全 文 ：肌苷发酵过程中后期的代谢流节点分析
徐咏全，马 雷，关章军，刘淑云，陈 宁!
（天津科技大学 食品科学与生物工程学院，天津 !""###）
摘 要：应用代谢流分析方法，实验测定副产物的积累速率，将数据输入计算机，应用 $%&’%(软件计算肌苷发酵 中后期代谢流分布。通过分析代谢网络中重要的节点，提出了优化肌苷生物合成途径的建议。 关键词：肌苷；代谢流；节点分析 中图分类号： )*!+ 文献标识码： % 文章编号：,+-#.!+-/（#""0）"#.""1+."0 !"#$%&’() *’+, -&."/ $-$’0/(/ &* (-&/(-" %(&/0-#1"/(/ .+2(-3
4(.5’$/# *"24"-#$#(&- 6"2(&.
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（E5HH;7; 5I J55K CL<;6L; :6K (<5;67<6;;M<67，&<:6A<6 367%/#2$)#：Q;TU;MR;P:S5HS<5OD6P@;O8"0 9&2./：<65O<6;；R;P:S5H代谢网络的化学计量分析法已经成为研究微生
物体内生物化学反应体系能力的一种重要手段，特
别是其在生物技术领域的应用［,，#］。该方法的重点
是代谢流分析（$J%），即代谢物质平衡法（$(）［!，0］。
代谢流分析方法是近年来代谢工程研究中用以指导
遗传操作和代谢过程控制的重要工作，是代谢网络
分析的基本方法。代谢流分析围绕胞内代谢反应，
使用物料衡算方法，对所有主要的胞内反应建立一
个基于化学计量的代谢流平衡模型，并利用该模型
计算不同途径的代谢流分布。代谢流分析的最大优
点是不需要知道代谢途径中各种酶的动力学特征就
可以得到关于微生物代谢的许多重要信息。通过分
析可以确定胞内途径的刚性节点及存在的不同分支
途径；计算胞内未知通量；验证其他代谢途径对代谢
网络通量分布的影响；计算最大理论转化率等。这
对于代谢工程的遗传改造工作和发酵控制具有很大
的指导意义。
肌苷是在食品和医药行业中广泛应用的一种产
品，它是食品增鲜剂.1’.肌苷酸的前体物，在医药领
域可用于治疗心血管疾病和肝脏疾病，并且是多种
抗病毒药物的前体物［1］。国内外对肌苷生产菌的选
育及发酵条件进行了深入研究，取得了一定成果［+］。
本文在已建立的肌苷生物合成的代谢流平衡模
型和计算出的肌苷分批发酵中后期的代谢流分布［-］
的基础上，对代谢网络中的重要节点进行了定量分
析和网络优化分析，以期对肌苷产生菌的发酵控制
! 收稿日期：#""0."#.#+
作者简介：徐咏全（,*-#.），女，天津市人，硕士研究生，研究方向为代谢控制发酵。
联系人：陈 宁，G.R:$:D #""0 ·1+· 生 物 加 工 过 程 E@<6;O; Z59M6:H 5I (<5UM5L;OO G67<6;;M<67 第 #卷第 #期 #""0年 1月 万方数据 优化和遗传操作提供指导。 ! 材料与方法 !"! 出发菌株 枯草芽孢杆菌（!"#$%%&’ ’&()$%$’）#$%&，天津科技
大学代谢控制发酵研究室保存菌株。
!"’ 培养基
!"’"! 种子培养基（( ) *）
葡萄糖 ’+，蛋白胨 !+，玉米浆 !+，酵母膏 !+，尿
素 ’，味精 ,，-./0 ,，12 3"+ 4 3"’，+"! 56.压力下灭
菌 !+ 789。
!"’"’ 发酵培养基（( ) *）
葡萄糖 !’+，豆饼水解液 ,+，酵母粉 !:，
（-2;）’<=; !,，5(<=;·32’= ;，>2’6=; ’，味精 !+，/.%
