全 文 ：第７卷第６期
２００９年１１月
生 物 加 工 过 程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．７Ｎｏ．６
Ｎｏｖ．２００９
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１７６２－３６７８．２００９．０６．００２
收稿日期：２００９－０３－２６
基金项目：湖北省自然科学基金资助项目（２００８ＣＤＢ３５４）；武汉市青年科技晨光计划资助项目（２００７５０７３１２８８）
作者简介：杨忠华（１９７６—），男，湖南怀化人，副教授，博士，研究方向：生物催化，Ｅｍａｉｌ：ｙａｎｇｚｈｏｎｇｈｕａ７６＠ｗｕｓｔ．ｅｄｕ．ｃｎ
利用微生物重组技术促进羰基不对称还原研究进展
杨忠华１，王 玉１，曾 嵘２，常 煦１，覃 健１，刘 昶１
（１．武汉科技大学 化学工程与技术学院，武汉 ４３００８１； ２．湖北大学 化学化工学院，武汉 ４３００６２）
摘 要：手性醇是许多手性药物合成的关键手性砌块，利用微生物细胞催化相应前手性羰基化合物不对称还原，
是合成手性醇的重要方法之一。但应用野生微生物催化时，反应的时空产率、立体选择性较低。详细介绍了利用
微生物重组技术以促进前手性羰基化合物不对称还原反应合成手性醇的国内外研究进展。从酶的种类、表达系统
以及辅酶再生系统３个方面对重组细胞催化反应体系的构建进行了概述。同时按照反应底物的类型，对重组微生
物在催化不同类型羰基化合物不对称还原合成手性醇中的应用分别进行了归纳和介绍。
关键词：不对称还原；羰基还原；重组微生物；手性醇
中图分类号：ＴＱ０３３ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－３６７８（２００９）０６－０００８－０７
Ｒｅｃｅｎｔｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆａｓｙｍｍｅｔｒｉｃｒｅｄｕｃｔｉｏｎｏｆｋｅｔｏｎｅｓ
ｗｉｔｈｍｉｃｒｏｂｉａｌｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
ＹＡＮＧＺｈｏｎｇｈｕａ１，ＷＡＮＧＹｕ１，ＺＥＮＧＲｏｎｇ２，ＣＨＡＮＧＸｕ１，ＴＡＮＪｉａｎ１，ＬＩＵＣｈａｎｇ１
（１．ＣｏｌｅｇｅｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＷｕｈａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ４３００８１，Ｃｈｉｎａ；
２．ＦａｃｕｌｔｙｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＣｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＨｕｂｅｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ４３００６２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｅｎａｎｔｉｏｐｕｒｅａｌｃｏｈｏｌｓａｒｅｔｈｅｋｅｙｃｈｉｒａｌｂｕｉｌｄｉｎｇｂｌｏｃｋｓｆｏｒｍａｎｙｉｍｐｏｒｔａｎｔｃｈｉｒａｌｄｒｕｇｓ．Ａｓｙｍ
ｍｅｔｒｉｃｒｅｄｕｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃｏｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｐｒｏｃｈｉｒａｌｋｅｔｏｎｅｓｃａｔａｌｙｚｅｄｂｙｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｅｌｓｗａｓｏｎｅｏｆｔｈｅｍｏｓｔ
