全 文 ：第 １２卷第 ４期
２０１４年 ７月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １２ Ｎｏ􀆰 ４
Ｊｕｌ􀆰 ２０１４
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１４􀆰 ０４􀆰 ００７
收稿日期：２０１３－０４－１６
基金项目：国家高技术研究发展计划（８６３计划）（２０１１ＡＡ１００９０５）；教育部新世纪优秀人才支持计划（ＮＣＥＴ－１１－０６６５）
作者简介：刘丹丹（１９８７—），女，山东烟台人，硕士研究生，研究方向：工业微生物学与酶工程；张 　 梁 （联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｚｈａｎｇｌ＠
ｊｉａｎｇｎａｎ􀆰 ｅｄｕ􀆰 ｃｎ
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ磷脂酶 Ａ２基因在
大肠杆菌中的重组表达
刘丹丹，张　 梁，顾正华，丁重阳，石贵阳
（江南大学 工业生物技术教育部重点实验室 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，无锡 ２１４１２２）
摘　 要：以 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ染色体基因组为模板，ＰＣＲ扩增获得磷脂酶 Ａ２基因 ｐｌａ２，以 ｐＥＴ ２８ａ（＋）为载体构建
重组表达质粒 ｐＥＴ ２８ａ（＋） ｐｌａ２。 通过 ＩＰＴＧ诱导实现磷脂酶 Ａ２在 Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＥ３中的重组表达。 对诱导条件初步
优化后，重组菌酶活最大可达 ２􀆰 ８ Ｕ ／ ｍＬ。 通过 Ｎｉ 螯合柱对目的蛋白进行纯化，ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析重组磷脂酶 Ａ２相
对分子质量为 １􀆰 ７×１０４。 通过酶学性质分析，最适温度为 ３７ ℃，最适 ｐＨ ８，比酶活为 １１０ Ｕ ／ ｍｇ。
关键词：大肠杆菌；干酪乳杆菌；磷脂酶 Ａ２；重组表达
中图分类号：Ｑ７８９　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１４）０４－００３２－０５
Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ
Ａ２ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＬＩＵ Ｄａｎｄａｎ，ＺＨＡＮＧ Ｌｉａｎｇ，ＧＵ Ｚｈｅｎｇｈｕａ，ＤＩＮＧ Ｚｈｏｎｇｙａｎｇ，ＳＨＩ Ｇｕｉｙａｎｇ
（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｃｅｒｅａｌ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ， Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｘｉ ２１４１２２， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ＰＬＡ２ ｇｅｎｅ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ｂｙ ＰＣＲ． Ｕｓｉｎｇ ｐＥＴ⁃２８ａ（＋） ａｓ
ｖｅｃｔｏｒ， ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＥＴ⁃ｐｌａ２ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ． Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２ ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＥ３． Ａｆｔｅｒ ｏｐｔｉｍａｚａｔｉｏｎ， ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＰＬＡ２ ｒｅａｃｈｅｄ ２􀆰 ８ Ｕ ／ ｍＬ． Ｔｈｅｎ， ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ
ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ Ｎｉ⁃ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎ， ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２ ｗａｓ １􀆰 ７×１０４． Ｆｉｎａｌｌｙ， ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ａｔ ３７ ℃ ａｎｄ ｐＨ ８ ｗａｓ １１０ Ｕ／ ｍｇ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ；ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２；ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
　 　 磷脂酶 Ａ２（ＰＬＡ２）是一种水溶性的小分子蛋白
质，它主要作用于甘油磷脂的 ｓｎ ２ 酯酰键，生成游
离脂肪酸以及溶血磷脂。 与天然磷脂相比，该反应
生成的溶血磷脂作为食品乳化剂，在亲水性、乳化
性以及其他性能上都有显著的提高；生成的花生四
烯酸，是前列腺素和白细胞三烯等类花生酸的前
体［１－３］。 磷脂酶 Ａ２还可用于植物油脱胶，主要去除
植物油中不溶于水的脂肪酸。 １９９２ 年，德国 Ｌｕｒｇｉ
公司用来源于猪的 ＰＬＡ２进行酶法脱胶，但由于来源
少、价格高，一直没有得到大规模应用，现在正致力
于工业化开发微生物来源的 ＰＬＡ２ ［４
－５］。 将磷脂酶
Ａ２加入动物饲料中可以增加饲料中磷脂的利用率，
并能作为乳化剂促进动物吸收利用［６］。 溶血磷脂
的乳化性和胶体性质使其在化妆品行业不仅具有
很好的保湿性和渗透作用，而且在毒理学上也是天
然、安全的［７］。 另外，磷脂酶 Ａ２在治疗某些心血管
疾病及神经系统疾病中有着广泛的应用前景［８］。
ＰＬＡ２一般分为三大类：分泌型、胞浆型和非
Ｃａ２＋依赖型。 现在研究的磷脂酶 Ａ２主要来源于蛇
毒、蜂毒，动物的胰脏、体液以及植物［９］。 这些来源
的 ＰＬＡ２成本高、产量低，而微生物来源的 ＰＬＡ２具有
生产周期短、结构简单、可工业化大规模生产等优
势，所以开发微生物来源的 ＰＬＡ２ 具有重要意
义［１０－１１］。 因为天然来源的 ＰＬＡ２产量都比较低，所
以利用 ＤＮＡ重组技术来提高产量已经成为一种趋
势，现在国内外有关蛇毒 ＰＬＡ２基因重组技术研究的
较多［１２－１６］，但效果不理想，相比较微生物野生来源
和重组表达报道的较少［１７－１９］。 笔者拟通过基因重
组技术，将干酪乳杆菌 ＰＬＡ２基因在大肠杆菌中重组
表达，得到高纯度的酶，为后续实验奠定基础。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 实验材料
１􀆰 １􀆰 １　 菌株和质粒
干酪乳杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）由笔者所在实验
室人员筛选；Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９，Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＥ３、ｐＥＴ ２８ａ（＋）
由江南大学工业微生物育种中心保存；ｐＭＤ１８ Ｔ
载体购自 ＴａＫａＲａ 公司。
１􀆰 １􀆰 ２　 主要试剂
限制 性 内 切 酶 ＥｃｏＲＩ、 ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ、 ｐｒｏｔｅｉｎ
ｍａｒｋｅｒ，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ 公司；Ｔ４ＤＮＡ 连接酶、ＴａｑＤＮＡ 聚合
酶、ｄＮＴＰｓ、ＤＮＡ 片段纯化试剂盒、质粒小量提取试剂
盒、胶回收试剂盒，北京博大泰克生物技术公司；磷
脂，Ｓｉｇｍａ 公司；其他试剂均为市售分析纯试剂。
１􀆰 １􀆰 ３　 培养基
干酪乳杆菌的培养用 ＭＲＳ 培养基 （质量分
数）：蛋白胨 １％、牛肉膏 １％、酵母粉 ０􀆰 ５％、Ｋ２ＨＰＯ４
０􀆰 ２％、柠檬酸二胺 ０􀆰 ２％、乙酸钠 ０􀆰 ５％、葡萄糖
２％、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０􀆰 ０５％、ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ ０􀆰 ０２５％、吐
温 ８０ ０􀆰 １％；ｐＨ ６􀆰 ８。
ＬＢ培养基用于培养重组大肠杆菌，添加卡那霉
素使其质量浓度为 ３０ μｇ ／ ｍＬ，氨苄青霉素使其终质
量浓度为 １００ μｇ ／ ｍＬ。
１􀆰 ２　 实验方法
１􀆰 ２􀆰 １　 ＰＬＡ２基因的克隆
根据 ＮＣＢＩ 上公布的干酪乳杆菌 ＡＴＣＣ３３４ 的
ＰＬＡ２基因序列设计合成上下游引物，Ｐ１：５′ ＧＣＧＡ⁃
