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Asymmetric reduction of benzoylformic acid into (R

葡萄酒酵母不对称还原苯甲酰甲酸合成(R



全 文 :第7卷第5期
2009年9月
生 物 加 工 过 程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
Vol.7No.5
Sep.2009
doi:10.3969/j.issn.1762-3678.2009.05.007
收稿日期:2009-01-05
基金项目:江苏省高技术(工业)资助项目(BG2007008);教育部长江学者创新团队资助项目(IRT0532)
作者简介:王 翔(1982—),男,安徽芜湖人,硕士研究生,研究方向:生物催化;徐 岩(联系人),教授,Email:yxu@jiangnan.edu.cn
葡萄酒酵母不对称还原苯甲酰甲酸合成(R)扁桃酸
王 翔,穆晓清,徐 岩,郭金玲
(江南大学 生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室,无锡 214122)
摘 要:研究了葡萄酒酵母不对称还原制备(R)扁桃酸的转化,并将其放大至反应罐进行小试研究。通过转化条件的优
化,在密闭条件下,当底物质量浓度为10g/L时,苯甲酰甲酸的产率达到72%,扁桃酸的对应过量值(e.e.)值达到99%以
上。实验发现,该微生物具有很好的催化稳定性,全细胞经过10批次反应,产率无明显降低,产物对映体过量值均高于
98%。转化反应放大至7L反应罐体系后,S.elipsoideus仍然具有良好的催化性能,产率提高到81%,e.e.值保持在99%。
关键词:不对称还原;苯甲酰甲酸;(R)扁桃酸;葡萄酒酵母
中图分类号:TQ031.6    文献标志码:A    文章编号:1672-3678(2009)05-0034-05
Asymmetricreductionofbenzoylformicacidinto(R)mendelicacidby
wholecelSaccharomyceselipsoideuscatalysis
WANGXiang,MUXiaoqing,XUYan,GUOJinling
(KeyLaboratoryofIndustrialBiotechnologyoftheMinistryofEducation,
SchoolofBiotechnology,JiangnanUniversity,Wuxi214122,China)
Abstract:(R)mandelicacidwasproducedbyasymmetricreductionofbenzoylformicacidcatalyzedby
Saccharomyceselipsoideusscreenedinthelaboratory.Efectsofvariousfactorsontheprocessoftransfor
mationof(R)mandelicacidwereinvestigated.Resultsshowedthattheyieldandee.valuereached
72% and99% undertheoptimizedconditionswhenonelitrereactionbothcontains120gcelsand10g
benzoylfomic,andthepHvalueof65,thetemperatureof35℃.S.elipsoideushasexcelentstabilityin
catalyticactivitybecausetheproduct(R)mandelicacidwastransformatedwiththeyieldof70% and
ee.valueover98% after10continuousbatches.Thepolitescaleexperimentona7g/Lbioreactor
showedthattheyieldandee.valuewereimprovedto81% and99% after48hwhenthesubstratecon
centrationwas10g/L.