ｐｒｏｍｉｓｉｎｇｓｙｎｔｈｅｔｉｃｒｏｕｔｅｓｔｏｐｒｏｄｕｃｅｅｎａｎｔｉｏｐｕｒｅａｌｃｏｈｏｌｓ．Ｂｕｔｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｏｆｔｈｅｓｐａｃｅｔｉｍｅｐｒｏｄｕｃｔｉ
ｖｉｔｙａｎｄｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙｗｅｒｅｎｏｔｍｅｔａｓｔｈｅｗｉｌｄｔｙｐｅｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｗａｓａｐｐｌｉｅｄ．Ｔｈｅｍｉｃｒｏｂｉａｌｒｅｃｏｍ
ｂｉｎａｎｔｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｐｒｏｖｉｄｅｄａｎｅｆｉｃｉｅｎｔａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｔｏｏｖｅｒｃｏｍｅｔｈｅｄｒａｗｂａｃｋｓ．Ｔｈｅｒｅｃｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｉｎ
ｔｈｅａｓｙｍｍｅｔｒｉｃｒｅｄｕｃｔｉｏｎｒｅａｃｔｉｏｎｗｉｔｈｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｗａｓｒｅｖｉｅｗｅｄ．Ｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｃｅｌ
ｓｙｓｔｅｍｗａｓｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｗｉｔｈｔｈｅｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅｓｋｉｎｄ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍａｎｄｔｈｅｃｏｅｎｚｙｍｅｒｅｇｅｎｅｒａ
ｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ．Ｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｉｎｔｈｅｓｅａｓｙｍｍｅｔｒｉｃｒｅｄｕｃｔｉｏｎｒｅａｃｔｉｏｎｗａｓ
ａｌｓｏｄｉｓｃｕｓｓｅｄ．Ｓｏｍｅｐｒａｃｔｉｃａｌｅｘａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｇｉｖｅｎ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃｒｅｄｕｃｔｉｏｎ；ｃａｒｂｏｎｙｌｒｅｄｕｃｔｉｏｎ；ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｍｉｃｒｏｂｅ；ｃｈｉｒａｌａｌｃｏｈｏｌ
手性药物在许多疾病的防治中具有重要意
义［１］，其合成研究受到学界、企业以及政府等方面
的重视［２］。具有特定功能基团的手性醇是合成手
性药物的重要中间体，利用羰基的不对称还原反应
是合成手性醇的重要方法之一［３－５］。在羰基的不对
称催化还原反应研究中，目前钌配合物、硼杂唑
烷以及生物催化是选择性还原羰基化合物的较好
催化体系。与前２种化学催化相比，生物催化因其
具有高度的立体、区域和化学选择性及安全性高和
环境友好等特点，在不对称合成中的应用越来越受
到重视［６］。活性微生物细胞可以催化前手性羰基
的不对称还原，使氧化还原酶催化的不对称还原和
辅酶再生在胞内耦合，是一种很有学术价值和应用
前景的方法［７］。目前已有多种活性微生物细胞成
功地用于催化多种前手性羰基不对称还原合成相
应的手性醇［８－１３］。
在利用微生物活细胞催化不对称合成时，常存
在反应的时空产率低和在某些情况下反应的立体
选择性不高的问题［１４－１５］。主要原因是：１）生物催
化常常只能在低底物浓度下进行，这是由于大部分
非天然化合物对生物有毒害作用，因此微生物只能
忍受很低的底物浓度；２）底物抑制了生物酶催化的
能力；３）活细胞催化时，对于某种反应底物，细胞内
