全 文 ：第７卷第４期
２００９年７月
生 物 加 工 过 程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．７Ｎｏ．４
Ｊｕｌｙ２００９
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１７６２－３６７８．２００９．０４．００６
收稿日期：２００８－１０－１０
基金项目：暨南大学自然科学基金资助项目（６４００７３）
作者简介：贾楠（１９８５—），女，山西平遥人，硕士研究生，研究方向：蛋白质工程；李任强（联系人），教授，Ｅｍａｉｌ：ｔｒｑｌｉ＠ｊｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
大肠杆菌半乳糖结合凝集素的提取纯化
贾 楠，殷海波，李琳子，李任强
（暨南大学 生物工程学系，广州 ５１０６３２）
摘 要：采用琼脂糖凝胶ＣＬ ６Ｂ（ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ６Ｂ）亲和层析以及ＳｅｐｈａｄｅｘＧ７５凝胶分子筛等对大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ，Ｅ．ｃｏｌｉ）半乳糖凝集素进行了纯化。结果显示，目标蛋白经简单的步骤即可以得到纯化，十二烷基硫酸
钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳＰＡＧＥ）及凝血实验证明纯化蛋白为 Ｅ．ｃｏｌｉ半乳糖凝集素，蛋白提取回收率为
１１４％。研究首次从Ｅ．ｃｏｌｉ蛋白提取液中分离得到纯的半乳糖凝集素，且此方法简单快捷，优越性明显。应用此
方法将有利于微生物半乳糖凝集素的深入研究。
关键词：Ｅ．ｃｏｌｉ；半乳糖结合；凝集素；分离
中图分类号：Ｑ５１３ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－３６７８（２００９）０４－００２８－０４
ＥｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｇａｌａｃｔｏｓｅｂｉｎｄｉｎｇｌｅｃｔｉｎｆｒｏｍＥ．ｃｏｌｉ
ＪＩＡＮａｎ，ＹＩＮＨａｉｂｏ，ＬＩＬｉｎｚｉ，ＬＩＲｅｎｑｉａｎｇ
（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＪｉｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０６３２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ６ＢａｆｉｎｉｔｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙａｎｄＳｅｐｈａｄｅｘＧ７５ｇｅｌｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏ
ｓｅｐａｒａｔｅｔｈｅｇａｌａｔｏｓｅｂｉｎｄｉｎｇｌｅｃｔｉｎｆｒｏｍＥ．ｃｏｌｉ．Ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅ
ｓｉｓａｎｄｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｏｂｔａｉｎｅｄｐｒｏｔｅｉｎｐｏｓｓｅｓｓｅｄｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｏｆｈｅ
ｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｔａｒｇｅｔｐｒｏｔｅｉｎｗａｓＥ．ｃｏｌｉｇａｌａｔｏｓｅｂｉｎｄｉｎｇｌｅｃｔｉｎ．Ｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｒａｔｅｗａｓ１１４％．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｅ．ｃｏｌｉ；ｇａｌａｔｏｓｅｂｉｎｄｉｎｇ；ｌｅｃｔｉｎｓ；ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ
凝集素存在于整个自然界中，是一类糖结合蛋
白，包括植物凝集素、动物凝集素和微生物凝集素
（ｍｉｃｒｏｂｉａｌｌｅｃｔｉｎｓ，ＭＬ）。１９０８年，Ｇｕｇｏｔ最先在大肠
杆菌中找到了能凝集血细胞的凝集素，迄今为止已
发现约２０８种 ＭＬ［１］。ＭＬ在生命活动中具有重要
