全 文 ：不对称还原 !!辛酮的菌株筛选和反应条件的研究
胡 健，徐 岩!
（江南大学 生物工程学院教育部工业生物技术重点实验室，无锡 "#$%&’）
摘 要：从本实验室保藏菌株中筛选出一株酒明串珠菌 !"#$%$%%&’ $"#( ()(* $+&%，能不对称还原 "!辛酮得到 )!"!辛
醇。对反应条件的研究表明：*,-.!硼酸（*/)）是最佳缓冲液，葡萄糖是最佳辅助底物，壬烷是最佳有机相，当采用
&%% 0012 3 4的 */)缓冲液、&%% 0012 3 4的葡萄糖、# 5 #（体积比）的两相比、#6% 7 3 4 的湿菌体质量浓度下，可以实现
&8的 "!辛酮转化为 )!"!辛醇（转化率 9 ::8），并且 " ; " ; 值为 :+8。
关键词：不对称还原；"!辛醇；菌株筛选；全细胞生物催化；两相反应
中图分类号：*<%&& 文献标识码：= 文章编号：#’+" > &’+?（"%%6）%& > %%$" > %6
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.12VHDK J-ZQC.-P .I.KH0.
手性 "!辛醇是合成类固醇、生物杀虫剂、昆虫性
外激素等许多光学活性药物和农药的重要手性中间
体，也是制备高性能液晶及其器件的不可缺少的重
要手性原料，它的旋光性和高介电常数与液晶的许
多性能密切相关；作为重要的中间体，也用于精细化
工有机合成，生产手性化学材料［#，"］。
目前国内主要利用脂肪酶动力学拆分混旋 "!辛
醇得到 *!"!辛醇［& ^ 6］，但该途径在获得 " ; " ; 值为
:+8的产品时需要进行多步反应，大大增加了工业
化成本。近几年来采用脱氢酶还原 "!辛酮的途径得
到重视，反应途径见图 #。反应只需一步即可完成，
并且得到的手性醇的 " ; " ; 值都很高（ 9 ::8）［’］。
例如，有报道利用面包酵母来还原 "!辛酮得到 *!"!
辛醇［+］，但底物浓度仅 + ;? 0012 3 4，并且一旦提高底
! 收稿日期："%%6!%:!%’
基金项目：国家自然科学基金（编号："%&+’%&#）。
作者简介：胡健（#:?#!），男，江苏苏州市人，硕士研究生，研究方向：发酵工程。
联系人：徐 岩，)!0C-2：IXO_ .IKO ; HNO ; PD
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·$"·
生 物 加 工 过 程
(Q-DH.H B1O,DC2 1L /-1Z,1PH.. )D7-DHH,-D7
第 & 卷第 & 期
"%%6 年 ? 月
万方数据
物浓度就会使转化率和 ! ! ! ! 值都迅速下降。此外
还有利用来自假单胞菌中的脱氢酶来进行还原反应
的，但转化率偏低［"］。国外利用酶来进行还原反
应［#］，但成本居高不下。本研究针对底物浓度低，反
应步骤多的问题，采用水 $有机相［%，&’］作为反应体系
来简化反应和后续的提取步骤。希望能筛选到一株
不对称还原能力高的菌株，并对还原反应进行优化，
实现胞内辅酶高效再生，达到高转化率，高 ! ! ! ! 值
的目的。
图 & 不对称还原 ()辛酮的反应过程
*+, !& -./01+23 405.6. 728 8.9:01+23 27 ()201/323. 12 0288.4;239+3, 05+8/< /<0252<4
! 材料与方法
& !& 实验材料
& !& !& 菌种
筛菌所用的菌种均由本实验室保藏，分别来自
美国菌种保藏中心（=>??），西班牙普通微生保藏中
心（?@?>），中国典型培养物保藏中心（??>??），中国
工业微生物菌种保藏中心（?A??），台湾菌种保存及
研究中心（??-?）。
& !& !( 试剂
()辛醇，()辛酮，")()辛酮，#)()辛酮，#)（ B ）)
C@A?（#)（ B）)&)［&)苯基］乙基异氰酸酯）购自 *<:D/
公司，色谱纯。正壬烷等其它化学试剂购自中国医
药（集团）上海化学试剂公司，分析纯。
& !( 实验方法
& !( !& 培养基
酵母培养基成分：葡萄糖 EF，酵母膏 ’ !GF，无
机盐溶液体积分数 &’F，;H I !’。
霉菌培养基成分：葡萄糖 (F，蛋白胨 ’ !JF，酵
母膏 ’ !GF，无机盐溶液体积分数 JF，;H I !’。
细菌培养基成分：葡萄糖 ’ !JF，酵母膏 ’ !(F，
无机盐溶液体积分数 JF，;H I !’。
无机盐溶液成分：（KHE）( HCLE &GF，MH( CLE
IF，N,OLE·IH(L ’ !"F，K/?< ’ !&F。