可能有多种酶，既有合成Ｒ 型也有合成 Ｓ 型产物
的能力，甚至还可能存在消旋酶，催化生成不同类
型或不同对映异构体的产物，因而降低了反应的时
空产率和立体选择性。这是利用活细胞催化羰基
不对称还原的共同不足。微生物重组技术为解决
这些问题提供了新的策略。本文对国内外近 １０ａ
来利用微生物重组技术促进前手性羰基的不对称
还原反应进行归纳。从酶的种类、宿主细胞以及当
前常用的辅酶再生系统３个方面对重组细胞催化反
应体系的构建进行概述。同时，按照反应底物的类
型，对重组微生物在催化不同类型羰基不对称还原
合成手性醇反应中的应用进行归纳和介绍。
１ 重组细胞催化反应体系
重组细胞催化羰基不对称还原反应可克服野
生微生物催化时反应的时空产率和立体选择性较
低的障碍，有高效的产率和立体选择性，并且能作
用于不同类型的底物。下面从酶的种类、表达系统
以及当前常用的辅酶再生系统３个方面详细介绍重
组细胞催化反应体系。
１１ 催化羰基不对称还原的酶
在重组细胞催化反应体系中，催化羰基不对称还
原的酶是不可缺少的一部分。近年来，很多学者对催
化羰基化合物还原为手性醇的酶进行了分离纯化及
性质研究，为相应基因工程菌的构建奠定了坚实的基
础。微生物产生的能够还原羰基化合物制备手性醇
的氧化还原酶，主要有醛酮还原酶家族（ａｌｄｏｋｅｔｏｒｅ
ｄｕｃｔａｓｅｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ＡＫＲ）、短链脱氢酶／还原酶家族
（ｓｈｏｒｔｃｈａｉｎｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ／ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ＳＤＲ）和中链脱
氢酶／还原酶家族（ｍｅｄｉｕｍｃｈａｉｎｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ／ｒｅ
ｄｕｃｔａｓｅｓ，ＭＤＲ）。这些酶中的一部分已经被克隆并在
宿主细胞中过量表达。表１列出了部分酶的来源以
及催化的不对称还原反应。
表１ 在重组细胞中过表达催化羰基不对称还原的酶
Ｔａｂｌｅ１ Ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｃｅｌｔｈａｔｃａｔａｌｙｚｅｔｈｅａｓｙｍｍｅｔｒｉｃｒｅｄｕｃｔｉｏｎｒｅａｃｔｉｏｎｏｆｐｒｏｃｈｉｒａｌｋｅｔｏｎｅｓ
羰基还原酶 分类 来源 不对称还原反应 辅酶 文献
Ｙｐｒ１ｐ
醛基还原酶
酮还原酶
ＡＫＲ
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ 重组细胞能不对称还原各类酮和醛，其中对醛有更好的作用 ＮＡＤＰＨ ［１６］
Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ 催化４氯乙酰乙酸乙酯不对称还原为ＲＣＨＢＥ，ｅｅ值为９９％ ＮＡＤＰＨ ［１７］
Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ
利用 ６ 磷酸葡萄糖脱氢酶实现辅酶再
生，不对称还原２氯 １（３氯苯基）乙
酮，得到Ｓ型醇，ｅｅ值１００％
ＮＡＤＰＨ ［１８］
Ｓ还原酶
羰基还原酶
ＳＤＲ
ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａＳＣ１６２６９
利用甲酸脱氢酶实现辅酶再生，将６ 羰
基丁螺环酮还原为 ６ 羟基丁螺环酮，
ｅｅ值＞９９９％
ＮＡＤＨ ［１９］
Ｃａｎｄｉｄａｍａｇｎｏｌｉａｅ 对３ 羰基丁酸烷基酯的不对称还原获得了Ｓ型的３羟基烷基酯，ｅｅ值＞９９％ ＮＡＤＰＨ ［２０］
Ｓ醇脱氢酶 ＭＤＲ Ｒｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ 利用甲酸脱氢酶实现辅酶再生，催化各种酮类的不对称还原反应，ｅｅ值＞９９％ ＮＡＤＨ ［２１］