ＡＴＴＣＡＣＧＡＣＴＡＡＧＡＣＴＧＡＧ ３′；Ｐ２：５′ ＧＣＧＡＡＴ⁃
ＴＣＧＡＣＡＣＧＡＡＡＧＴＣＣＴＣ ３′，在引物的 ５′段添加
ＥｃｏＲＩ酶切位点。 以干酪乳杆菌染色体基因组为模
板，Ｐ１、Ｐ２为引物，ＰＣＲ扩增出 ＰＬＡ２的成熟肽基因。
扩增条件：９５ ℃ ５ ｍｉｎ，９４ ℃ ３０ ｓ，５７ ℃ ３０ ｓ，７２ ℃
１ ｍｉｎ，共 ３０ 个循环，７２ ℃ １０ ｍｉｎ。 ＰＣＲ 产物纯化
后插入 ｐＥＴ１８ Ｔ 载体并转化 Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ 感受态
细胞，筛选阳性克隆送上海生工生物工程公司测序。
１􀆰 ２􀆰 ２　 重组表达质粒 ｐＥＴ ｐｌａ２的构建
阳性克隆质粒 ｐＭＤ ｐｌａ２ ＥｃｏＲＩ单酶切纯化回
收，再与同样经 ＥｃｏＲＩ单酶切的 ｐＥＴ ２８ａ（ ＋）载体
在 １６ ℃过夜连接，转化 Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＥ３ 感受态细胞，用
Ｋａｎ 抗性平板筛选转化子，ＥｃｏＲＩ 酶切验证重组质
粒。 硼砂卵黄平板验证酶活，正确的重组质粒命名
为 ｐＥＴ ２８ａ（＋） ｐｌａ２。
１􀆰 ２􀆰 ３　 ＰＬＡ２的酶活测定
硼砂卵黄平板：取 ２００ μＬ细胞破碎上清加入硼
砂卵黄平板上的牛津杯中，３７ ℃温育 １２ ～ ２４ ｈ，通
过观察水解圈来验证蛋白有没有正确表达，并初步
确定酶活的大小。
酸碱滴定法：称取一定量的卵磷脂，用 ５０
ｍｍｏｌ ／ Ｌ ｐＨ ８􀆰 ０ 的 Ｔｒｉｓ⁃ＨＣｌ 溶解，再加入 １０ ｇ ／ Ｌ 的
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００制成反应底物，４ ℃冰箱避光保存备
用。 准备 ４ 个烧杯，分别加入 ９ ｍＬ 的底物，２０ μＬ
５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ的 ＣａＣｌ２溶液，一只烧杯加入 １５ ｍＬ的乙
醇作为对照，最后加入 １ ｍＬ 粗酶液，４０ ℃反应 １５
ｍｉｎ，用一定浓度的 ＮａＯＨ 滴定，通过计算消耗
ＮａＯＨ的量来得到 ＰＬＡ２的酶活。 １ ｍｉｎ 水解磷脂生
成 １ μｍｏＬ脂肪酸所需的 ＰＬＡ２的量定义为 １ Ｕ。
１􀆰 ２􀆰 ４　 磷脂酶 Ａ２的诱导表达和条件优化
重组菌接种 Ｋａｎ抗性 ＬＢ 培养基，３７ ℃振荡培
养过夜，次日以 ２％的接种量接种 ５０ ｍＬ 装液量的
２５０ ｍＬ 三角瓶，经条件优化确定诱导剂加入时机、
诱导温度、诱导剂浓度以及诱导时间。
１􀆰 ２􀆰 ５　 ＰＬＡ２重组蛋白的纯化
以 ２５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｔｒｉｓ⁃ＨＣｌ 为缓冲液，将离心后的
超声波破碎上清液上 Ｎｉ 鳌合柱 （ Ｎｉ⁃ｃｈｅｌａｔｉｎｇ
ｃｏｌｕｍｎ），用 ２０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 咪唑、０􀆰 ５ ｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＣｌ 和 ２５
ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｔｒｉｓ⁃ＨＣｌ （ｐＨ ８􀆰 ０）进行平衡，用 ５００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
咪唑、０􀆰 ５ ｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＣｌ 和 ２０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｔｒｉｓ⁃ＨＣｌ （ ｐＨ
８􀆰 ０）进行洗脱。 Ｂｒａｄｆｏｒｄ 法测定蛋白浓度。 ＳＤＳ
ＰＡＧＥ测定蛋白纯度。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 ＰＬＡ２成熟肽基因的克隆
以干酪乳杆菌染色体基因组为模板 ＰＣＲ 扩增
得到 １条 ５１０ ｂｐ的 ＤＮＡ 片段（图 １），与 ＰＬＡ２基因
３３　 第 ４期 刘丹丹等：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ磷脂酶 Ａ２基因在大肠杆菌中的重组表达
大小相符。 对克隆载体 ｐＭＤ－ｐｌａ２ ＥｃｏＲＩ 单酶切验
证，得到与预期大小相符的 ５１０ ｂｐ 条带，送上海生
工生物工程公司测序，测序结果与 ＮＣＢＩ 公布的
ＰＬＡ２基因序列比对相似度为 ９９􀆰 ４％。