Keywords:asymmetricreduction;benzoylformicacid;(R)mandelicacid;Saccharomyceselipsoideus
  (R)扁桃酸是一种重要的手性药物中间体,广
泛用于多种光学活性药物的合成[1-3],市场需求量
较大。(R)扁桃酸的制备方法有很多,其中生物转
化法是其合成的一个重要手段。该法具有高效、条
件温和、成本低、环境污染少、产物的对映体过量值
高等优点。
  国内外学者一直从事着利用不对称还原法生
产(R)扁桃酸的研究[4-5],但是存在催化稳定性稳
定不高的问题。采取固定化的方法来提高细胞不
对称还原生产(R)扁桃酸催化批次稳定性[6-7],较
高的催化批次为6次,但是在提高批次稳定性的同
时又会降低酶催化活性,减慢传质速度,增加成
本[8]。目前,不对称还原法生产(R)扁桃酸大都应
用于实验室的摇瓶规模,没有投入到工业化大生产
中。关于小试发酵罐转化规模的研究报道也较少,
如果用发酵罐来研究转化反应,反应的温度、pH、溶
氧等条件比摇瓶实验更便于监控。因此,研究发酵
罐体系的放大转化实验,不仅可考察转化反应的可
放大性,更能够控制转化条件,提高转化效率。
  笔者从实验室保藏菌株中筛选1株催化稳定性
很高的酿酒酵母(S.elipsoideusGIM2105),对其转
化苯甲酰甲酸合成(R)扁桃酸的反应条件进行研
究,并在此基础上进行7L反应罐规模的实验研究。
1 材料与方法
11 实验材料
111 菌种及试剂
  菌种葡萄酒酵母(S.elipsoideusGIM2105)为
本实验室保藏;苯甲酰甲酸(纯度 >99%)购自安徽
广德科苑化工有限公司;(R)和(S)扁桃酸及苯
甲酰甲酸标样购自 Sigma公司;其余化学试剂均为
市售色谱纯或分析纯。
112 菌体培养基
  葡萄糖40g/L,酵母膏3g/L,无机盐溶液体积
分数10%,pH70。
  无机盐溶液成分(g/L):(NH4)2HPO4130,
KH2PO470,MgSO4·7H2O8,NaCl1,ZnSO4·7H2O
06,FeSO4·7H2O09,CuSO4·5H2O005,MnSO4·
4H2O01。
12 实验方法
121 菌种培养方法
  从菌种斜面接种一环至培养基装液量为20%
的250mL摇瓶中,30℃、150r/min振荡培养48h。
培养结束后,将菌体离心并用生理盐水洗涤2次,收
集细胞用于转化反应。
122 转化方法
  在 20mL含 10g/L底物苯甲酰甲酸的 02
mol/LK3PO4缓冲液(pH65)中加入120g/L菌体
细胞,35℃、250r/min转化48h,离心去除菌体,收
集上清,用3mol/L盐酸调节 pH至10,再加入25
倍体积的乙酸乙酯萃取,低温真空干燥,将残余固
体用正己烷和异丙醇的混合液(体积比为9∶1)溶
解,高效液相检测。
123 7L反应罐规模还原反应
  在2L的K3PO4缓冲液(02mol/LpH65)中,
加入120g/L的菌体及20g的苯甲酰甲酸、20g的
葡萄糖,转入7L的反应器中于35℃、250r/min密
闭条件下反应48h。
124 产物分析方法
  产物和底物通过手性固定相高效液相色谱(戴
安p680)进行分析,条件为手性柱 ChiralcelOD H
(250mm×46mm);流动相 V(正己烷)∶V(异丙
醇)∶V(三氟乙酸)=90∶10∶01;流速05mL/min;
柱温18℃;柱压常压;紫外检测器检测波长 225
nm;进样量5μL。
  底物转化率 =已转化底物质量浓度/初始底物
质量浓度×100%
  产物得率=总扁桃酸质量浓度/初始底物质量
浓度×100%
  (R)扁桃酸的对映过量值(e.e.)=[(SR-
SS)/(SR+SS)]×100%
式中:SS、SR分别为反应后(S)和(R)对映体的峰面积。
2 结果与讨论
21 温度对微生物不对称还原反应的影响
  温度对微生物酶系的活性影响较大,从而影响最
终的转化效果。在合适的温度下,酶系能表现出最大
的活力。同时温度也会影响酶的对映体选择性。
图1 反应温度对催化苯甲酰甲酸还原反应的影响
Fig.1 Efectsofreactiontemperatureonthe
