,增加了基因交流的可
能性。 秦岭地区山体宽大,沟壑相通,山脉并没有为步
甲的扩散提供有效屏障。
图 6摇 淡足青步甲种群的 BSP分布图
Fig.6摇 Bayesian skyline plot of C. pallipes population
Brower[39]提出的昆虫线粒体 DNA的平均碱基对替
换率为 2.3% / Ma曾被广泛采用(包括步甲在内) [19鄄20]。
随后从采用地质事件作为分子钟估算物种支系分歧时
间的相关报道中发现,分子标记的替换饱和常因采用不
同的替换模型拟合结果存在差异[35,40]。 And俨jar 等[35]
在联合多个线粒体基因片段(包括 Cox1 在内)作为
DNA分子标记,选用 GTR+I+G 模型,得出步甲平均碱
基对替换率为 2.68% / Ma。 本文运行 ModelTest 软件选
择的最优替换模型是 GTR+I+G模型,因此参考 And俨jar
等人的研究结果,以平均碱基对替换率为 2.68% / Ma 作
为 BSP 分析的分子钟校正时间标准,结果显示秦岭地
区分布的淡足青步甲在 0.100—0.025 Ma之间发生过种
群扩张,之后种群数量基本保持平稳,但在0.002 Ma开
始出现种群数量明显下降的趋势。 秦岭在第四纪经历了四次冰期,晚更新世的玉皇冰期是第四纪古气候变化
最剧烈的一次。 冰川规模有大变小,分布位置越来越高,尤其是发生于 0.07—0.01 Ma之间的末次冰期仅作用
于太白山顶部[5,41]。 BSP 研究结果表明在末次冰期,包括发生于 0.021—0.018 Ma的末次盛冰期(LGM)期间,
淡足青步甲种群大小没有呈现出下降的趋势。 因此,认为 LGM 对秦岭地区的淡足青步甲种群影响不大,从
0.002 Ma开始出现的种群数量下降现象很可能是人为因素所致。
4摇 结论
通过 mtDNA Cox1鄄tRNALeu鄄Cox2基因片段的测定与分析,研究结果表明:淡足青步甲种群遗传多样性高,
遗传分化明显,但没有形成明显的谱系地理结构。 该种群经历过扩张,时间发生在 0.100—0.025 Ma 之间,认
为第四纪冰期的反复、秦岭特殊复杂的地貌和人为因素是造成该物种目前分布格局的主要因素。
参考文献(References):
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