全 文 ：纳豆激酶的分离纯化研究
陆利霞，李 睿，熊 强，熊晓辉!
（南京工业大学 制药与生命科学学院，南京 !"###$）
摘 要：从实验室保存的一株高产纳豆激酶菌株出发，进行发酵产酶，确立具有纤溶活力的纳豆激酶的分离纯化工
艺，主要通过硫酸铵分级盐析法和 %&’()* +’,&-./0’疏水柱层析进行分离纯化，用纤维蛋白平板法测定酶活力，用
+1+2%345电泳验证为电泳纯，分子量为 !6 71。其有望开发为新型的口服溶栓药物。
关键词：纳豆激酶；分离纯化；纤溶活力
中图分类号：8$99:; <6"=:" 文献标识码：3 文章编号：">9! ? ;>96（!##=）#= ? ##>= ? #@
!"#$% &’ "() *#+,-,./",&’ &- ’/""&0,’/1) -+&2 "() 3,4#,$ -)+2)’"/",&’
AB AC2DC-，AE 8FC，GEHI4
561"+/."：I-RR/7C(-0’ T-0 - 7C(N /L LCU.C(/*)RCM ’(V)O’ ,./NFM’N U) !"#$%%&’ ’&()$%$’ (-RR/: S&’ ’(V)O’ T-0
0’,-.-R’N U) R&’ -OO/(CFO 0F*L-R’ L.-MRC/(-RC/( -(N ,F.CLC’N U) %&’()* +’,&-./0’: S&’ R’0R .’0F*R 0&/T’N R&’
,F.CLC’N ’(V)O’ T-0 - 0C(J*’ ,./R’C( U-(N C( R&’ +1+2%345 -(N W.:!6 71: ER C0 ’D,’MR’N R/ U’ - (’T R&./O2
U/*)RCM O’NCMC(’:
7)% 8&+$1：(-RR/7C(-0’；,F.CLCM-RC/(；LCU.C(/*)0C0
自从 "$69年日本须见洋行［"］从纳豆中提取出一
种具有溶血栓功能的物质，定名为纳豆激酶（I-RR/7C2
(-0’，以下简称 IX）以来，近十多年，国内外对 IX在
药理、酶学特性等方面都进行了研究。研究表明［!］，
IX具有纤溶活性，可治疗和预防血栓病，还可激活纤
溶酶原，从而增加酶源性纤溶酶的量与作用。目前常
用及有待开发的治疗血栓病的药品有［;］：链激酶
（+X）、尿激酶（BX）、重组组织纤溶酶原激活剂（R2%3）
和尿激酶原（,./2BX）等，但均在不同程度上存在一定
的缺陷，或者毒性强、副作用大，或者体内半衰期短，
或者来源紧缺、价格昂贵，而 IX有望弥补这些不足，
具有较大的开发潜能，成为新一代抗栓药物［=］。
本研究以实验室保存的一株高产纳豆激酶菌株
进行液体发酵产酶，确立纳豆激酶的分离纯化工艺，
并以 +1+2%345证明所得纳豆激酶为单一条带。该
纯化工艺为纳豆激酶的进一步工业化生产奠定基础。
9 材料与方法
":" 实验材料
":":" 菌种
纳豆枯草芽孢杆菌（!"#$%%&’ ’&()$%$’ (-RR/）本实
验室保存。
":":! 试剂与仪器
牛纤维蛋白原：中国药品生物制品检定所；凝血
酶：中国药品生物制品检定所；尿激酶：中国药品生
物制品检定所；考马斯亮蓝 42!@#：中国医药集团上
海化学试剂公司；%&’()*: +’,&-./0’ KA2=Y：德国
! 收稿日期：!##=2"#2!@
作者简介：陆利霞，女，河南人，博士，主要从事食品微生物、发酵工程等研究。
联系人：熊晓辉，#!@26;@69;=#，52O-C*：L’NZ(PFR: ’NF: M(
I/Q[ !##=
·>=·
生 物 加 工 过 程
K&C(’0’ \/F.(-* /L YC/,./M’00 5(JC(’’.C(J
第 !卷第 =期
!##=年 ""月
万方数据
!"#$%&’" ()*%)+#,+#% 公司；蛋白质快速纯化系统
!-.!：/$)"# 011 !"#$%&’" ()*%)+#,+#% 公司；2311 紫
外分光光度仪：上海天美科技有限公司；45563型温
压稳流电泳仪：北京市六一仪器厂。
078 实验方法
07870 发酵培养［3］
纳豆枯草芽孢杆菌经活化、种子培养、发酵培
养、离心取上清用于纳豆激酶的提取。