bioreductionofbenzoylformicacid
  图1为不同温度下 S.elipsoideusGIM2105全
细胞催化苯甲酰甲酸的结果。由图1可知:在35℃
时,转化率和产率均达到最高。温度的升高可能导
致酶的失活变性,影响转化效果。当反应温度从
35℃升高时,转化率和产率都开始下降,产物的光
学纯度也在下降。
53 第5期    王 翔等:葡萄酒酵母不对称还原苯甲酰甲酸合成(R)扁桃酸
22 pH对微生物还原反应的影响
  在不同初始 pH的反应液中考察 pH对不对称
还原反应的影响,结果见图2。由图2可知:在 pH
55~7之间,转化率呈上升的趋势,pH大于 70
时,转化率迅速下降。在 pH55~65之间,随着
pH的增大,产率上升,在 pH70时,虽然底物转化
率达到最大,但是产率反而下降。在整个反应体系
中,底物在被羰基还原酶还原的同时被脱羧酶催化
脱羧为苯甲醛,经苯甲醛脱氢酶氧化为苯甲酸[9],
其代谢过程见图3。在pH7的时,苯甲酰甲酸脱羧
酶表现出较高的活性,此时底物被脱羧从而再生成
副产物苯甲酸也较多。产物的e.e.值在不同 pH下
一直保持在98%以上,较为稳定。
图2 反应初始pH对催化苯甲酰甲酸还原反应的影响
Fig.2 EfectofinitialpHonbioreductionof
benzoylformicacid
图3 苯甲酰甲酸代谢途径
Fig.3 Benzoylformicacidpathway
23 溶氧条件对微生物还原反应的影响
  在微生物发酵过程中,溶解氧(DO)对于整个
发酵过程有着重要的作用,DO不仅对细胞生长和
产物形成有一定作用,还对营养物质的代谢途径也
存在一定影响。
  为了考察溶氧的影响,在相同的条件下,进行2
组平行转化实验,1组开口转化,1组密闭转化,考察
氧条件对还原反应的影响(表1)。由表1可知:溶
氧条件对于整个苯甲酰甲酸还原反应是关键因素,
相同的反应条件下,密闭隔氧转化效率要明显高于
同期好氧转化,在密闭转化的条件下的转化率高达
935%,底物基本全部反应,而在同期好氧的反应体
系中,底物的转化率只有727%。两者的产率相比
也有较大的差别。不同溶氧条件对产物的e.e.值影
响不大,2个条件下的 e.e.值都在99%左右。苯甲
酰甲酸不对称还原生成扁桃酸,需要胞内还原型辅
酶NAD(P)H的参与,不同DO条件下,生成的胞内
辅酶的质量浓度存在一定的差异性。同时反应本
身为不对称还原反应,在厌氧条件下扁桃酸脱氢酶
的表现活力高于好氧条件。
表1 溶氧对苯甲酰甲酸还原反应的影响
Table1 Efectofoxygenconcentrationonbioreduction
ofbenzoylformicacid
转化条件 转化率/% 产率/% e.e./%
有氧条件 727 413 989
厌氧条件 935 708 991
24 底物质量浓度对苯甲酰甲酸不对称还原反应
的影响
  在酶催化的反应体系中,酶和底物是最基本的
构成因素。在相同的菌体质量浓度下,不同的底物
浓度会直接影响酶催化转化的反应速度,从而影响
其最终的转化效果(图4)。
图4 苯甲酰甲酸的初始底物质量浓度对反应的影响
Fig.4 Efectofinitialconcentrationofbenzoylformic
acidonthebioreduction
  由图4可知:底物质量浓度对转化的产物收率
影响很大,底物质量浓度5~30g/L,随着底物浓度
升高,产率大幅下降。这是因为在一定菌体质量浓
度下,胞内的酶量是一定的,在底物质量浓度增加
到一定程度,酶的活性中心基本被底物所饱和,再
增加底物质量浓度也不会增加反应的量,因而产物
收率有所降低;也有可能较高的底物质量浓度,对
63 生 物 加 工 过 程   第7卷 
细胞活性产生了抑制,导致细胞还原能力下降;但
底物质量浓度的增加并没有影响产物的光学纯度,
产物(R)扁桃酸的e.e.值均大于99%。Xiao等[5]
报道的S.cerevisiae在还原苯甲酰甲酸时,底物质量
浓度从 40mmol/L提高为 963mmol/L,e.e.值从
90%降为568%,可见本研究菌株具有更好和更稳
