全 文 ：第 35 卷第 18 期
2015年 9月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vol.35,No.18
Sep.,2015
http: / / www.ecologica.cn
基金项目:国家自然科学基金(30872024); 山东省科技发展计划(2010GNC10911)
收稿日期:2014鄄01鄄20; 摇 摇 网络出版日期:2014鄄11鄄19
*通讯作者 Corresponding author.E鄄mail: kxgao@ sdau.edu.cn
DOI: 10.5846 / stxb201401200153
丛国强, 尹成林, 何邦令, 李玲, 高克祥.水分胁迫下内生真菌球毛壳 ND35对冬小麦苗期生长和抗旱性的影响.生态学报,2015,35(18):6120鄄6128.
Cong G Q, Yin C L, He B L, Li L, Gao K X.Effect of the endophytic fungus Chaetomium globosum ND35 on the growth and resistance to drought of winter
wheat at the seedling stage under water stress.Acta Ecologica Sinica,2015,35(18):6120鄄6128.
水分胁迫下内生真菌球毛壳 ND35 对冬小麦苗期生长
和抗旱性的影响
丛国强, 尹成林, 何邦令, 李摇 玲, 高克祥*
山东农业大学植物保护学院, 山东省农业微生物重点实验室, 泰安摇 271000
摘要:为明确不同水分条件下内生真菌对冬小麦苗期生长和抗旱性的影响,以抗旱型小麦品种山农 16和水分敏感型小麦品种
山农 22为材料,利用荧光定量 PCR技术检测小麦干旱诱导基因脱水素 wzy2的表达量来了解冬小麦在干旱胁迫下相关基因的
表达差异,通过测定相关生理指标与酶活性来判断小麦发育及其在干旱胁迫下的生理响应状况。 结果表明,与正常水分 ND35
组相比,接种球毛壳菌(Chaetomium globosum)ND35的干旱处理组小麦的根冠比、总蛋白含量、脯氨酸含量及丙二醛含量等指标
显著提高,小麦叶片含水量和可溶性糖含量有所降低。 在干旱处理组中,球毛壳菌 ND35 可以显著提高小麦山农 16 的根长和
山农 22的株高,接种球毛壳 ND35的山农 16脯氨酸含量、可溶性糖含量、过氧化氢酶活性比对照组均显著提高,丙二醛含量比
对照组降低 9.0%,但差异不显著;山农 22脯氨酸含量和过氧化氢酶活性比对照组显著提高,丙二醛含量和可溶性糖含量比对
照组有所降低,但可溶性糖含量差异不显著;相对定量检测数据显示,接种球毛壳 ND35后,两种小麦脱水素 wzy2基因的表达量
较对照组均能够显著提高。 综合分析说明内生真菌球毛壳 ND35可以促进冬小麦苗期根系和植株发育,小麦提前进入三叶期,
增强小麦避旱性,同时提高小麦根系活力,增强小麦耐旱性;提高个体细胞内水分、糖分、脯氨酸含量,降低丙二醛的氧化性损
伤,增强过氧化氢酶活性,从而提高两种冬小麦对干旱胁迫的耐受能力;球毛壳 ND35促进小麦干旱诱导相关基因 wzy2 的表达
量,进而提高抗旱相关蛋白的表达,从而提高两种冬小麦耐脱水性和对干旱胁迫的适应性。
关键词:小麦; 苗期生长; 内生真菌; 球毛壳 ND35; 水分胁迫; 脱水素基因表达
Effect of the endophytic fungus Chaetomium globosum ND35 on the growth and
resistance to drought of winter wheat at the seedling stage under water stress
CONG Guoqiang, YIN Chenglin, HE Bangling, LI Ling, GAO Kexiang*
Shandong Key Laboratory for Agricultural Microbes, College of Plant Protection,Shandong Agricultural University, Tai忆an 271000, China
Abstract: Endophytes are microbes that live in plant tissues without substantively harming them selves.They are ubiquitous
in most plant species, latently residing in or actively colonizing the tissues.To clarify the effect of endophytic fungus on the
growth and resistance to drought of winter wheat at the seedling stage under different water conditions, two wheat varieties,
Shannong No. 16 and Shannong No. 22, were used as test materials. The dehydrin wzy2 belonging to the dehydration鄄
