全 文 ：May2008
·44·
生物加工过程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
第6卷第3期
2008年5月
海巴戟果水溶性多糖的分离纯化及
清除自由基活性
刘海青，刘银才，胡文婷
(海南大学 海洋学院，海12570228)
摘要：采用热水提取乙醇沉淀获得海巴戟水溶性粗多糖，经DEAE—SephadexA-50分离纯化得海巴戟果水溶性多
糖(MOCI)。经纸层析、醋酸纤维薄膜电泳和SepharoseCI-4B柱层析纯度鉴定表明，MOCI为相对分子质量均一的纯
多糖。抗衰老活性研究结果表明，MOCI能有效清除·OH和O：。·自由基。
关键词：海巴戟；多糖；分离纯化；清除；自由基
中图分类号：Q949．761．2 文献标识码：A 文章编号：1672—3678(2008)03—0044一04
Isolationwatersolublepolysaccharidefrom
Morindacirtifoliaandits cavengingfreeradicalactvity
LIUHai—qing，LIUYin-cai，HUWen-ting
(CollegeofOceanography，HainanUniversity，Haikou570228，China)
Abstract：ThecrudpolysaccharideextractedfromthefmitsofMorindacitrifoliawithotwaterwas
deproteinizedbythecombinationofenzymaticndSevagmethods．ThepolysaceharideMOClwasob·
rainedbyDEAE-SephadexA-50．ThepurityidentificationbygelchromatographyshowedthatMOClwas
alluniformpolysaccharide．FreeradicalscavengingexperimentshowedthatMOClwaseffectiveinscaven-
gingsuperoxideradicalandhydroxylradical．
Keywords：Morindacit folia；polysaccharide；isolation；scavenging；freeradical
海巴戟(MonndaCirtifoliaL)为茜草科巴戟天
属植物，热带常绿多年生阔叶灌木。发源于太平洋
南部岛屿，当地居民称之为NONI。其果实、叶子、枝
干、根部均可人药¨J。其果为白色叶茎果，药名海
巴戟，富含多种微量元素，在南太平洋一带素有“仙
果”之美称¨1o
人类的衰老及许多疾病的发生都与自由基有
着密切的联系，清除自由基作用的研究具有重要的
意义。多糖具有抗衰老作用，如极大螺旋藻多糖具
有很强的清除羟自由基作用”J，海带褐藻多糖硫酸
酯具有清除超氧自由基的作用¨】，药理实验证明，
从巴戟天水溶性部分中分离出的巴戟天多糖有明
显的免疫增强作用，王卫平等b“1对其进行了分离
纯化研究。另有研究报道海巴戟果中有一种抗肿
瘤活性黏多糖【．71，但关于该多糖的分离纯化结构测
定及对氧自由基的清除活性研究报道较少。本文
从海巴戟果中提取出海巴戟粗多糖，分离纯化得到
了纯化多糖(MOCI)，并研究其对氧自由基的清除
活性。
收稿日期：2007-06-06
基金项目：海南大学自然科学基金资助项目(Kyjj0622)
作者简介：刘海青(1971一)，女，山西大同人，讲师，硕士，研究方向：天然产物化学。E-mail：liuhaiqin9223417@163．com
万方数据
2008年5月 刘海青等：海巴戟果水溶性多糖的分离纯化及清除自由基活性 ·45·
1材料与方法
1．1试验材料
海巴戟(海南万宁产，粉碎干燥备用)DEAE-
SephadexA-50(Pharmacia公司进口)、722型分光光
度计、DYY一12型电泳仪、Fc—A4型馏分部分自动收
集器、FD-IB型冻干机。
1．2试验方法
1．2．1海巴戟水溶性多糖的提取及分离纯化
将干燥的海巴戟果粉碎，经乙醚回流脱脂后，
热水浸提3次，每次3h，抽滤，合并滤液，减压浓缩，