Ｍ—ＤＬ２０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；１—ＰＣＲ产物；２—ｐＭＤ－ｐｌａ２ ／ ＥｃｏＲＩ
图 １　 ＰＣＲ产物和 ｐＭＤ ｐｌａ２重组质粒酶切产物的验证
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ａｎｄ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｏｆ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＭＤ⁃ｐｌａ２
２􀆰 ２　 重组质粒 ｐＥＴ ２８ａ（＋） ｐｌａ２ 的构建及重组
菌的酶活验证
　 　 表达质粒 ｐＥＴ ２８ａ（＋） ｐｌａ２ ＥｃｏＲＩ 单酶切验
证如图 ２ 所示，获得 ５ ３６９ ｂｐ 和 ５１０ ｂｐ 两条带，与
预期相符。 表明 ｐＥＴ ２８ａ（＋） ｐｌａ２ 表达质粒构建
成功，同时在硼砂卵黄平板上检测到透明圈，说明
目的基因得到正确表达。
Ｍ—λＤＮＡ ／ ＰｓｔＩ ｍａｒｋｅｒ；１—ｐＥＴ－２８ａ（＋） ｐｌａ２ ／ ＥｃｏＲＩ
图 ２　 重组质粒 ｐＥＴ ２８ａ（＋） ｐｌａ２的酶切验证
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ
ｐＥＴ⁃２８ａ（＋） ⁃ｐｌａ２
２􀆰 ３　 重组菌的发酵条件优化
２􀆰 ３􀆰 １　 诱导剂加入时间对酶活力的影响
诱导剂的加入时间对蛋白表达有着很大的影
响。 诱导剂加入过早，菌体浓度太少，蛋白表达量
少；诱导剂加入过晚，菌体老化，机能下降，不利于
蛋白表达。 所以笔者分别在菌体转接后 １、１􀆰 ５、２、
２􀆰 ５、３、４、５和 ６ ｈ加入终浓度为 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ的 ＩＰＴＧ，
３７ ℃诱导 ６ ｈ，结果如图 ３所示。 由图 ３可知：ＩＰＴＧ
在菌体生长 ２ ｈ后，即 ＯＤ为 １􀆰 ０８６时酶活最高。
图 ３　 ＩＰＴＧ加入的时间对酶活的影响
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ
２􀆰 ３􀆰 ２　 诱导温度对酶活力的影响
温度对菌体生长和细胞内新陈代谢有重要的
影响。 笔者将重组菌 ３７ ℃转接培养 ２ ｈ 后，加入终
浓度 １ ｍｍｏＬ ／ Ｌ的 ＩＰＴＧ，分别在 ２０、２５、３０ 和 ３７ ℃
诱导 ６ ｈ，超声波破碎后测酶活，结果如图 ４ 所示。
由图 ４可知，２５ ℃诱导酶活最高。 温度较高时菌体
生长较好，大肠杆菌机体快速运转，使蛋白大量表
达，造成表达量过高而形成包涵体，从而使可溶性
蛋白的量减少，使其测定的酶活较低。 温度过低时
不利于菌体的生长，蛋白表达总量降低，酶活相应
降低。 由于本实验主要研究可溶性蛋白的表达情
况，所以诱导温度选择为 ２５ ℃。
图 ４　 诱导温度对酶活的影响
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ
２􀆰 ３􀆰 ３　 诱导剂浓度对酶活力影响
重组菌转接后，３７ ℃培养 ２ ｈ，分别加入终浓度
为 ０􀆰 １、 ０􀆰 ２、 ０􀆰 ４、 ０􀆰 ６、 ０􀆰 ８、 １􀆰 ０ 和 １􀆰 ２ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 的
ＩＰＴＧ，２５ ℃诱导 ６ ｈ 后测酶活，结果如图 ５ 所示。
４３ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
从图 ５可以得出：ＩＰＴＧ 浓度对重组菌酶活影响不
大，考虑到 ＩＰＴＧ具有一定的毒性以及价格较高，所
以最终选择 ０􀆰 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ的 ＩＰＴＧ终浓度。
图 ５　 ＩＰＴＧ浓度对酶活的影响
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＩＰＴＧ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ
２􀆰 ３􀆰 ４　 诱导时间对酶活力影响
重组菌转接后，３７ ℃培养 ２ ｈ，加入 ０􀆰 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
的 ＩＰＴＧ诱导 ２、３、４、５、６ 和 ８ ｈ，最后得到重组菌诱
导 ４ ｈ后酶活达到最大（图 ６）。
图 ６　 诱导时间对酶活的影响
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ
２􀆰 ４　 ＰＬＡ２蛋白的表达及纯化