& !( !( 培养方法及还原反应
将斜面培养基上菌落转接到液体培养基中，
&J’ 8 $ 6+3，G’ P摇瓶培养。培养 E" 5 后离心，生理
盐水洗涤得到菌体。将菌体加入 >8+4)H?< 缓冲液
中，菌体质量浓度为 &’’ , $ Q，并加入葡萄糖用于
K=R的再生。同时加入有机相（()辛酮溶于正辛烷
中），使反应液中 $（水相）S $（有机相）T & S &。初筛
时反应体系为 ( 6Q，()辛酮浓度为 %’ 662< $ Q，用试
管进行反应，反应 E" 5，并保持厌氧。复筛时反应体
系扩大为 &’ 6Q，()辛酮浓度为 I" 662< $ Q，并用
J’ 6Q 摇 瓶 进 行 反 应。 反 应 结 束 后，离 心
（" ’’’ 8 $ 6+3，&J 6+3），取有机相进行气相色谱分析，
测定产物浓度和 ! ! ! ! 值。
& !G 分析方法
& !G !& 产物浓度的检测
产物和反应物的浓度通过气相色谱法进行分
析，采用 U?&&’(（上海），用毛细管柱 C@U)(’’’’，可
在 &(’ P下将 ()辛酮和 ()辛醇分开，有利于快速分
析及测转化率。色谱操作条件为：气化和检测温度
(’’J 年 " 月 胡 健等：不对称还原 ()辛酮的菌株筛选和反应条件的研究 ·EG·
万方数据
为 !"# $，%!为载气，采用程序升温，&!# $保留
& ’()，升温速率为 &# $ * ’()，升至 &+# $保留 !
’()。!,辛酮和 !,辛醇的保留时间分别为 - ./ ’() 和
" .& ’()。
& ./ .! 产物对映体过量值（ ! . !）的检测
以手性试剂 ",（ 0）,1234将还原反应得到的 !,
辛醇的对映异构体衍生化为非对映异构体后，用气
相色谱法检测，方法如下：在一定量的反应混合物
中，加入 - !5 手性试剂 ",（ 0 ）,1234（ ",（ 0 ）,（&,
678)9:）8;79: (<=>9?)?;8<，",（ 0）,&,［&,苯基］乙基异氰
酸酯），/@ $摇床中振荡反应 -" ’()，然后加入 &#!5
乙醇，再振荡反应 &" ’()，然后用气相色谱仪
A4/B##（C?D(?) 公司产品）进行分析。采用 41,47(,
D?<(:,E8F 4G色谱柱（!" ’ H # .!" ’’ H # .!"!’），载
气为 I!；程序升温，&!# $（! ’()），" $ * ’()，&B# $
（! ’()）。
! 结果与讨论
! .& 菌种筛选
采用 & .! 的方法对包括酵母、细菌和霉菌在内
的 B/ 株菌株进行 !,辛酮的还原反应活性筛选测定。
最后得到一株酒明串珠菌 #!$%&%&&’( %!$) 424J
-@/#，其转化率和 ! . ! . 值均最高，可以转化得到 ",
!,辛醇，复筛底物浓度为 @K ’’=: * 5 时，!,辛酮转化
率为 BB .KL，! . ! . 值为 B@ .KL。将该菌用作进一步
实验用菌。
! .! 水相缓冲液对反应的影响
! .! .& 不同缓冲液对反应的影响
本反应是两相反应，菌体在两相界面间催化反
应，反应会受到有机相的抑制，因此需要有效的缓冲
液来保护细胞和酶。而且在反应中会产生葡糖酸，
使反应体系的 6I 降低，而不同的缓冲液的缓冲效
果也是不同的。因此分别实验了 JD(<,乙酸（JM2），
JD(<,磷酸（J12），JD(<,硼酸（JG2），JD(<,盐酸（J2），JD(<,
甘氨酸（JA），磷酸（12）等常见的缓冲液作为水相。
从表 & 中可以看出采用 JG2 缓冲液时，反应的转化
率和 ! . ! . 值最高。而空白即无缓冲效果的纯水作
为水相时，也有一定的转化率，但是很低。因此采用
JG2缓冲液作为反应时的水相。
! .! .! 缓冲液浓度对反应的影响
缓冲液的作用在于保持适宜的 6I 值范围，同
时保持水相中细胞与酶的活性，使反应能顺利进行
下去。反应体系是采用葡萄糖来再生辅酶，会产生
大量的葡萄糖酸，如果 6I 太低则会使反应无法进
行下去，与此相反，浓度太高也会影响转化效果。因
此考察缓冲液 JG2 的浓度对反应的影响。当有机
相中底物 !,辛酮浓度为 &"+ ’’=: * 5 时，转化率随着
JG2浓度的升高而升高，在 /## ’’=: * 5 时达到几乎
完全转化（ N BBL），而 JG2 浓度对 ! . ! . 值没有影
响（见图 !）。
表 & 缓冲液对反应的影响
J?O:8 & 2PP8>; =P OQPP8D =) ;78 D8?>;(=)
GQPP8D 转化率 * L ! . ! . * L
JM2 /# .- B- ."