的作用［２－３］。
目前的研究大多针对动物或植物中凝集素的
提取和纯化，而对微生物凝集素的提取方法很有
限，之前也并未有研究尝试提取 Ｅ．ｃｏｌｉ半乳糖结合
凝集素的报道。有学者利用 ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ ６Ｂ从
动、植物中成功分离到了半乳糖结合凝集素［４－５］。
ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ ６Ｂ本身是一种含有大量的 β
半乳糖苷键的惰性物质［６］，是由普通的分子筛填料
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ和二溴丙醇或环氧氯丙烷反应而成，
具有较强的物理和化学稳定性，可以承受较高的柱
压。因此本研究尝试采用ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ ６Ｂ亲和层
析来分离Ｅ．ｃｏｌｉ半乳糖结合凝集素。
１ 材料与方法
１．１ 试剂与仪器
ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ ６Ｂ填料Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司，低相对
分子质量蛋白质标记物 上海升正生物技术有限公
司。磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ，１０ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸盐，ｐＨ
６８）。其他试剂均为分析纯。
实验用兔子购自本校实验动物中心。取其新
鲜血液，离心得兔血红细胞。兔血红细胞经清洗、
抗凝等处理后保存于４℃冰箱，凝血实验前洗净，并
配成２％红细胞悬液。
层析柱管（２２ｃｍ×１５ｃｍ，内填ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ
６Ｂ填料；４０ｃｍ ×１５ｃｍ，内填 ＳｅｐｈａｄｅｘＧ ７５填
料）Ｍｉｌｉｐｏｒｅ公司，ＨＤ ２００１ Ｂ Ｃ型核酸蛋白检
测仪 上海嘉鹏科技有限公司，ＦＲ ９８０型生物电泳
图像分析系统 上海复日科技有限公司，真空冷冻干
燥器 Ｈｅｔｏ公司，低温高速离心机 ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｉｏｎ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，电泳系统由 ＰｏｗｅｒＰａｃＨＶ电泳仪和
ＭｉｎｉＰｒｏｔｅａｎ３电泳槽组成 ＢｉｏＲａｄ公司，显微镜及
数码相机Ｎｉｋｏｎ公司。
１．２ 方法
１．２．１ 大肠杆菌蛋白粗提液制备
大肠杆菌培养４Ｌ，４０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ收集
菌体，－２０℃冷冻３ｈ以上；加入少量 ＴｒｉｓＨＣｌ缓冲
液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ７５），低温下悬浮后，超声波破
碎菌体。８０００ｒ／ｍｉｎ离心 １５ｍｉｎ收集上清，加
（ＮＨ４）２ＳＯ４至其饱和度为 ６０％，静置２ｈ以上。
１００００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ收集沉淀，加少量 ＰＢＳ溶
解，并用ＰＢＳ透析，为层析上样液。
１．２．２ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ ６Ｂ亲和层析分离大肠杆菌
半乳糖结合凝集素
ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ ６Ｂ洗净，装柱。用ＰＢＳ平衡，流
速０５ｍＬ／ｍｉｎ。以同样流速上样，完毕后继续用
ＰＢＳ平衡，直至过柱液（穿透峰）的 ＯＤ２８０降至基线。
换用洗脱液（１０ｍｍｏｌ／ＬＰＢＳ，０２ｍｏｌ／Ｌ半乳糖，ｐＨ
６８）以同样流速洗脱，收集在 ＯＤ２８０具有峰值的洗
脱液，用去离子水透析后，真空冷冻干燥浓缩。
１．２．３ ＳｅｐｈａｄｅｘＧ ７５分子筛纯化目标蛋白
ＳｅｐｈａｄｅｘＧ ７５洗净，装柱。用ＰＢＳ平衡，流速
０２ｍＬ／ｍｉｎ。将已浓缩的试样上样，继续用 ＰＢＳ洗
脱，收集各洗脱峰。
１．２．４ ＳＤＳ ＰＡＧＥ检测
收集的洗脱蛋白和Ｇ ７５分离试样用去离子水