responsive encoding gene was detected to master different expression of winter鄄wheat鄄related genes under drought stress by
using a fluorescence quantitative PCR technique. The growth and development of plant and physiological responses under
drought stress were investigated by measuring the related physiological indicators and enzyme activity. The results showed
that, compared with ND35 groups treated with the normal water, Chaetomium globosum ND35 could significantly improve
root鄄shoot ratio, proline content, protein content, and malondialdehyde ( MDA) content of two wheat varieties in the
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drought group. The water content and soluble sugar content of leaves were reduced slightly in two wheat varieties. In the
drought treatment group, C. globosum ND35 could promote root growth of Shannong No. 16 and increase the plant height of
Shannong No. 22. The proline content, soluble sugar content, and catalase (CAT) activity of Shannong No. 16 treated with
C. globosum ND35 group were increased more than in the control group, while the MDA was reduced by 9.0%. Proline and
CAT activity increased and there was an indistinctive difference in soluble sugar content in Shannong No. 22, while the
MDA content was reduced. The relative quantitative expression of wzy2 gene was examined. The results showed that dehydrin
gene expression in the two wheat varieties inoculated with C. globosum ND35 was increased significantly, compared with
that of the control group. Above all, the endophytic fungus C. globosum ND35 could promote seedling root and plant growth,
the wheat could develop into three鄄leaf stage earlier, and resistance to dehydration was enhanced. In addition, wheat root
vigor was improved and resistance to drought was increased. The individual water content, sugar content, and proline
content in cells were increased, oxidative damage caused by malondialdehyde was reduced, and the activity of catalase was
enhanced, thus improving wheat tolerance to drought stress. The expression of related genes wzy2 in quantity was obviously
increased in wheat inoculated with C. globosum ND35, and then the expression of resistance to drought鄄related proteins was
improved. As a result, resistance and adaptability to drought stress were improved in winter wheat plants.