/0’ ’，12 3"+ 4 3"’，+"! 56.灭菌 !, 789。
!"& 发酵设备
, *自动控制发酵罐 上海高机实业总公司。
!"; 方法
!";"! 种子培养
菌种活化和种子培养方法见文献［3］。
!";"’ , *罐发酵
按 ,?接种量将种子液接入 , *自动控制发酵
罐（发酵液溶氧自动显示，温度和 12值自动控制）
中，装液量 & *，通风量 ! 4 !"& * ) 789，搅拌转速
:++ @ ) 789，培养温度 &’ A!&: A，通过自动流加浓
氨水溶液控制 12 :"; B +"+&。发酵过程泡沫较多
时，通过消泡泵手动或自动加入已灭菌的泡敌数滴
即可迅速消泡，发酵 :; C。
!", 分析方法
!","! 12：采用酸度计测定。
!","’ 菌体生长：吸取样品菌液 +", 7*，摇瓶发酵
液用蒸馏水稀释 ’+倍，, *发酵罐发酵液用蒸馏水
稀释 ,+倍，摇匀后测定 *:’+值。
!","& 葡萄糖：采用 析仪测定。
!","; 肌苷：采用离子交换法测定［F］。
!",", 发酵液中副产物含量测定：采用高效液相色
谱仪测定［3］。
" 结果与讨论
’"! 肌苷发酵中后期的代谢流分布
代谢流以拟稳态假设为基础：假设细胞内的中
间代谢物均处于拟稳态，即其浓度变化速率为 +。
采用 G.0089H的方法［F］，根据物料平衡计算代谢物的
积累速率，有
+$（I）J"",-,（I）% "". -.（I） （!） 式中，-,（I）：第 , 步反应的反应速率（77H0 ) *·C）；-. （I）：第 . 步反应的反应速率（77H0 ) *·C）；",：第 , 步 反应的反应计量系数；".：第 . 步反应的反应计量 系数；+$（I）：中间代谢物 $的积累速率（77H0 ) *·C）。 由拟稳态假定可得 +$（I）J +。代谢网络中的 /
个中间代谢物构成/ 个代谢流平衡方程式，可写成
如下矩阵形式：
*-（I）J + （’）
式中，*：/ K 0 维矩阵；-（I）：0 K !维矩阵；0：选定
的速率总数目。
这样由 / 个中间代谢物即可得到 / 个关于速
率的约束条件，待解问题的自由度为：1 J 02/，通过
实验测出 1 个不相关速率即可确定胞内整体流量
分布，从而对其生理行为进行定量的描述。肌苷产
生菌枯草芽孢杆菌（!"#%%&’ ’&()$%$’）#$%&代谢网络及 代谢流平衡模型的建立见文献［:］。根据副产物鸟 苷酸、次黄嘌呤、天冬氨酸、丙氨酸与乳酸，和产物肌 苷的积累速率和葡萄糖的消耗速率，应用 5E#*ED 软件可计算出发酵中后期代谢流分布如图 !所示。 在进行代谢流分析时，本文主要对发酵中后期 这段时间进行，主要原因是：其一，这个时期是肌苷 积累速率最大的时候；其二，这段时间接近细胞的平 衡生长阶段，关于细胞内代谢产物积累的拟稳态假 设更接近成立。 ’"’ 肌苷发酵中后期代谢节点分析 细胞本身不可能适合于任一特定代谢物的超量 生产。要使某种代谢物超量生产，就要求代谢中的 流量分配作出较大的改变，代谢工程的目的就是通 过改变代谢流的方向以提高产率。为此，必须仔细 分析代谢网络中的一些节点。 本文对发酵中后期肌苷合成载流途径的主要节 点 :%磷酸葡萄糖（L:6）、&%磷酸甘油酸（L/6）、肌苷 酸（M56）进行了代谢流分析（以流向节点的代谢流 作为 !++，其它的代谢流以此为基准得到相对值）。 各节点代谢流分布情况见图 ’、图 &和图 ;，其中不 带括号的数据为肌苷发酵实际代谢流分布的计算结 果，括号内的数据为理想代谢流分布的计算结果。 