透析后，真空冷冻干燥。以牛血清白蛋白（ＢＳＡ）为对
照，检测２８０ｎｍ处吸光度，测定纯化目标蛋白的含量，
并与全蛋白含量相比，计算目标蛋白的提取回收率
（提取回收率＝目标蛋白的蛋白含量／全蛋白的蛋白
含量×１００％）。取０１ｍＬ的试样加入同样体积的质
量分数１％十二烷基硫酸钠 巯基乙醇蛋白溶解液做
成十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ
ＰＡＧＥ）试样。电泳所用的分离胶质量分数１３％，浓
缩胶质量分数为４％。电泳结束后，经染色、脱色后，
采用电泳分析系统获取图像进行分析。
１．２．５ 凝血实验
凝血实验参照 Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉ等［７］的方法操作。
观察所纯化的蛋白质是否能凝血并同时进行乳糖
抑制实验。具体操作方法见表１。
表１ 凝血实验的操作
Ｔａｂｌｅ１ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｆｏｒｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎａｓｓａｙ
试验组
缓冲液／μＬ
ＰＢＳ２５ 待测凝集素２５
生理
盐水 ２５
含０２ｍｏｌ／Ｌ
半乳糖ＰＢＳ２５
含０２ｍｏｌ／Ｌ
葡萄糖ＰＢＳ２５
２％红细胞
悬液５０
空白组 ＋ — ＋ — — ＋
测试组 ＋ ＋ — — — ＋
半乳糖抑制组 — ＋ — ＋ — ＋
葡萄糖抑制组 — ＋ — — ＋ ＋
注：“＋”为加入所示物质；“—”为不加所示物质。在加红细胞前２５℃放置２ｈ，在加红细胞后振荡数分钟，２５℃放置
２ｈ，观察凝集现象。
２ 结果与讨论
２．１ 亲和层析及ＳｅｐｈａｄｅｘＧ ７５分子筛层析
图 １为 ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ ６Ｂ亲和层析图谱。
Ｅ．ｃｏｌｉ粗提蛋白经过ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ ６Ｂ亲和层析，得
到２个完全独立的峰。峰 １为穿透峰，包含不被
ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ ６Ｂ吸附的蛋白质；峰２为洗脱峰，是
被ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ ６Ｂ吸附的蛋白质。峰２蛋白质再
９２ 第４期 贾 楠等：大肠杆菌半乳糖结合凝集素的提取纯化
经过ＳｅｐｈａｄｅｘＧ ７５分子筛，得到 ９个独立的峰
（图２），经电泳和凝血检测，证明峰６为纯的具有凝
血作用的目标蛋白，其提取回收率为１１４％。
图１ Ｅ．ｃｏｌｉ蛋白的ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ ６Ｂ亲和层析图谱
Ｆｉｇ．１ ＥｌｕｔｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅｏｆＥ．ｃｏｌｉｐｒｏｔｅｉｎｓｆｒｏｍＳｅｐｈａｒｏｓｅ
ＣＬ６Ｂｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
图２ 初步纯化蛋白Ｇ ７５分子筛分离图谱
Ｆｉｇ．２ ＥｌｕｔｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅｏｆＳｅｐｈａｄｅｘＧ７５ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
在进行ＳｅｐｈａｄｅｘＧ ７５分子筛层析时，是在洗
脱后段收集到纯的目标蛋白，而目标蛋白的相对分
子质量却在４５×１０４左右。多次重复实验也具有
类似的结果。鉴于 ＳｅｐｈａｄｅｘＧ ７５分子筛层析的
复杂性，即有时洗脱出峰顺序并不严格按相对分子
质量由大到小，目标蛋白可能与凝胶有一定的吸附
力，而导致了此现象的出现。
２．２ ＳＤＳ ＰＡＧＥ
将ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ ６Ｂ亲和层析所得的穿透峰和
洗脱峰以及 ＳｅｐｈａｄｅｘＧ ７５分子筛所得的各试样
经过透析、浓缩后进行电泳检测，结果如图３所示。
Ｅ．ｃｏｌｉ粗提蛋白液经过 ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ ６Ｂ分离后，