Key Words: wheat; seedling growth; endophytic fungus; Chaetomium globosum ND35; water stress; dehydrin
gene expression
由于淡水资源匮乏和地理分布不均,干旱条件成为植物最常见的逆境条件,也成为制约粮食产量的世界
性难题。 因此,减轻干旱胁迫对小麦生产的损失成为农业科学研究的热点。 科研工作者从内生真菌与植物、
土壤等生理生态现象的观察和描述,深入到内生真菌与植物、环境之间作用机理及其互作影响的研究,并取得
突破性进展。 例如,内生真菌拟茎点霉(Phomopsis orchidophila)能明显提高土壤中纤维素酶和木质素酶活性,
加快凋落物纤维素和木质素的降解,协同土壤中的土著微生物群落改善土壤环境,促进养分循环[1]。 内生真
菌对多年生黑麦草(Lolium perenne)、高羊茅(Festuca arundinacea)等禾草植物抗旱性影响的研究也表明[2鄄3],
内生真菌可以通过促进宿主植物根系发育、叶片生长、气孔开闭、渗透调节和抗氧化保护系统等一系列生理生
化反应诱导植物提高对干旱胁迫的抗性[4鄄6]。 但有关内生真菌与植物干旱诱导基因表达及其影响植物干旱
胁迫适应性的研究相对较少。
球毛壳菌(Chaetomium globosum)ND35 菌株作为一个分离于健康毛白杨(Populus tomentosa)的内生真菌
优势菌株。 已有报道证明,球毛壳菌 ND35菌株能够促进植株生长、提高防御酶活性[7鄄10]。 脱水素(Dehydrin)
是一种广泛存在于高等植物的干旱诱导蛋白。 已有研究表明,植物的抗旱与脱水素的表达量之间有一定的关
系[11],wzy2是从小麦中克隆出来的一种脱水素基因,并已成功构建和应用实时荧光定量 PCR方法。 而且,实
时荧光定量 PCR技术是一种特异性强、高敏感性的定量检测基因表达的有效方法,此方法在微生物的检测、
基因表达研究等方面具有重要的应用价值[12]。 本试验采用控制水分质量法模拟不同水分条件,接种内生真
菌球毛壳菌 ND35,通过测定不同水分条件下小麦植株的形态生理生化指标来明确小麦对干旱胁迫下的生理
响应,并在分子水平检测内生真菌影响小麦干旱诱导基因 wzy2 的表达差异。 综合探讨分析内生真菌球毛壳
菌 ND35对冬小麦植株生长及其对小麦干旱适应性的影响。 旨在探讨内生真菌对于促进禾谷类作物植株生
长,提高其干旱适应性的作用机制,同时为发掘有益生物资源和推进植物内生菌在宿主体外的应用提供理论
依据。
1摇 材料与方法
1.1摇 试验材料
试验于 2012年 10月—2013年 7月在山东省农业微生物重点实验室进行。 供试小麦品种为抗旱型的山
1216摇 18期 摇 摇 摇 丛国强摇 等:水分胁迫下内生真菌球毛壳 ND35对冬小麦苗期生长和抗旱性的影响 摇
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农 16 [13]和水分敏感型的山农 22,栽培基质为过 30 目筛的沙土。 栽培沙土 pH值 7.19,有机质 0.46 g / kg,全
氮含量 0.12 g / kg,全磷含量 0.15 g / kg,全钾含量 16 g / kg,速效氮 11 mg / kg,速效磷 24 mg / kg,速效钾为 46 mg /
kg。 种植盆规格 30 cm伊20 cm伊6 cm,每盆装灭菌的沙土 2.5 kg,干旱处理盆中营养液比重占土壤最大持水量
的 30%(栽培沙土总质量 2.66 kg),常规处理盆中营养液比重占土壤最大持水量的 60%(栽培沙土总质量2.84
kg),充分混匀准备进行小麦苗期培养。 营养液根据参考文献[14]改进了配方浓度(表 1)。
表 1摇 营养液配方浓度
Table 1摇 The concentration of nutrient solution formula
元素 Element N P K S Ca Fe B Mn Zn Cu Mo
浓度 Concentration / (mg / L) 578 39 733 48 120 3 0.5 0.5 0.05 0.02 0.01
供试真菌为球毛壳菌 ND35菌株,其孢子粉制备方法:将平板培养好已经产孢的球毛壳菌 ND35菌株配制
成浓度为 1.0伊106cfu / mL的孢子悬浮液,按 10 mL / kg 的剂量接种到事先灭菌熟化处理过的麦粒上,在 25 益
下培养 15—20 d,晾干后粉碎麦粒得到孢子粉。
采用血球计数板计数孢子含量。 取制备好的孢子粉 1.0 g,加入 100 mL 无菌水加以稀释,将盖玻片盖在
血球计数板计数室上面,用细口滴管吸取少量充分振荡混匀的菌液,加 1滴在盖玻片上,让菌液由盖玻片与计
数板的缝隙间渗入计数室,静置片刻,待孢子自然沉降并稳定后开始计数,每次计数做 3个重复,取平均值。
1.2摇 试验方案
将小麦种子在 20 益保湿催芽后,选择发芽势均匀一致的种子播种于沙土层下 1 cm。 在种子表面施加浓
度为 5500 cfu / g的孢子粉 0.3 g /粒种子。 株距伊行距 = 2 cm伊2 cm,共设 4 个处理:(1)干旱+CK;(2)干旱+