理想代谢流分布由 5E#*ED计算得出［:］。 ’++;年 ,月 徐咏全等：肌苷发酵过程中后期的代谢流节点分析 ·,3· 万方数据 图 ! 肌苷发酵中后期代谢流分布 "#$%! &’()*+,#- .,/0 1#2(3#*/(#+4 +. 56#4+2#4’ .’37’4()(#+4 1/3#4$(8’ 7#11,’ )41 ,)(’ 9’3#+1 :%:%! ;<=节点代谢流分析 ;<=节点代谢流分布如图 :所示。 图 : ;<=节点代谢流分布 "#$%: &’()*+,#- .,/0 1#2(3#*/(#+4 +. ;<= *3)4-8 9+#4(
从代谢流分布图中可以看出，葡萄糖主要经 >
条途径代谢：糖酵解途径（?&=）、单磷酸己糖途径
（@&=）和三羧酸循环（ABC）。由图 !和图 :可看出
在发酵后期葡萄糖转化成 <6磷酸葡萄糖（;<=）后，
在 <6磷酸葡萄糖的代谢节点处产生分支途径，一条
生成 <6磷酸果糖（"<=）进入 ?&=途径；另一条生成
D6磷酸核酮糖（ED=）进入 @&= 途径。进入 ?&= 途
径的代谢流为 DF%>>（以葡萄糖代谢流的总碳架为
!GG 计算得到），而进入 @&= 途径的代谢流为
HG%HG%> K G%例较大。进入 @&=途径的碳架又有 >D%I: 的代谢
流由 E#*D=进入 =E==而形成肌苷（ME），其余由 @&=
途径产生的磷酸戊糖全部转化成 ?&=途径的中间
产物进入糖酵解途径中，因此在这里 @&=途径的主
要作用是为肌苷的合成提供大量的前体物质 =E==，
并为产物合成提供大量的还原力 NCO=@。比较理
想代谢流分布我们可看出，理想的 @&=途径代谢流
应为 FF%FF，对应的 ?&=途径代谢流仅为 G%G!。因
此，实际的肌苷发酵过程中的 @&=途径代谢流远小
于理想值。?&=途径的代谢流强于 @&=途径造成
肌苷合成途径中前体物的减少，从而严重制约了肌
苷的大量生成。
从 ;<=到戊糖途径的调控酶是 <6磷酸葡萄糖
脱氢酶，该酶催化 ;<=脱氢生成 <6磷酸葡萄糖酸内
·DL· 生物加工过程 第 :卷第 :期
万方数据
酯的不可逆反应，受 !"#$%的反馈抑制。如能从基 因水平解除 !"#$%对该酶的反馈抑制，则该酶活性
可大大增强，使代谢流尽可能多的转入戊糖途径。
我们也可以利用基因手段扩增该酶的表达基因，增
强酶合成的能力，也可以达到同样的目的。
从 &’$生成 (’$的反应是同分异构化反应，被
磷酸葡萄糖异构酶所催化。适量降低该酶的活性也
可以减弱糖酵解途径的代谢，使 %)$途径代谢流得 到加强。 *+*+* &,$节点代谢流分析
&,$节点代谢流分布如图 -所示。 图 - &,$节点代谢流分布
(./+- )012345.6 7589 :.;1<.381.4= 47 &,$3<2=6> ?4.=1 糖酵解途径中的另一个重要节点是 -@磷酸甘 油酸（&,$），它由 -@磷酸甘油醛（&"$）生成，然后一 部分生成丝氨酸，另一部分继续 A)$途径生成丙酮
酸（$BC）。该节点在肌苷生物合成途径中占有重要 作用的原因是由于它生成的丝氨酸可进一步形成甘 氨酸（&DB），甘氨酸与$C $$生成 &"C，从而生成肌 苷。甘氨酸作为肌苷合成的前体物之一，应尽量增 加其生成量。从图 -可看出，在肌苷发酵中后期，从 &"$到 &,$的碳架有 E-+’F形成 GAC，另外的 *H+IF 的碳架形成 $BC进入三羧酸循环。比较理想状态 代谢流，从 &,$到 GAC的代谢流为 IJ+’K，大于实际 代谢流。而实际中丝氨酸又生成了少量（J+FJL）的 副产物半胱氨酸（,BG），这造成了甘氨酸合成量的 进一步减少，仅有 -I+J*L的碳架形成了甘氨酸。 因此要增加甘氨酸的生物合成必须增加丝氨酸 的合成量，即提高丝氨酸合成途径中的磷酸甘油酸 脱氢酶、磷酸丝氨酸转氨酶和磷酸丝氨酸磷酸酶的 活性。另外，如能从代谢控制方面减少半胱氨酸的 生成，使两者共同的前体物丝氨酸的代谢流尽可能 合成甘氨酸，同时与增强 $C$$ 合成的措施相结合，