07878 硫酸铵分级盐析［9］
取上清液，缓慢加入硫酸铵至不同的饱和度，边
加边搅拌，混匀后于 : ;，放置 08 &，于 9 311 $ < "),，
离心 81 "), 后，分别收集上清和沉淀，将沉淀用磷
酸缓冲液溶解。分别检测上清液和沉淀溶解液的纳
豆激酶活力，分别计算上清和沉淀中所占总酶活力
的百分含量，并绘制盐析曲线。
0787= 疏水层析分离
/&#,>? @#A&’$*%# 疏 水 柱 分 离，上 样 采 用
073 "*? < B氯化钠的磷酸缓冲液溶液（AC D7:、1718
"*? < B），以氯化钠浓度为 17E，17=，171 "*? < B进行阶
段洗脱，于 821 ,"紫外波长下检测并收集吸收峰。
洗脱速度为 871 "B < "),。
0787: 蛋白质含量的测定
考马斯亮蓝法［D］。
07873 酶活力的测定
纤维蛋白平板法，依照 !%F$GA［2］等报道的琼脂
糖6纤维蛋白平板法，以测得纤维蛋白溶解圈面积来
表示 H-的活性。以尿激酶为标准，配制不同浓度
的溶液，取 01!B点样于纤维蛋白平板，=D ;恒温箱
中 02 &后，测定溶圈的两个垂直直径，以其乘积大
小反映溶纤活力的相对大小，绘制标准曲线。再以
该方法测定纳豆激酶的活力。
07879 @4@6/!IJ 电泳纯度分析及分子量测定［E］
分离胶体积分数 08K，浓缩胶体积分数 3K，胶
体积 01 +" L 01 +" L 171D +"。银染法显色蛋白条
带，比较各步分离效果。以分离纯化的样品进行电
泳，与 M’$N标准蛋白质分子量比较，测定纳豆激酶
的分子量。
! 结果与讨论
870 尿激酶活力标准曲线
纳豆激酶活力的测定是以其相对于尿激酶的单
位来表示的，建立尿激酶的活力单位与纤维蛋白平板
溶圈大小间的相关性。将尿激酶标准品用磷酸缓冲
液稀释至 9783、0873、8371、3171、01171、03171、81171、
=1171、91171 OP < "B浓度，分别取 01!B溶液点样于纤
维蛋白平板上（依次编号为 !至 O），结果如图 0。测
定溶圈直径，计算溶圈面积。从图 0可见酶浓度在小
于 81171 OP < "B（即 I点）的范围内，酶活力单位与溶
圈面积具有线性相关性，!8 Q 17EE: D。酶浓度高于
81171 OP < "B 时，溶圈面积未随之明显增大，!8 Q
17291 D，说明高浓度时二者间相关性差。检测纳豆激
酶活力时只能在小于 81171 OP < "B范围内。
图 0 尿激酶纤维平板活力测定
R)S70 4)%%*?T#U ’$#’ *V P-
878 硫酸铵分级盐析
分析图 8可知，随着硫酸铵饱和度的增加，上清
液中纳豆激酶量逐渐减少，沉淀中逐渐增加。纳豆
激酶在硫酸铵饱和度为 =1K时，沉淀中酶活单位很
少，而在饱和度大于 91K时，沉淀中酶活力单位增
加平缓。因而分离纯化纳豆激酶时，首先采用 =1K
饱和度硫酸铵沉淀除去杂蛋白，再用 91K饱和度硫
酸铵沉淀收集该酶。
图 8 纳豆激酶盐析曲线
R)S78 @’?F6*GF),S +G$T# *V ,’FF*N),’%#
811:年 00月 陆利霞等：纳豆激酶的分离纯化研究 ·93·
万方数据
!"# $%&’() *&+%,-./&疏水柱层析
疏水柱填料凝胶介质表面上的配基是具有一定
疏水作用的基团，用流动相洗脱时，基于样品分子与
介质疏水作用的差异，各组分在填料上吸附能力不
同而达到分离的效果。样品疏水柱层析洗脱分离吸
收峰如图 #所示。由图 #可见洗脱过程中共有 #个
紫外吸收峰，并以第 0吸收峰所含的蛋白量最高。
图 # 疏水层析洗脱峰
123"# $&,4/ .5 %(6-.+%.728 8%-.9,:.3-,9
对该 #个吸收峰进行纤维蛋白平板检测，结果
如图 ;所示。从图 ;可知收集洗脱峰 0的几支试管
（00 < 0;管）均可以明显检测到纳豆激酶活力，而其
余收集液中均未检测到酶活，故洗脱峰 0为纳豆激
酶所在部分。
!"; *=*>$?@A电泳纯度鉴定
纯化过程中，将每一步样品处理后，进行 *=*>
$?@A电泳，比较蛋白谱带的变化，结果如图 B（?）。