当然，除了以上３类家族的酶之外，还有其他一
些氧化还原酶，被克隆并在宿主细胞中表达，应用于
羰基化合物的不对称还原。Ｉｔｏｈ等［２２］利用 Ｃｏｒｙｎｅ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株 ＳＴ １０中产生的苯乙醛还原酶
９ 第６期 杨忠华等：利用微生物重组技术促进羰基不对称还原研究进展
（ＰＡＲ），以异丙醇为辅助底物，在大肠杆菌中过量表
达，催化各种芳香酮和 β 酮酯的不对称还原反应，
ｅｅ值都大于９８％。对该酶的ＤＮＡ比对分析发现该
酶属于含 Ｚｎ的长链脱氢酶家族。Ｋａｔａｏｋａ等［２３］从
Ｃａｎｄｉｄａｍａｃｅｄｏｎｉｅｎｓｉｓ中纯化得到的甲萘醌还原酶，
被证实属于黄烷酮醇４ 还原酶超家族；异源表达该
酶的大肠杆菌基因工程菌，可用于还原 ＣＯＢＥ成
Ｓ ＣＨＢＥ，产量为１６８０ｍｍｏｌ／Ｌ（２８１ｍｇ／ｍＬ），摩尔
产率为９２２％，ｅｅ值为９１６％。
１２ 表达系统
利用ＤＮＡ重组技术将外源基因在体外构建完
成后，需要将其导入特定的宿主细胞。重组菌的活
性高低与质粒在不同宿主菌的表达水平密切相关。
表达系统构建是将所构建的质粒转入不同的宿主
细胞，研究宿主菌和质粒之间的相互选择。目前国
内外报道合成手性醇重组菌的构建采用的宿主菌
有真核生物酵母菌和原核生物大肠杆菌。Ｋａｔｚ
等［２４］将 ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＣＥＮＰＫ１１３７Ｄ中
编码双环二酮（ＢＣＯ２，６Ｄ）还原酶的３个基因克隆
并构建了 ３个表达质粒 ｐ４２３ＹＭＲ２２６ｃ，ｐ４２３
ＹＤＲ３６８ｗ，ｐ４２３ＹＯＲ１２０ｗ，分别在宿主菌 Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＴＭＢ中表达，得到 ３株重组菌株
ＴＭＢ４０９１、ＴＭＢ４０９３和 ＴＭＢ４０９６，考察了这 ３株重
组菌株不对称还原双环二酮的情况。在辅助底物
葡萄糖的参与下，ＴＭＢ４０９１菌株具有最高的催化活
性，与原始菌株相比，此菌株有效地缩短了反应时
间，降低了葡萄糖的利用量和副产物的生成量。
大肠杆菌本身不具备还原羰基化合物的能力，可
将羰基不对称还原酶的基因从供体细胞中克隆再转
入大肠杆菌中表达，故当前采用较多的宿主菌是大肠
杆菌。Ｉｎｏｕｅ等［２５］将乙醇脱氢酶基因（ＬＳＡＤＨ）克隆
在不同质粒中，构建了６个表达质粒ｐＵＬＡ（ｌａｃ）、ｐＫ
ＬＡ（ｔａｃ）、ｐＴＬＡ（ｔｒｃ）、ｐＥＬＡ（Ｔ７）、ｐＵＥＬＡ（ｌａｃ）和ｐＫＥ
ＬＡ（ｔａｃ），并把这６个质粒分别表达在４种大肠杆菌
Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）和Ｅ．ｃｏｌｉ
ＸＬ１ＢｌｕｅＭＲＦ’中，研究了不同表达体系对 ＬＳＡＤＨ
表达水平的影响。其中以 ｐＫＥＬＡ（ｔａｃ）作为表达载
体，在 Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１中表达表现出最高的活力，其
ＬＳＡＤＨ活力比原始菌株提高了１７０倍。
羰基还原反应必须在辅酶的参与下进行，而大肠
杆菌细胞的辅酶再生酶系很弱，仅能利用葡萄糖在代
谢过程中产生少量的辅酶ＮＡＤＰＨ，这不足以提供还
原反应必要的“还原力”。针对这一点，有些学者构
建了共表达系统。Ｅｍａ等［２６］分别构建了 ｐＥＳＣＲ，
ｐＡＢＧＤ和 ｐＡＣＲＧＤ３种质粒，质粒 ｐＥＳＣＲ只含有
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中的羰基还原酶基因（ＳＣＲ），质粒ｐＡＢＧＤ
只含有葡萄糖脱氢酶基因（ＧＤＨ），质粒 ｐＡＣＲＧＤ含
有ＳＣＲ和ＧＤＨ这两段基因，如图１所示。得到４种
重组菌株 Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１ｐＥＳＣＲ，Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１ｐＡＢＧＤ，
Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１ｐＡＣＲＧＤ和 Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１ｐＥＳＣＲ＋ｐＡＢ
ＧＤ，考察了它们对各种酮的不对称还原情况。实验
结果表明，单质粒表达系统Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１ｐＥＳＣＲ对底
物的转化率不高，ＥｃｏｌｉＢＬ２１ｐＡＢＧＤ对底物的转化
率为０，而２种共表达系统Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１ｐＥＳＣＲ＋ｐＡＢ
ＧＤ、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１ｐＡＣＲＧＤ对底物的转化率远远高于
单质粒表达系统，且ｅｅ值都大于９８％。同时，还发
现双质粒共表达系统Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１ｐＥＳＣＲ＋ｐＡＢＧＤ比
Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１ｐＡＣＲＧＤ具有更好的催化能力，这主要
是因为在双质粒表达系统中，宿主菌对２种酶的表
达水平进行了调控。
图１ 质粒ｐＡＢＧＤ，ｐＥＳＣＲ和ｐＡＣＲＧＤ的结构
Ｆｉｇ．１ ＳｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｐｌａｓｍｉｄｐＡＢＧＤ，ｐＥＳＣＲａｎｄｐＡＣＲＧＤ
１３ 辅酶再生系统
在重组细胞催化的还原反应体系中，辅酶再生系
统就是把辅酶从氧化态再生为还原态。对于羰基的
不对称还原反应，目前国内外关于氧化还原酶辅酶再
生的研究报道多采用酶耦联法和底物耦联法。
酶耦联法利用２个平行的氧化还原反应酶系统，
０１ 生 物 加 工 过 程 第７卷
一个酶催化底物转化，另一个酶则催化辅酶循环再
生。目前羰基还原酶重组细胞中采用较多的再生酶
包括甲酸脱氢酶（ＦＤＨ）和葡萄糖脱氢酶（ＧＤＨ），
ＦＤＨ一般情况只能对ＮＡＤＨ进行再生，ＧＤＨ可以对
ＮＡＤＨ和ＮＡＤＰＨ进行再生。Ｋａｔａｏｋａ等［２３］从Ｃａｎｄｉ
ｄａｍａｃｅｄｏｎｉｅｎｓｉｓ中克隆出甲萘醌还原酶在大肠杆菌
中过量表达，并利用葡萄糖脱氢酶（ＧＤＨ）实现辅酶
ＮＡＤＰＨ再生，催化４ 氯 乙酰乙酸乙酯的不对称还
原反应，得到（Ｓ） ４ 氯 ３ 羟基丁酸乙酯产率为
９２２％，ｅｅ值为９１６％。相对而言，ＦＤＨ比ＧＤＨ更
有应用前景，因为对于甲酸／甲酸脱氢酶再生系统，甲
酸价格低廉且很多酶对它有很高的耐受性，且此体系
只产生１种副产物ＣＯ２，而ＣＯ２对任何酶的活性均没
有影响，同时ＣＯ２作为气体，很容易从反应体系中分
离出来，使反应向正方向进行，直至反应完全。
底物耦联法是在反应过程中添加辅助底物，在
相同酶的催化下实现目标底物和辅助底物同时转
化，但两者方向相反。Ｍａｔｓｕｙａｍａ等［２７］从近平滑假
丝酵母（Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓＩＦＯ１３９６）中分离出一种新的
仲醇脱氢酶（ＣｐＳＡＤＨ），将其克隆并在大肠杆菌中
表达，在辅助底物异丙醇的存在下顺利实现辅酶再
生，并高效催化４ 氯 乙酰乙酸乙酯的不对称还原，
产物的ｅｅ值达到了９９％。
底物耦联法比酶耦联法具有更广阔的前景，原因
在于底物耦联法只涉及１种酶，操作更简单，同时，利
用底物耦联的菌株稳定性好，并且能耐受较高浓度的
底物和辅助底物。Ｓｔａｍｐｆｅｒ等［２８］从Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｒｕｂｅｒ
４４５４１分离出１种醇脱氢酶，利用辅助底物异丙醇实
现辅酶再生，在催化底物不对称还原时，异丙醇体积
分数可达到５０％，底物浓度达到２ｍｏｌ／Ｌ。同时，副产