定的立体选择性。
  在反应体系的多种环境因素进行优化后的基础
上,考察了转化时间对转化结果的影响(图5)。由图
5可知:前12h有1个明显的反应延迟期,这可能是
由于扁桃酸脱氢酶是1种胞内酶,底物进入酵母细胞
需要一定的时间,因而反应前12h产物并增加不多;
反应18h后,产物质量浓度急剧上升;反应40h时,
转化率已经达到 90%;反应 48h后,产率也达到
70%,而产物光学纯度一直维持较高(e.e.值>98%);
反应时间加长,产率变化不大,产物较为稳定。
图5 苯甲酰甲酸还原反应的过程曲线
Fig.5 Timecourseonthebioreductionof
benzoylformicacid
25 菌体批次稳定性的研究
  与化学催化剂相比,生物催化剂虽然具有高
效、专一和反应条件温和的优势,但是往往不能像
化学催化剂那样能重复使用。目前,主要采用固定
化细胞进行多批次连续反应转化目的产物。对 S.
elipsoideusGIM2105催化还原苯甲酰甲酸进行重
复使用性能考察,每1批反应结束后,离心得到菌
体,再次加入到新鲜反应液中进行转化反应,反应
10个批次的产率和 e.e.值见图6。由图6可知:反
应10批都具有较好的产率和e.e.值,产率都维持在
75%左右,e.e.值可达99%。与文献[6]结果相比,
S.elipsoideus全细胞内苯甲酰甲酸还原酶和实现辅
酶循环的酶系具有良好的稳定性,这种催化稳定性
使得S.elipsoideusGIM2105具有重要的工业应用
前景。
图6 多批次催化苯甲酰甲酸还原反应的研究
Fig.6 OperationalstabilityofS.elipsoideusforthe
bioreductionofbenzoylformicacid
26 7L反应罐规模转化单批次以及多批次的研究
  在上述工作基础上,对7L反应罐规模的反应
进行了研究,结果见图7。由图7可知:整个反应过
程中溶氧的变化情况,反应初始阶段,DO值快速下
降,此时底物未被转化,可能是细胞利用辅助底物
葡萄糖进行代谢从而进行辅酶循环之后葡萄糖被
消耗,底物进入细胞内,还原反应开始,整个密闭体
系内的DO值开始增高。如何通过对于溶氧的控制
来提高转化的效率,有待下一步研究。
图7 反应罐上催化苯甲酰甲酸的还原反应过程
Fig.7 Reductiveprocessofbenzoylformic
acidona7Lbioreactor
  考察了罐上反应的批次重复性,重复了3个批
次,每个批次产率都达到了80%,e.e.值也维持在
99%。实验表明,在7L的小试反应罐上,该菌株仍
然具有很好的立体选择性和稳定性。3个批次反应
过程曲线与实验数据基本与单批次摇瓶规模反应
一致,而且由于小规模反应罐上的反应条件更为稳
定,最终的产品得率要高于摇瓶规模的反应。因此
利用S.elipsoideusGIM2105通过生物转化法还原
苯甲酰甲酸生成(R)扁桃酸的工艺路线具有一定
的可行性。
73 第5期    王 翔等:葡萄酒酵母不对称还原苯甲酰甲酸合成(R)扁桃酸
3 结 论
  利用本实验室筛选到的1株立体选择性好、批
次稳定的 S.elipsoideusGIM2105对其不对称还原
苯甲酰甲酸生成(R)扁桃酸的条件进行了研究,确
定了最适合的反应条件,发现反应时的溶氧对于提
高底物质量浓度存在显著的影响,在密闭的条件
下,温度35℃,细胞质量浓度为120g/L,底物质量
浓度为10g/L,pH65,反应时间48h时,(R)扁桃
酸产率超过72%,e.e.值达到99%。
  S.elipsoideusGIM2105在反应中,具有良好的
批次稳定性,经过10批次反应,产率无明显降低,产
物对映体过量值均高于98%。转化反应放大至7L
反应罐体系后,S.elipsoideus仍然具有良好的催化
性能,罐上进行3个批次反应,产率都在80%左右,
e.e.值达到99%以上,该菌株具有良好的工业应用
价值。
参考文献:
[1] FurlenmeierA,QuitP,VoglerK,etal.6Acylderivativesofamin
openicilanicacid:US,3957758[P].19760518.