加入5倍体积的95％乙醇沉淀，低温静置过夜，离
心。沉淀加蒸馏水溶解，再次重复乙醇沉淀的步骤
2次，最后1次得到的沉淀用少量水配成2％的溶
液，链酶蛋白酶与Sevag法联合脱蛋白3次，浓缩，
冷冻干燥，得海巴戟果粗多糖MOC。
1．2．2海巴戟果多糖的柱层析纯化
将脱蛋白后的多糖进一步用DEAE．Sephadex
A-50(1．6cmx50era)凝胶层析纯化，以0．1moL／L
的磷酸盐缓冲液为流动相，流速0．5mL／miff，
2mL／管分部收集，采用苯酚一硫酸法显色。以管数
为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制多糖洗脱曲线。
将曲线出现单一尖峰峰位附近的5管多糖溶液合
并，减压浓缩，蒸馏水透析48h，以5倍体积95％乙
醇沉淀，离心，冷冻干燥。
1．2．3纯度鉴定
纸层析用新华1号中速滤纸(15cm×40cm)
进行层析，用y(正醇)：V(浓氨水)：V(水)=60：40：
5的混合液作为展开剂，展开7h，用体积分数0．5％
甲苯胺蓝乙醇溶液染色，体积分数95％乙醇漂洗脱
色至背景无色。
醋酸纤维薄膜电泳采用pH8．5的0．050mol／L
硼酸盐为电极缓冲液，电压250V，电泳时间30
min。用体积分数0．5％甲苯胺蓝乙醇溶液染色。
SepharoseCl-4B(1．5cm×90cm)柱层析取5mg
多糖配成10g／L溶液，取其0．5mL上样，0．1mol／L
NaCl溶液洗脱，流速0．45mL／min，每管2mL收集，
苯酚．硫酸法测定多糖分布，绘制层析图谱，观察
结果。
1．2．4海巴戟果水溶性多糖清除自由基活性的测定
1．2．4．1多糖清除·OH的测定¨1
参考Fenton反应体系模式，利用H：O：与Fe2+
混合产生·OH，但由于·OH具有很高的反应活性，
存活时间短，若在体系中加入水杨酸，就能有效地
捕捉·OH，并产生有色产物。该产物在510am处有
强吸收，若在反应体系加入具有清除·OH功能的被
测物，便会与水杨酸竞争·OH，而使有色产物生成量
减少。采用固定反应时间法，在相同体积的反应体
系(8．8mol／LH202，9mmol／LFe“各0．5mL，9
mmol／L水杨酸一乙醇溶液O．5mE)加入一系列不同
质量浓度的多糖溶液，并以蒸馏水为参比，与试剂
空白液比较，在510am处测量各浓度下的吸光度
(4)，便能测定被测物对·OH的清除作用。按下式计
算清除率E，A空白、A样品分别为试剂空白液和多糖样
品液的吸光度。
■ -
E：竺年兰盟×100％ (1)
A空白
1．2．4．2多糖清除02一·的测定一1
配制pH8．2Tris-HCl缓冲液。
邻苯三酚自氧化产物吸收曲线：邻苯三酚在酸
性环境中相当稳定，而在碱性条件下能迅速自氧
化。实验对0．1mmol／L邻苯三酚在pH8．2、0．05
mmol／LTris-HCl缓冲液中的自氧化产物进行扫描
(扫描范围280～600nm)，从吸收曲线图上即可选
定测试波长。
测试波长为322nm，反应总体积为9mL。取
pH8．2、0．05mol／LTris—HCl缓冲液4．5mL，适量去
离子水混匀后置25℃水浴保温10min，再加入不同
质量浓度的海巴戟水溶性多糖，最后加入3mmol／L
邻苯三酚溶液0．3mL至终浓度0．1mmol／L，混匀
后在25℃保温4min，立即用8mol／LHCI溶液终止
其反应，并在322rim处测定A。空白组以去离子水
代供试品，并按(1)式计算清除率E。
2结果与分析
2．1海巴戟果多糖的柱层析纯化
将脱蛋白后的多糖得到的组分MOC进一步用
DEAE—SephadexA-50(1．6cm×50cm)凝胶层析纯
化得到MOCI。
2．2纯度鉴定
MOCI经SepharoseCI-4B(1．5cm×90cm)柱层
析，苯酚．硫酸法检测得一单一对称峰，见图1。醋
酸纤维薄膜电泳呈单一谱带，见图2。纸层析呈单
一斑点，说明是相对分子质量均一的纯多糖。
万方数据
·46· 生物加工过程 第6卷第3期
魁
呆
螫
图1 MOCI的ScpharoseCl-4B柱层析谱图
Fig．1ChromatogramofSJ210nScpharoseCL-4B
图2 MOCI的醋酸纤维薄膜电泳谱带
Fig．2CellulousacetateelectrophoresisofMOCI