应更有利于肌苷的生成。
另外，由 &,$生成的$BC进一步进入三羧酸循
环。三羧酸循环为细胞的生存和产物合成提供大量
能量，因此在理想代谢流中有很大比例的碳架流入
三羧酸循环。在发酵控制中应控制适当的高溶氧水
平，提供 M,"循环所需的氧气。而且由 M,"循环中
生成的天冬氨酸是形成 G"N,"C的前体物质，但同
时 G"N,"C生成 N)$的反应又提供了天冬氨酸的前 体物———延胡索酸。因此这几个代谢流中间产物处 于一个反应循环中，相互影响相互制约，同时影响肌 苷的合成，这与基因工程中必须同时改造多个关键 酶的表达基因才能大幅度提高代谢产物生成量的理 论是一致的。 *+*+- N)$节点代谢流分析
N)$节点代谢流分布如图 E所示。 图 E N)$节点代谢流分布
(./+E )012345.6 7589 :.;1<.381.4= 47 N)$3<2=6> ?4.=1 肌苷发酵法生产中最关键的问题是肌苷的直接 前体物———肌苷酸转化为肌苷的能力。因此肌苷酸 （N)$）成为肌苷生物合成途径中最重要的一个节
点。由于嘌呤核苷酸之间存在相互转变的代谢控制
机制，从 N)$到 ")$和 O)$形成两个循环相互转 变。本试验菌株为腺嘌呤缺陷型，因此生物代谢网 络中不考虑由 N)$到 ")$的分支途径。由图 E 可 看出，肌苷发酵中后期有 *K+H-的碳架形成肌苷，同 时有 J+’F的碳架形成 O)$，比理想代谢流的肌苷生
成量（IJ+’J）小很多。如用代谢控制手段选育出黄
嘌呤和腺嘌呤双重缺陷型的菌株，将使代谢流集中
流向肌苷的生成途径。另外，通过减少肌苷进一步
转化为次黄嘌呤的生成量，也可进一步提高肌苷的
产量。
综上所述，A)$途径、%)$途径和三羧酸循环
分别为肌苷的合成提供必须的前体物质，因此菌体
的代谢途径必须经过糖酵解、三羧酸循环与磷酸戊
糖途径。而这三种途径的代谢流的合理分配是最大
程度发挥菌体的肌苷合成能力的关键。而且减少副
产物的生成也是提高肌苷产量的重要因素。
（下转 J-页）
*HHE年 I月 徐咏全等：肌苷发酵过程中后期的代谢流节点分析 ·IF·
万方数据
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%&$R%& ,)%520)6 -20:$8$0;$ 20 #52;&$@5;)6 N0A50$$850A（第九届全国 生物化工学术会议论文集）［-］，>""" ? ［!W］=%$50@$%X 4，7$ -2I B，E9@$85;& =*$% )6*+&$B,E ’$IG$0;$ 2: %&$A$0$:28 %&$ ’$;8$%$( !"#$%%&’ ’&()$%$’ $0X9@$ 6$F)0’G;8)’$ )0( 5%’ A$D 0$%5; ;20%826 ’5%$’［C］* 426 Y$0 Y$0$%，!RSK，>""：>>" Z >>S ?
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（上接 KR页）
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