ND35;(3)正常+CK;(4)正常+ND35。 每个试验处理 150株,种植完逐个种植盆编号称重并记录。
水分管理:所有处理组按控制质量法进行管理,每天逐个称重干旱处理组和正常水分处理组中的花盆,加
水至与播种时记录的重量恒重,浇水时间在清晨和日落后 1 h 完成。 试验重复两次,第 1 次于 2012 年 10 月
17日播种,11月 22日采样;第 2次于 2013年 3月 7日播种,4月 12 日采样,室温培养 35 d,期间观察小麦生
长状况,保存样品进行后续试验检测,其中每个处理取 10株小麦液氮速冻,保存于-80 益冰箱备用。
1.3摇 测定项目及方法
1.3.1摇 小麦苗高、根长及相对含水量的测定
将各处理小麦地上部苗高(cm)和地下部根长(cm)分别编号测量记录,以 30 株为 1组称量鲜重(g)并编
号记录,将小麦植株在 105 益下杀青 1 h,然后在 70 益下烘干至恒重,称量每组小麦干重(g)、小麦地上部干
重(g)和根干重(g),计算小麦鲜重含水量(%)和根冠比。 计算公式如下:
根冠比=根干重(g) /地上部干重(g);鲜重含水量(%)= [(Wf -Wd) /Wf]伊100%
式中,Wf为鲜重(g);Wd为干重(g)。
1.3.2摇 小麦生理学特性指标的测定
以下生理学特性指标测定均参照王学奎《植物生理生化实验原理和技术》 [14]中的方法。
(1)小麦根系活力测定摇 采用 TTC法,取不同处理小麦根尖 0.3 g,放入 10 mL 烧杯中,加入 0.4%TTC 溶
液和磷酸缓冲液(1 / 15 mol / L,pH值 7)各 5 mL,37 益下暗保温 1 h,此后加入 1 mol / L硫酸 2 mL,终止反应。
将根取出,吸干水分,加入乙酸乙酯 4 mL,一起在研钵内磨碎以提取甲腙,最后加乙酸乙酯定容到 10 mL,于分
光光度计 485 nm波长下测定。
(2)游离脯氨酸含量的测定摇 采用酸性茚三酮法,取不同处理的新鲜小麦叶片 0.5 g 放入具塞试管,加
3%磺基水杨酸 5 mL,沸水浴中提取 10 min。 吸取滤液 2 mL加入 2 mL冰醋酸及 2 mL酸性茚三酮,沸水浴显
色 30 min。 冷却后用甲苯萃取,于分光光度计 520 nm波长下比色测定。
(3)小麦叶片总蛋白含量测定摇 采用考马斯亮蓝 G鄄250 法,取不同处理的新鲜小麦叶片 1.0 g放入研钵,
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加 2 mL蒸馏水研磨匀浆,再用 5 mL蒸馏水清洗,转移至离心管,25 益下放置 1 h,然后在 4000 r / min 离心 20
min,上清液转入 10 mL容量瓶定容。 吸取蛋白质提取液 0.1 mL,加入 5 mL考马斯亮蓝 G鄄 250 蛋白试剂,放
置 2 min后在 595 nm波长下比色测定。
(4)可溶性糖含量测定摇 采用苯酚法,取不同处理的小麦叶片 0.3 g 放入刻度试管,加入 5—10 mL 蒸馏
水,封口后置沸水浴 30 min(提取 2次),冷却后过滤并定容到 25 mL 容量瓶。 吸取待测液 0.5 mL 加 1.5 mL
蒸馏水,按顺序加 1 mL 9%苯酚溶液,摇匀后迅速加入 5 mL浓硫酸,混匀,在室温下放置 30 min,在 485 nm波
长下比色测定。
(5)丙二醛(MDA)含量测定摇 采用硫代巴比妥酸(Thiobarbituric acid, TBA)法,取不同处理的小麦叶片
0.5 g,加入 5%三氯乙酸(TCA)5 mL,研磨后所得匀浆在 3000 r / min 下离心 10 min。 取上清液 2 mL,加 2 mL
0.67% TBA,混合后在 100 益水浴锅上煮沸 30 min,冷却后离心,分别取上清液在 450 nm、532 nm和 600 nm处
测定吸光度。
(6)过氧化氢酶(CAT)活性测定摇 采用紫外吸收法,取不同处理的小麦叶片 0.5 g,加入 3 mL 4 益下预冷
的 pH值 7.8的磷酸缓冲液少量,研磨匀浆,转移至 25 mL容量瓶定容,混合均匀后将容量瓶置 5益冰箱中 10
min,取上部清液于 4000 r / min下离心 15 min,上清液即为过氧化氢粗提液。 取 0.2 mL粗酶液,加入 pH值 7.8
的磷酸缓冲液 1.5 mL和蒸馏水 1.0 mL,混合置于 25 益下预热,逐管加入 0.1 mol / L 的 H2O2 0.3 mL,立即计
时,并迅速倒入比色皿中,在 240 nm下测定吸光度,间隔 1 min中读数 1次,共测定 4 min,计算酶活性。
1.3.3摇 小麦脱水素基因 wzy2表达差异相对定量检测
(1)总 RNA的提取和反转录的合成
总 RNA提取按照 Trizol试剂(TransGen)说明书进行,从总 RNA 中进行逆转录获得 cDNA。 具体方法按
照 Fast Quant RT Kit (With gDNase) 进行:在经 DEPC处理过的 PCR管中加入总 RNA 1 滋g,5伊 g DNA buffer 2
滋L,10伊 Fast RT Buffer 2 滋L,RT Enzyme Mix 1滋L,FQ鄄RT Primer Mix 2 滋L,加入 DEPC处理的灭菌水至 20 滋L
体系,混合均匀后,置于 42 益反转录孵育反应 15 min,95 益孵育反应 3 min,以消除转录酶的活性,反转录后