由图 B（?）可知，随着纯化步骤的进行，其中杂蛋白
逐步被去除，经 $%&’() *&+%,-./&疏水柱层析后得到
单一的纳豆激酶蛋白带，表明分离出的纳豆激酶纯
度已经达到电泳纯。将活性洗脱峰浓缩后，进行
*=*>$?@A电泳，结果见图 B（C）。与标准蛋白分子
量比较，所得纳豆激酶的分子量为 !DE=，与文献报
道的 FE分子量一致［0G］。
图 ; 不同洗脱收集管的纳豆激酶活测定
123"; FE ,8:2H2:( .5 6255&-&’: /,9+)&/
0、!：发酵液离心上清；#、;：#GI饱和度盐析后上清；
B：JGI饱和度盐析并透析后；J：疏水层析第 ;收集峰；
图 B 各样品以及标准蛋白质的 *=*>$?@A电泳图
123"B *=*>$?@A -&/K): .5 /&H&-,) /,9+)&/ ,’6 L,-4 /,9+)&
!"B 纯化方案的评价
在纯化的整个过程中，对每个步骤进行测定评
价，即对纯化过程中的每一步收集的酶液进行活力测
定。并计算比活力（活力单位数 M毫克蛋白）、纯化倍
数（每步比活 M粗酶液比活力）和收得率（每步的总活
力 M粗酶液总活力 N 0GGI）。各步纯化结果如表 0。
表 0 各步纯化效果比较
O,7)& 0 P.9+,-2’3 +K-2528,:2.’ &55&8: .5 6255&-&’: /&+,-,:2.’
总蛋白质含量 M 93 总酶活 M QR 比活力 M（QR M 93） 回收率 M I 纯化倍数
去细胞后的发酵液 DB"D; !S! SD!"GJ # 0SS"DG 0GG 0
#GI硫酸铵盐析 JG"B! !B# SDG"## ; 0T#"## T#"GG 0"#!
JGI硫酸铵盐析 #0"J0 !;B 0G0"G; S SB#"TG DT"DB !";;
$%&’() *&+%,-./& 层析 !"BB 0!G 0GG"GG ;S GTD"G; ;;"G# 0;"D!
通过两步硫酸铵盐析和 $%&’() *&+%,-./&疏水柱
层析后的样品经过 *=*>$?@A电泳纯度鉴定为单一
条带，酶收率 ;;"G#I，纯化倍数 0;"D!，比活力达到
;S GTD"G; QR M 93。
·JJ· 生物加工过程 第 !卷第 ;期
万方数据
! 结论
以所保存纳豆枯草芽孢杆菌发酵液为原料，经
离心去除菌体，再通过两步硫酸铵盐析和 !"#$%&
’#(")*+,#疏水柱层析后，得到电泳纯的纳豆激酶，比
活力达到 -. /012/- 34 5 67，酶回收率 --2/89，纯化
倍数 :-21;，纯化步骤简单。在纯化的过程中应该
进一步注意控制温度，缩短操作时间，从而防止酶的
活性损失，使其可以为大规模工业化生产 <=溶栓
药物提供理论依据。
参考文献：
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:;8@:?.2
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;//;，;8（:/）：
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
:8/@:8-2
（上接第 ?P页）
提残渣酶解液能用于微生物肥料菌株的培养（结果
另文发表）。
图 ? 烟草残渣的酶水解
AD72? T$R%6)EDK "%N*+&%,D, +L E+J)KK+ *#,DNB#
! 结 论
实验结果表明，以乙醇作为浸提剂，无毒，廉价，
提取量较高，易回收。适宜的浸提条件为：温度为
.1 U，浸提溶剂为乙醇，液固比为 ? V :，浸提时间
P2? "，浸提液中烟碱量 :028 67 5 6W。生产中建议采
用常规的浸提工艺与设备，可以考虑余热回收以降
低成本。如增加浸提次数，可提高烟碱的浸提量，但
过多的浸提次数将增加浸提操作成本。
致谢：在本实验过程中，虞光华副教授等给予了
热情的指导与帮助，合作卷烟厂提供了试验材料，在
此一并致谢。
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