[2] YoshiokaK,HaradaS,OchiaiM,etal.Antibioticderivatives,their
productionanduse:US,4897489[P].19900130.
[3] FerisMJ.Arylethanolaminederivatives,theirpreparationanduse
inpharmaceuticalcompositions:US,4588749[P].19860513.
[4] VasicRackiDJ,JonasM,WandreyC,etal.Continuous(R)man
delicacidproductioninanenzymemembranereactor[J].Appl
MicrobiolBiotechnol,1989,31:215222.
[5] XiaoMT,HuangYY,ShiXA,etal.Bioreductionofphenylglyox
ylicacidtoR()mandelicacidbySaccharomycescerevisiae
FD11b[J].EnzymeMicrobTech,2005,37(6):589596.
[6] LiGY,HuangKL,JiangYR,etal.Productionof(R)mandelic
acidbyimmobilizedcelsofSaccharomycescerevisiaeonchitosan
carier[J].ProcessBiochemistry,2007,42(10):14651469.
[7] XiaoMT,HuangYY,MengC,etal.Kineticsofasymmetricre
ductionofphenylglyoxylicacidtoR()mandelicacidbySac
charomycescerevisiaeFD11b[J].ChineseJournalofChemicalEn
gineering,2006,16(1):7380.
[8] MateoC,PalomoJM,FernandezLorenteG,etal.Improvementof
enzymeactivity,stability and selectivity via immobilization
techniques[J].EnzymeMicrobiolBiotechnol,2007,40(6):
14511463.
[9] HegemanGD,RosenbergEY,KenyonGL.Mandelicacidrace
masefromPseudomonasputidapurificationandpropertiesofthe
enzyme[J].Biochemistry,1970,9(21):
櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒
40294036.
国内简讯
生物合成纳米材料领域取得新进展
能耗、污染以及安全性一直是化学合成领域里亟待解决的问题。武汉大学庞代文、谢志雄和胡斌等教
授的课题组和北京理工大学谢海燕副教授课题组合作,在利用生物学的方法和体系解决化学领域内的问题
上取得了重大进展。课题组通过时空耦合活细胞内的互不相关的生化反应,成功地在活酵母细胞内尺寸及
荧光发射波长可控地合成出了CdSe量子点。通过这种方法,使原本在300℃高温条件下需要使用易燃易爆
有毒的化合物才能得到的CdSe量子点,现在不需添加那些危险有机试剂的条件下,在30℃时就可以合成出
来。
这种方法具有以下的特点:首先,这种时空耦合细胞内非自然存在的生化反应的思路和策略是新颖的;
第二,这种方法本身十分绿色,整个反应过程是在30℃条件下进行的,避免了所有易燃易爆的有毒有机试
剂,并且CdSe是在活的酵母细胞内得到的,这说明这种方法对于细胞的毒性很小;第三,在以往的工作中使
用生物合成的方法得到的半导体纳米材料,既不能得到产物的荧光性质也无法控制产物的粒径大小,而用
这种方法合成的CdSe量子点,无论从材料的单分散性、粒径的控制还是荧光性质等方面都具有以往用生物
合成的方法得到的半导体材料所无法比拟的性质。
(文伟河)
83 生 物 加 工 过 程   第7卷