的 cDNA贮存于-80益冰箱。
(2)小麦脱水素基因标准曲线和目的基因的定量
实时定量 PCR 采用 Tiangen 公司 SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)试剂盒。 25 滋L 反应体系包含
SuperReal PreMix Plus (2伊) 12.5 滋L,浓度为 10 mmol / L的上、下游引物各 0.75 滋L,cDNA 2 滋L,加灭菌 ddH2O
至 25 滋L。 反应于 Bio-Rad PCR仪(型号 i QTM5)上进行聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction, PCR)扩
增,每个样品做 3次平行反应,采用两步法 PCR扩增标准程序。 反应条件为 94 益预变性 30 s,94 益变性 5 s,
60 益退火延伸 30 s,循环 40次。 结束后进行 65—95 益融解曲线分析,荧光波长为 490 nm。
在样品定量 PCR扩增的同时,将 cDNA样品稀释至原浓度的 10-1、10-2、10-3、10-4及 10-5,形成 5 个浓度
梯度标准品。 采用同样的方法分别以这 5个不同的浓度标准品为模板进行定量 PCR扩增,制作标准曲线。
各 cDNA样品分别以目标基因 wzy2引物和内参基因 茁鄄actin 引物进行定量 PCR 扩增。 引物序列设计参
考文献[15],对退火温度做了调整,由 生工生物工程(上海)股份有限公司合成,如表 2所示。
表 2摇 脱水素基因 wzy2序列及内参基因肌动蛋白基因 茁鄄actin引物
Table 2摇 The primer sequences of wzy2 gene and 茁鄄actin gene
基因引物
Gene
序列(5忆寅3忆)
Primer sequence (5忆寅3忆)
退火温度
Temperature / 益
GC含量
GC / %
wzy2鄄F AGGAGGAAGAAGGGCATCAAG 62.0 52.4
wzy2鄄W GTCCGTAGGTGTTGTCAGTGGT 61.3 54.6
茁鄄actin鄄F TCCAATCTATGAGGGATACACGC 62.4 47.8
茁鄄actin鄄R TCTTCATTAGATTATCCGTGAGGTC 59.9 40.0
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摇 摇 (3)荧光定量 PCR数据分析方法
用相对定量方法分析 PCR扩增结果。 根据扩增曲线,在 Excel软件上进行相对定量研究和统计分析,确
定每个基因在反应管中荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数(Ct)。 以 茁鄄actin 为对照基因,校正 PCR模
板的拷贝数。 相对定量采用 2-驻驻Ct方法计算[16],即相对倍数( relative quantification) = 2-驻驻Ct sample。 具体计算
公式:
驻Ctsample =Ctsample- Ctactin
驻驻Ctsample = 处理组(驻Ctsample)-对照组(驻Ctsample)
式中,Ct为每个 PCR反应管中的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数;Ct sample为样品中 wzy2 基因的
荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数;Ct actin为样品中 茁鄄actin基因的荧光信号达到设定的阈值时所经
历的循环数。
1.4摇 数据处理
用 Excel 2010软件进行数据整理和作图,用 DPS数据分析软件进行统计分析,采用 LSD法进行差异显著
性检验(琢= 0.05)。
2摇 结果与分析
2.1摇 球毛壳菌 ND35对小麦苗期生长及相关指标的影响
与正常水分管理相比,水分胁迫处理使两种小麦苗期苗高、根长均减小,但根冠比明显提高,差异达到显
著水平。 干旱处理组中,接种球毛壳菌 ND35 的抗旱型小麦山农 16 的苗高、根长、根冠比及总蛋白含量分别
比对照组提高 4.0%、17.5%、7.7%和 16.0%,其中根长,根冠比及总蛋白量差异达到显著水平;干旱条件下,接
种球毛壳菌 ND35的水分敏感型小麦山农 22 的苗高、根长、总蛋白量差异均达到显著水平,分别比对照组提
高 15.2%、6.9%、43.2%(表 3),根冠比差异未达到显著水平。 说明在干旱胁迫条件下,接种球毛壳菌 ND35 能
够促进抗旱型小麦的根系发育,促进水分敏感型小麦的植株生长,均能增加两种小麦的植株蛋白质含量。 在
正常水分条件下,接种球毛壳菌 ND35也能够明显提高两种小麦的根系活力。
表 3摇 不同水分条件下,球毛壳菌 ND35对不同小麦品种苗高、根长、根冠比、根系活力和蛋白质含量的影响
Table 3摇 Effect of Chaetomium globosum ND35 on height, root length, root鄄shoot ratio, root activity and total protein of different wheat
varieties under different water conditions