J12 -& ." B" .#
JG2 K@ ./ B+ .K
J2 "/ ./ B" .&
JA /B .# B" .B
12 -- .- B+ .-
G:?)R ! .B K! .@
—!— ! * ! *（L）；—"—转化率（L）
图 ! JG2浓度对反应的影响
S(T .! 2PP8>; =P JG2 >=)>8);D?;(=) =) ;78 D8?>;(=) ?; &"+ ’’=: * 5
!,=>;?)=)8
! ./ 辅助底物对反应的影响
! ./ .& 不同辅助底物对反应的影响
细胞中氧化还原酶催化 !,辛酮还原要不断消耗
作为电子供体的还原型辅酶 %ME（1）I，活性细胞为
了保持正常的生理氧化还原状态，就会不断地进行
还原型辅酶的再生，但辅酶再生需要能量。因此考
察了葡萄糖、蔗糖、果糖、甲酸、乙醇、异丙醇和甘油
等辅助底物对不对称还原的影响，结果如图 / 所示。
从图 / 中可以看出，不同的辅助底物对酒明串珠菌
的催化活性具有较大的影响，其中以葡萄糖的结果
最好。除此之外，乙醇和异丙醇对转化具有一定的
·--· 生物加工过程 第 / 卷第 / 期
万方数据
促进作用，其中采用异丙醇来还原辅酶，是采用葡萄
糖时转化率的一半。而甲酸会抑制反应，其转化率
比未加任何辅助底物的空白还低，几乎为 !。在刚
开始筛菌的时候，设计了用葡萄糖来再生辅酶的反
应路线，得到的该菌是含有醇脱氢酶和葡萄糖脱氢
酶，由双酶来进行反应。而当采用异丙醇时，是由醇
脱氢酶自身来进行氧化和还原两步反应，因此存在
竞争性抑制，反应速率就会比较低。
图 " 辅助底物对反应的影响
#$% &" ’(()*+ ,( *,-./0.+12+) ,3 +4) 1)2*+$,3
—!— ! " ! "（5）；—"—转化率（5）
图 6 葡萄糖浓度对反应的影响
#$% &6 ’(()*+ ,( %7/*,.) *,3*)3+12+$,3 ,3 +4) 1)2*+$,3
8 &" &8 葡萄糖浓度对反应的影响
全细胞内酶系丰富，葡萄糖的代谢情况可能会
对还原反应具有一定的影响，因此考察了不同葡萄
糖的浓度对反应的影响，结果如图所示。可以发现，
随着葡萄糖浓度的增大，反应转化率上升。但当葡
萄糖浓度超过 "!! 99,7 : ; 后，转化率反而会下降。
这是由于葡萄糖会在葡萄糖脱氢酶的作用下变成葡
萄糖内酯，接着在水作用下变成葡糖酸，这是一个不
可逆的过程。而在高浓度的葡萄糖存在下，就会生
成大量的葡糖酸，使水相 <= 迅速降低，对氧化还原
酶产生了抑制。
8 &6 有机相对反应的影响
8 &6 &> 不同有机相对反应的影响
有机溶剂对细胞毒性分为分子毒性和相毒性。
在本两相反应中，脱氢酶消耗辅酶来还原 8-辛酮，同
时产生 ?@A（B）C，而反应要持续进行下去，就必须
利用葡萄糖来再生辅酶，但是有机溶剂会影响该辅
酶再生体系。其中相毒性影响较大，细胞粘附在界
面上使得辅助底物和底物的传输受到了限制，阻碍
了细胞内还原反应的持续进行，影响其转化率。而
分子毒性可能是因溶剂对酶的抑制，使蛋白质变性
及对膜进行修饰所致。
由图 D 可知，有机溶剂对反应的影响与其疏水
性（用 7%# 表示）相关。本实验采用了 >! 种常用有
机溶剂，它们的 7%# 值从 ! &D E F &F。当采用强极性
的有机溶剂（如乙酸乙酯）时，由于其对细胞的毒性
太大，使得反应几乎不能进行。随着溶剂 7%# 值的
增大，溶剂极性变小，反应的转化率迅速增加，而产
物 ! & ! & 值受溶剂的影响也比较大。当有机相为正
壬烷或十二烷时，反应的转化率均达到最大，但有机