物丙酮可以通过渗透蒸发等方法从反应体系中除去，
消除平衡限制，提高转化率。
２ 重组细胞催化羰基不对称还原的应用
当前，国内外对利用重组微生物催化脂肪酮、
芳香酮和羰基酯等各种前手性羰基不对称还原进
行了一些研究，下面按底物的类型分别介绍。
２１ 还原脂肪酮
羰基还原酶在大肠杆菌中过量表达得到的重
组细胞对脂肪酮有很好的选择性。Ｍａｔｓｕｙａｍａ等［２７］
筛选出１种能高效不对称还原得到（Ｒ）１，３ｂｕｔａｎｅ
ｄｉｏｌ的菌株—Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓＩＦＯ１３９６，将此菌中的仲
醇脱氢酶基因克隆并在大肠杆菌中表达，催化还原
５ 氯 ２ 戊酮得到（Ｓ） ５ 氯 ２ 戊醇的产率达到
９５２％，ｅｅ值为９８％。同时，Ｈｕｍｍｅｌ等［２１］将红球
菌中的（Ｓ）醇脱氢酶在大肠杆菌中表达，可以不对
称还原２ 庚酮和２ 辛酮得到（Ｓ）型产物，转化率
都大于９５％，ｅｅ值都大于９９％。Ｉｔｏｈ等［２２］发现将
ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｔｒａｉｎＳＴ １０中的苯乙醛还原酶在
大肠杆菌中表达后，对３ 氯丙酮和３，３ 二氯丙酮、
３ 氯 ２ 丁酮等有很强的催化能力。
２２ 还原芳香酮
含芳香基的手性醇是多种手性药物合成的关键
手性砌块，如２氯 １（３ 氯苯基）乙醇是抗癌药物
合成的重要中间体，Ｈａｎｓｏｎ等［１８］从 Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙ
ｍｏｒｐｈａＡＴＣＣ５８４０１中分离出１种酮还原酶基因并在
大肠杆菌中表达，得到（Ｓ）２氯 １（３氯苯基）乙
醇和它的类似物，产率达到 ９０％，ｅｅ值为 １００％。
Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ等［２９］从荧光假单孢杆菌（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）
中分离出醇脱氢酶（ＰＦＡＤＨ），在大肠杆菌中过量表
达后，发现能高效地不对称还原苯乙酮及其衍生物
（图２），产物ｅｅ值在４５％～９９％之间，１０～２０℃时
反应活性最高，且在加入异丙醇体积分数达１０％ ～
２０％时，辅酶ＮＡＤＨ可以高效率循环利用，其结果如
表２所示。
Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ为Ｅ．ｃｏｌｉ粗酶液中的脱氢酶
图２ 重组醇脱氢酶细胞催化苯乙酮及其衍生物
不对称还原示意图
Ｆｉｇ．２ Ｓｃｈｅｍｅｆｏｒａｓｙｍｍｅｔｒｉｃｒｅｄｕｃｔｉｏｎｏｆａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ
ａｎｄｉｔｓｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓｕｓｉｎｇｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＰＦＡＤＨｃｅｌ
表２ 重组醇脱氢酶对苯乙酮及其衍生物的不对称还原结果
Ｔａｂｌｅ２ Ｒｅｓｕｌｔｓｏｆａｓｙｍｍｅｔｒｉｃｒｅｄｕｃｔｉｏｎｏｆａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ
ａｎｄｉｔｓｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓｕｓｉｎｇｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＰＦＡＤＨ
底物 转化率／％ ｅｅ值／％
苯乙酮 ９５ ９２
４甲基苯乙酮 ８２ ４２
２甲氧基苯乙酮 ３１ ＞９９
３甲氧基苯乙酮 ８９ ９２
４甲氧基苯乙酮 ３８ ４５
４氟苯乙酮 ９１ ９１
４氯苯乙酮 ２９ ７９
１１ 第６期 杨忠华等：利用微生物重组技术促进羰基不对称还原研究进展