2．3 海巴戟果多糖的清除自由基活性的研究
自由基产生于机体内的许多氧化还原过程，他
们由特定的酶(超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱
甘肽过氧化物酶等)捕获或破坏。正常情况下，机
体自由基的产生和清除处于一种动态平衡中，如果
这个平衡被打破，机体内就会产生过量的氧自由基
而对机体造成伤害，如引起脂质过氧化而改变生物
膜结构及功能，损伤DNA，使蛋白质变性及酶活力
丧失等，这些危害直接或间接地导致了炎症、衰老、
心血管疾病及肿瘤的发生【4J。Of·和·OH是最
具代表性的活性氧自由基，在机体的氧化反应中，
Of·通常最先形成，可通过形成其他多种有破坏作
用的自由基而使其功能放大。·OH几乎能与所有
的功能性生物大分子起反应，造成生物体的巨大伤
害¨0|。本实验模拟产生·OH、Of·的2个体系，
质量浓度远大于体内该2种自由基质量浓度[9】，在
产生·OH、Of·的2个体系中加入质量浓度不同
的MOCI，实验结果见表1和表2。
表1海巴戟果多糖MOCI对·OH的清除效果
Table1 ScavengingeffectofMOCIinhydroxylradicM
从表1可看出，MOCI在20I山g／mL～1g／L范围
内，对·OH有清除作用，而且随着多糖质量浓度增
加，清除率由2．5％上升至80．2％。说明海巴戟果
多糖对·OH有较好的清除作用。
’
表2海巴戟果多糖MOCI对02。·的清除效果
Table1 ScavengingeffectofMOCIinsuperoxideradical
从表2可看出，MOCI在20Izg／mL一1g／L范围
内，对O：一·有清除作用，而且随着多糖质量浓度增
加，清除率上升，由2．1％上升至81．5％。说明海巴
戟果多糖对O：一·也有较好的清除作用。
3作用机理探讨‘11。14】
抗氧化作用指能够使自由基的氧化作用减缓
或停止，自由基氧化的各种过程如下：1)自由基的
清除和阻止增殖；2)酶水解脂质中酯键以除去过氧
化脂肪酸；3)过渡金属离子的阻断；4)酶催化过氧
化物的还原。常见的抗氧化剂醛、VC、VE、胡萝卜
素及黄酮类化合物易被O：一·氧化。海巴戟多糖具有
清除·OH、O：一·的活性，说明海巴戟多糖中的半缩
醛还原基团、伯仲羟基等与氧自由基有明显的化学
作用。
万方数据
2008年5月 刘海青等：海巴戟果水溶性多糖的分离纯化及清除自由基活性 ·47·
4结论
对海巴戟水溶性粗多糖经DEAE—SephadexA一
50分离纯化得MOCI，运用产生Of·和·OH的2个反
应体系，对MOCI进行体外清除自由基研究，结果发
现海巴戟水溶性多糖MOCI有很强的清除超氧自由
基和羟自由基的作用，具有一定的抗衰老活性，但
具体的构效关系及作用机理还有待于进一步的研
究。氧自由基与机体衰老有很密切的关系，推测海
巴戟水溶性多糖MOCI可作为抗衰老保健或药物在
临床上使用，尽管人们无法模拟生物体内各种生物
酶和活性氧自由基的质量浓度大小及真实的反应
机理，选择不同抗氧化剂清除氧自由基、保护细胞
和组织免受损伤或减轻其受损程度，无疑是抗衰老
药理学、生物医学领域充满希望的一个研究课题。
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昆明欲成为我国可降解塑料袋生产基地
昆明理工大学教师陈敏元通过信件向市委、市政府建议：在全面“禁塑”的过渡期，推广可完全生物降解
的PBS塑料袋替代现有的塑料袋，一方面可以消除“禁塑”给市民带来的不便，另一方面还可以把昆明变成
PBS塑料袋的生产基地，给昆明带来商机。
陈敏元建议，全面推广和使用可完全生物降解的PBS塑料袋，让“禁塑”和方便市民能够两全其美。PBS
塑料袋是一种新型的塑料产品，这种塑料袋埋进土壤后，经过3个月就能够完全生物降解。生产PBS塑料
袋，只要技术到位，塑料袋制造企业现有的设备和工作流程就能满足PBS塑料袋的生产。虽然PBS塑料袋
的生产成本比现有塑料袋的生产成本高出20％，但PBS塑料袋带来的利润也是可观的。
(张春鹏)
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