将重组菌 ３７ ℃转接培养 ２ ｈ 后，加入终浓度为
０􀆰 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ的 ＩＰＴＧ，２５ ℃诱导培养４ ｈ后，４ ℃离心收
集菌体，超声波破碎取上清，测得粗酶活为 ２􀆰 ８ Ｕ／ ｍＬ。
按照 １􀆰 ２􀆰 ５ 所述方法，经 Ｎｉ 螯合柱纯化后的
产物 ＳＤＳ ＰＡＧＥ验证得到 １ 条 １􀆰 ７×１０４左右的条
带（图 ７），与目的蛋白大小相符，其纯度达到 ９５％以
上。 并测得纯化后的 ＰＬＡ２比活力为 １１０ Ｕ ／ ｍｇ。
微生物来源的 ＰＬＡ２基因国内外研究得都比较
少。 ２００６年卢冬梅等［１７］对 Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ Ｋ１的磷
脂酶 Ａ２基因在大肠中进行了表达，蛋白纯化后以对
硝基苯酚丙酸酯为底物测得的酶活为 １１５ Ｕ ／ ｍｇ。 李
维林［１８］利用红色链霉菌 ＰＬＡ２基因构建重组菌，酶活
为 ２ ０００ Ｕ ／ ｍＬ（１５ ｍｉｎ 消耗 ２􀆰 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＯＨ １ μＬ
为 １ Ｕ），以本实验定义酶活单位计算酶活为 ０􀆰 ３３
Ｕ ／ ｍＬ左右，其酶活相对较低。 Ｔａｋｅｍｏｒｉ等［１９］ 对
１—ｐＥＴ ２８ａ（＋） ｐｌａ２ ／ ＤＥ３上清液；
２—纯化后 ＰＬＡ２；Ｍ—标准蛋白
图 ７　 磷脂酶 Ａ２的 ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析
Ｆｉｇ􀆰 ７　 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ ＰＬＡ２基因在大肠杆菌中进
行了表达，比酶活为 ８７ Ｕ ／ ｍｇ。 笔者所构建的重组菌
经初步优化后，以大豆磷脂为底物得到破碎上清最高
比酶活为 ２􀆰 ８ Ｕ ／ ｍＬ，后期经 Ｎｉ 螯合柱纯化的到纯
度较高的 ＰＬＡ２，酶活为 １１０ Ｕ ／ ｍｇ。
２􀆰 ５　 纯化 ＰＬＡ２最适温度及温度稳定性
考察纯化后的 ＰＬＡ２的最适反应温度和热稳定
性，结果见图 ８ 和图 ９。 由图 ８ 可知，以 ３７ ℃测得
的酶活为 １００％。 由图 ９可知：３０、３７和 ５０ ℃保温 ２
ｈ，ＰＬＡ２的酶活基本不变。 ６５ ℃保温 １ ｈ，酶活不变，
２ ｈ后酶活还剩 ４０％左右。 以上说明本实验研究的
ＰＬＡ２的热稳定性较好，这一特性与目前研究的磷脂
酶 Ａ２的性质基本相同。
图 ８　 温度对酶活力的影响
Ｆｉｇ􀆰 ８　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ
２􀆰 ６　 ＰＬＡ２的最适 ｐＨ
在 ３７ ℃ 条件下反应，测得不同 ｐＨ 环境中
ＰＬＡ２的酶活大小，结果如图 １０ 所示。 由图 １０ 可
知：在 ｐＨ ８时酶活达到最大，所以该酶属于碱性蛋
５３　 第 ４期 刘丹丹等：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ磷脂酶 Ａ２基因在大肠杆菌中的重组表达
图 ９　 ＰＬＡ２的温度稳定性
Ｆｉｇ􀆰 ９　 Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＰＬＡ２
白酶，但是其在 ｐＨ ６左右的弱酸环境中依然保有较
高的酶活，其 ｐＨ范围较广，拓宽了其在实际中的应
用范围。 碱性 ＰＬＡ２的普遍 ｐＨ 范围在 ７ ～ ９，所以该
ＰＬＡ２与其相符。
图 １０　 ｐＨ对酶活力的影响
Ｆｉｇ􀆰 １０　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐＨ ｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ
３　 结　 论
笔者所构建的重组菌经初步优化后，以大豆磷
脂为底物得到破碎上清最高酶活为 ２􀆰 ８ Ｕ ／ ｍＬ。 后
期经 Ｎｉ 螯合柱纯化的到纯度较高的 ＰＬＡ２，比酶活
为 １１０ Ｕ ／ ｍｇ，比国外水平略有提高。 测得重组
ＰＬＡ２的最适温度为 ３７ ℃；热稳定性较好，３０、３７ 和
５０ ℃保温 ２ ｈ，ＰＬＡ２的酶活基本不变，且 ６５ ℃保温
１ ｈ，酶活不变，２ ｈ 后酶活还剩 ４０％左右；最适 ｐＨ
为 ８，ｐＨ范围较广，在弱酸性环境中依然有酶活，与
已报道大部分 ＰＬＡ２性质基本相同。
参考文献：
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（责任编辑　 管　 珺）
６３ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