聂尧等［３０］克隆了近平滑假丝酵母（Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏ
ｓｉｓ）的（Ｒ）专一性羰基还原酶（ｒＣＲ）的基因，并构
建重组质粒转入 ＥｃｏｌｉＢＬ２１中进行表达，在底物
２ 羟基苯乙酮质量浓度为５ｇ／Ｌ时，（Ｒ）苯基乙二
醇的产率达９２６％，ｅｅ值为９５５％。Ｘｕ等［３１］从
Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓＣＣＴＣＣＭ２０３０１１中克隆出（Ｒ）专一
性羰基还原酶（ｒＣＲ）的基因，研究发现 ｒＣＲ基因片
段大小是１０１１ｂｐ，编码了３３６个氨基酸序列，而且
基因序列与其他脱氢酶家族的相似性达到 ９９％。
将ｒＣＲ基因在大肠杆菌中过量表达，催化 β 羟基
苯乙酮不对称还原，产物（Ｒ）苯基乙二醇的产率为
８０１４％，ｅｅ值达到１００％，并且在整个还原过程中
不需要加入额外的辅酶ＮＡＤＨ。
２３ 还原羰基酯
重组细胞应用于羰基酯的还原已有多处报道。
在β羰基酯类化合物中４ 氯乙酰乙酸乙酯的不对
称还原研究得最多。其对应的 Ｒ 和 Ｓ 产物（４
氯 ３ 羟基丁酸乙酯）可通过不同的重组细胞得到，
表３列举了一些有代表性的重组细胞催化的不对称
还原过程。
表３ 不同的重组细胞还原４氯乙酰乙酸乙酯的比较
Ｔａｂｌｅ３ Ｃｏｍｐａｒｉｓｉｏｎｏｆｖａｒｉｏｕｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｃｅｌｓｆｏｒｔｈｅｒｅｄｕｃｔｉｏｎｏｆｅｔｈｙｌ４ｃｈｌｏｒｏ３ｏｘｏｂｕｔａｎｏａｔｅ
氧化还原酶 宿主细胞 产率／％ ｅｅ值／％ 文献
ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｔｒａｉｎＳＴ １０中的苯乙醛还原酶 大肠杆菌 ＞８６ ９９（Ｒ） ［２２］
Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏ中的醛还原酶 大肠杆菌 ９１１ ９１（Ｒ） ［３２］
ＣａｎｄｉｄａｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓＩＦＯ１３９６中的仲醇脱氢酶 大肠杆菌 ９５２ ９９（Ｒ） ［２７］
Ｃａｎｄｉｄａｍａｃｅｄｏｎｉｅｎｓｉｓ中的甲萘醌还原酶 大肠杆菌 ９２２ ９１６（Ｓ） ［２３］
Ｐｉｃｈｉａｆｉｎｌａｎｄｉｃａ中的仲醇脱氢酶 大肠杆菌 ９８５ ９９（Ｓ） ［３３］
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中的脂肪酸合成酶 酿酒酵母 ９４ ９０（Ｓ） ［３４］
Ｃａｎｄｉｄａｍａｇｎｏｌｉａｅ中的羰基还原酶 大肠杆菌 ８５ １００（Ｓ） ［３５］
Ｙａｓｏｈａｒａ等［２０］将 Ｃａｎｄｉｄａｍａｇｎｏｌｉａｅ中的羰基
还原酶（Ｓ１）基因和葡萄糖脱氢酶基因在大肠杆菌
中共表达，研究了重组细胞对３ 羰基丁酸烷基酯的
不对称还原情况，其中对４ 氯乙酰乙酸乙酯的还原
最好，ｅｅ值＞９９％。
重组细胞也能不对称还原 α 羰基酯。Ｅｍａ
等［２６］将Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中的羰基还原酶基因（ＳＣＲ）和
Ｂａｃｉｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ中的葡萄糖脱氢酶基因插入到
同一个质粒载体中并在大肠杆菌中过量表达，不对
称还原２ 羰基丙酸乙酯，得到Ｓ构型的产物，产率
为６４％，ｅｅ值达到９４％。
２４ 还原二酮
二酮类化合物的不对称还原，在生物催化中占
有较重要的地位。Ｍａｒｕｙａｍａ等［３６］将 Ｂａｃｉｌｕｓｃｅｒｅｕｓ
中的二苯基乙二酮还原酶在大肠杆菌中过量表达，
并探讨了重组细胞对二苯基乙二酮等一系列二酮
化合物的不对称还原。结果发现重组的二苯基乙
二酮还原酶能还原含有相邻羰基的二酮化合物，其