所获得的蛋白条带较多（泳道２），但经过 Ｇ ７５分
离后获得一条很纯的条带（泳道４），相对分子质量
（Ｍｒ）约为４５×１０４（为了保证所得蛋白的纯度，实
验中只收集了每个蛋白峰的中间部分）。
泳道１—图１中所示穿透峰；泳道２—图１中所示洗脱峰；
泳道３—图２中所示第１洗脱峰；泳道４—图２中所示第６洗脱峰
（ＳｅｈｐａｄｅｘＧ ７５分离所得的目标蛋白）；泳道５—标准蛋白
图３ 各蛋白试样的ＳＤＳＰＡＧＥ图谱
Ｆｉｇ．３ ＳＤＳＰＡＧＥｐａｔｅｒｎｓｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓａｍｐｌｅｓ
２．３ 凝血实验
将纯化所得的蛋白进行凝血实验。结果发现
所提取的纯蛋白（图２中峰６）能够凝集兔血红细
胞，见图４（ｂ）；加半乳糖后，凝集效果受到抑制，见
图４（ｃ）；加葡萄糖后，凝集效果没有受到明显抑制，
见图４（ｄ）；而空白组无细胞凝集现象，见图４（ａ）。
据此可基本确定所提取的目标蛋白为凝集素。
图４ ２５℃下孵育２ｈ后凝血实验的显微镜观察结果（１０×１０）
Ｆｉｇ．４ Ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｓ（１０×１０）ｏｆｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎａｓｓａｙａｆｔｅｒｉｎｃｕｂａｔｉｏｎａｔ２５℃ ｆｏｒ２ｈ
０３ 生 物 加 工 过 程 第７卷
ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ ６Ｂ的基质中具有数量十分巨大
的半乳糖苷，从而与β半乳糖苷结合凝集素特异性
结合。而根据半乳糖对此蛋白凝集作用的抑制作
用，以及葡萄糖对凝集效果没有明显抑制，也可确
定此凝集素为Ｅ．ｃｏｌｉ半乳糖结合凝集素。
２．４ 小 结
陈义烘等［５］在其论文中对分子筛填料 Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅＣＬ ６Ｂ作为稳定介质提取凝集素的优点已进
行了具体介绍，主要表现就是 ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ ６Ｂ具
有较高提取率、无需任何额外处理即可直接装柱使
用、且稳定耐用。本研究采用 ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ ６Ｂ亲
和层析从Ｅ．ｃｏｌｉ中分离半乳糖结合凝集素，所获得
的试样只需再经过 ＳｅｐｈａｄｅｘＧ ７５凝胶分子筛一
步分离，即可得到纯的目标蛋白。此方法经济、方
便和高效，同时也有很好的重现性。
对提取所得的大肠杆菌半乳糖结合凝集素，经
过凝血实验检测证实其可凝血，且半乳糖可以抑制
其凝血作用，这点与其他的半乳糖结合凝集素，如
半乳凝素及蓖麻凝集素等的凝血性质是相符的；但
其相对分子质量为４５×１０４左右，与已知的半乳凝
素相对分子质量（１４×１０４～３６×１０４）［８］及蓖麻凝
集素糖识别链（Ｂ链）相对分子质量（３２×１０４）［９］
并不相同。
由文献［１０］可知，动物半乳糖结合凝集素（半乳
凝素）具有保守的糖识别域，序列高度同源性，糖结合
三级结构相似。而豆科植物凝集素（半乳糖结合凝集
素）有同半乳凝素糖结合区极其相似的三级结构，但
无显著的同源序列。这说明半乳糖结合凝集素是一
类具有折叠结构蛋白质中的一个亚群。由此可以推
测，虽然大肠杆菌半乳糖结合凝集素识别半乳糖的序
列与动植物半乳糖结合凝集素并无相似性，但三者应
具有相似的半乳糖识别域的三维结构。
３ 结 论
本研究采用ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ ６Ｂ亲和层析与Ｓｅｐｈ
ａｄｅｘＧ ７５凝胶分子筛层析结合，从Ｅ．ｃｏｌｉ分离半乳
糖结合凝集素，并采用凝血实验及ＳＤＳ ＰＡＧＥ对提
取蛋白的性质进行验证。结果显示目标蛋白为大肠
杆菌半乳糖结合凝集素，蛋白提取回收率为１１４％。
此方法方便快捷，且可广泛应用于其他各种微生物中
半乳糖结合凝集素的提取纯化。本研究可为进一步
研究微生物凝集素提供重要的技术支持。
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ｔｉｏｎｏｆｇａｌｅｃｔｉｎｓ［Ｊ］．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，１９９４，３３：２０８０７２０８１０．
１３ 第４期 贾 楠等：大肠杆菌半乳糖结合凝集素的提取纯化