相为正壬烷时产物 ! & ! & 值最大。有机溶剂主要通
过以下途径影响酵母细胞催化反应的立体选择性：>
是对细胞内酶的变性或抑制作用，8 是通过改变细
胞内底物的浓度。本实验是两相反应，菌体与有机
相接触才能发生底物传递和反应，因此有机溶剂对
产物 ! & ! & 值的影响主要归因于其对细胞内酶的变
性或抑制作用。
2：乙酸乙酯；0：乙酸丁酯；*：氯仿；G：甲苯；)：环己烷；(：正己
烷；%：正庚烷；4：正辛烷；$：正壬烷；H：正十二烷
图 D 有机溶剂的疏水性对反应的影响
#$% &D ’(()*+ ,( 4IG1,<4,0$*$+I ,( ,1%23$* .,7J)3+. ,3 +4) 1)2*+$,3
8 &6 &8 两相比对反应的影响
从前面的研究可以知道，8-辛酮对细胞也有毒
害，随着底物浓度的增大，对反应速率影响不大，但
是会降低产物的 ! & ! & 值。另一方面，随着水与有机
8!!D 年 K 月 胡 健等：不对称还原 8-辛酮的菌株筛选和反应条件的研究 ·6D·
万方数据
溶剂相体积比的增大，细胞与有机溶剂接触的几率
减小，它们失活的可能性会降低。因此改变有机相
的体积，希望得到适合的两相比。从表 ! 可以看出，
随着有机相体积的增加，转化率发生下降，而 ! " ! "
值则上升。这是因为随着有机相体积的增大，底物
浓度同时降低，特别是在 "（水）# "（有机相）$ % # %
时，细胞与底物的接触几率变小，从而使转化率降
低。在底物浓度降低的同时，对脱氢酶的毒性降低，
! " ! " 值上升。综合考虑，"（水）# "（正辛烷）& % # ’
( % # )* 范围内比较好。
表 ! 水相与有机相体积比对反应的影响
+,-./ ! 011/23 41 54.67/ 8,394 41 ,:6/46; <=,;/ 34 48>,?92 <=,;/
4? 3=/ 8/,2394?
", @ "4（7A @ 7A） 转化率 @ B ! " ! " @ B
% @ ! ’C "C D% "*
% @ E ’’ "C D% "F
% @ % ’F "G D% "D
% @ ’ F’ "D DC "E
% @ )* FE "* DC "%
! "% 初始 酶都有其最适反应的 响也是不同的。在还原反应中有多种酶参与了反
应，应影响的变化图，由图 C 可知，在 转化率最高，但 脱氢酶比 $ 型的脱氢酶更能耐碱性环境，而在酸性
条件下，转化率下降，同时 ! " ! " 值在 最低，可能是 $ 型酶的最适反应 —!— ! % ! %（B）；—"—转化率（B）
图 C 缓冲液 I9> "C 011/23 41 ! 结论
从实验室保藏菌种中筛选得到一株酒明串珠菌
&!’()())*+ (!’, J0J+ GFE*，能不对称还原 !K辛酮得
到 #K!K辛醇，对其两相反应进行优化，选择了 +L0
缓冲液作为水相，壬烷作为有机相，并使其反应的底
物浓度从 )B提高到 EB，经过 G’ = 的反应，!K辛酮
的转化率大于 DDB，并保持 ! " ! " 值为 DFB。国外
报道，乳酸菌中的卡夫乳酸菌和短乳酸菌中存在针
对甲基酮立体选择性专一的 #K脱氢酶，实验发现酒
明串珠菌中也存在类似的脱氢酶。此外酒明串珠菌
具有很强的葡萄糖脱氢酶活力，能使辅酶迅速再生，
循环利用。该菌能耐较高的底物浓度，并且反应速
度很快，具有很好的工业化应用潜能。
参考文献：
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·GC· 生物加工过程 第 E 卷第 E 期
万方数据