中不对称还原二苯基乙二酮的情况如图３所示。
图３ 重组细胞不对称还原二苯基乙二酮
Ｆｉｇ．３ Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃｒｅｄｕｃｔｉｏｎｏｆｂｅｎｚｉｌｂｙｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｃｅｌ
重组细胞也能将 β 二酮不对称还原。Ｅｍａ
等［２６］将Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中的羰基还原酶（ＳＣＲ）在大肠
杆菌中过量表达，对一些 β 二酮不对称还原，其
ｅｅ值＞９９％，产率可达到７０％。
２５ 其他底物
重组细胞也能催化其他底物的不对称还原反
应，如含氮的酮［３５］、萘醌［２６］等，同时重组细胞能将
羰基氨基化。Ｇｒｇｅｒ等［３７］将 Ｂａｃｉｌｕｓｃｅｒｅｕｓ中的亮
氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶在大肠杆菌中共表达，不
对称还原４，４ 二甲基 ２ 羰基戊酸钠生成Ｌ 新戊
基氨基乙酸，转化率 ＞９５％，ｅｅ值 ＞９９％。Ｈｌｒｉｇｌ
等［３８］从ＴｈｅｒｍｕｓｓｐＡＴＮ１分离出１种依赖于辅酶
２１ 生 物 加 工 过 程 第７卷
ＮＡＤＨ的热稳定性的醇脱氢酶（ＴＡＤＨ），在大肠杆
菌中过量表达后，重组细胞能催化各种醛和各种酮
的不对称还原反应，得到 Ｓ 型的醇，ｅｅ值 ＞９９％。
其中ＴＡＤＨ能催化醛发生歧化反应生成醇和羧酸，
如图４所示，在高 ｐＨ时，反应向生成羧酸方向移
动。研究发现，在ｐＨ＝９时，反应进行２４ｈ后，醛全
部转化为羧酸。
图４ ＴＡＤＨ催化的醛歧化反应
Ｆｉｇ．４ ＡｌｄｅｈｙｄｅｄｉｓｍｕｔａｔｉｏｎｒｅａｃｔｉｏｎｃａｔａｌｙｚｅｄｂｙＴＡＤＨ
由于不对称还原反应中的底物酮类大多对细
胞的毒性较大，同时在水相中底物和产物的水溶性
较低，为克服上述困难，已有学者研究了有机相／水
相体系以及对细胞毒害较小的离子液体／水相等双
体系中的生物催化。Ｂｒｕｔｉｇａｍ等［３９］将来自于 Ｌａｃ
ｔｏｂａｃｉｌｕｓｂｒｅｖｉｓ的醇脱氢酶和来自于 Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｖａｃｃａｅＮ１０的甲酸脱氢酶在大肠杆菌中过量表达，
在离子液体／水两相体系中研究此重组细胞对羰基
的不对称还原，研究发现离子液体的加入没有影响
辅酶的再生，而且与水相体系相比，产物４ 氯 ３
羟基丁酸的时空产率提高了１３倍。Ｓｃｈｒｏｅｒ等［４０］利
用重组细胞连续催化乙酰乙酸甲酯不对称还原，利
用底物耦联的重组菌株连续反应超过７ｄ，底物和辅
助底物的浓度分别达到了２５ｍｏｌ／Ｌ和２８ｍｏｌ／Ｌ，
重组菌株仍保持较高的催化活性，转化率达到９０％
以上，ｅｅ值＞９９％。
３ 结 语
重组细胞催化前手性羰基不对称还原合成相
应的手性醇，是具有应用前景的手性醇合成方法
之一。在过去的１０ａ里，各国学者对重组细胞催
化羰基不对称还原的反应特性进行了研究，利用
重组细胞催化各种不同的酮得到了立体选择性很
高的Ｓ醇或 Ｒ 醇。这些研究都为重组细胞应用
于生产打下了基础。将重组细胞催化反应体系应
用于生产，并且有效地提高时空产率，应是未来研
究的重点。
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ｍａｎｔｃｅｌｓｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｔｈｅｃａｒｂｏｎｙｌｒｅｄｕｃｔａｓｅａｎｄｇｌｕｃｏｓｅｄｅｈｙｄｒｏ
ｇｅｎａｓｅｇｅｎｅｓ［Ｊ］．ＡｐｐｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００１，５５（５）：５９０５９５．
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４１ 生 物 加 工 过 程 第７卷