处理
Treatments
苗高 / cm
Height
根长 / cm
Root length
根冠比
Root / Shoot
根系活力
Root activity /
(mg g-1 h-1)
总蛋白含量 / %
Total protein
干旱处理 山农 16 CK 15.67依0.35 d 23.90依1.46 d 0.26依0.04 b 93.49依7.62 a 0.38依0.03 d
Drought treatment Shannong No. 16 ND35 16.29依1.53 d 28.08依1.48 b 0.28依0.02 a 92.22依6.42 a 0.44依0.07 c
山农 22 CK 16.68依0.33 d 25.12依0.54 c 0.29依0.02 a 45.33依0.63 d 0.56依0.04 b
Shannong No. 22 ND35 19.21依0.63 c 26.85依1.43 b 0.32依0.03 a 42.44依2.84 d 0.80依0.09 a
正常水分 山农 16 CK 19.09依0.67 c 30.52依0.20 a 0.24依0.03 c 28.79依1.30 e 0.31依0.03 d
Normal water Shannong No. 16 ND35 25.39依1.41 b 31.12依0.41 a 0.21依0.01 d 63.05依3.24 b 0.40依0.05 c
山农 22 CK 21.18依0.89 ab 31.21依0.21 a 0.26依0.01 b 54.15依2.51 c 0.38依0.03 d
Shannong No. 22 ND35 25.57依0.70 a 32.21依2.05 a 0.24依0.01 c 67.34依0.54 b 0.43依0.06 c
摇 摇 同列不同小写字母表示 0.05 水平上差异显著
2.2摇 球毛壳菌 ND35对小麦抗旱相关生理指标的影响
与正常水分管理相比,干旱条件下的小麦叶片中脯氨酸和丙二醛含量明显增多,差异达到极显著性水平
(P<0.01),而可溶性糖和叶片含水量明显降低。 在干旱处理组中,球毛壳菌 ND35 处理的两种小麦脯氨酸含
量和叶片含水量与对照组相比均达到差异显著水平(P<0.05),而山农 16 丙二醛含量与对照相比差异不显
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著。 接种球毛壳菌 ND35的山农 16的脯氨酸含量、叶片含水量和过氧化氢酶活性分别比对照组提高 40.7%、
2.7%和 124.47%,山农 22分别提高 46.4%、2.7%和 23.02%,而山农 16 的叶片丙二醛含量相对于对照组降低
9.0%,山农 22的叶片丙二醛含量降低 43.0%。 而在正常水分条件下,两种小麦叶片的脯氨酸含量、丙二醛含
量及叶片含水量分别与对照组相比差异不显著(表 4)。 以上结果表明,干旱胁迫条件下,接种球毛壳菌 ND35
的小麦渗透势比对照组有所提高,叶片含水量相对增加,丙二醛含量降低则说明接种 ND35 的两种小麦对干
旱逆境的过氧化伤害程度降低。
表 4摇 不同水分条件下,球毛壳 ND35对不同小麦品种可溶性糖、脯氨酸、丙二醛、叶片含水量和过氧化氢酶活性的影响
Table 4摇 Effect of C. globosum ND35 on soluble sugar, proline, MDA, water content and CAT activity of leaves of different wheat varieties
under different water conditions
处理
Treatments
可溶性糖 / %
Soluble sugar
脯氨酸
Proline /
(滋g / g鲜重)
丙二醛
Malondialdehyde /
(滋mol / g)
叶片含水量 / %
Water Content
CAT
Catalase activity /
(U g-1 min-1)
干旱处理 山农 16 CK 0.64依0.04 d 145.60依1.24 c 0.0368依0.0033 c 77.69依0.90 e 142.65依6.92 c
Drought treatment Shannong No.16 ND35 0.68依0.01 d 204.81依5.09 a 0.0335依0.0028 c 79.80依2.37 d 320.20依16.47a
山农 22 CK 0.87依0.07 c 128.02依3.31 d 0.0741依0.0036 a 83.81依0.44 c 145.50依12.33c
Shannong No.22 ND35 0.85依0.04 c 187.44依9.43 b 0.0422依0.0033 b 86.05依1.25 b 179.00依42.38c
正常水分 山农 16 CK 0.91依0.02 c 74.84依4.04 e 0.0117依0.0006 d 87.25依0.40 b 79.90依5.96 e
Normal water Shannong No.16 ND35 1.40依0.07 a 78.58依3.34 e 0.0116依0.0005 d 87.78依0.97 b 145.10依6.75 c
山农 22 CK 1.04依0.01 b 60.41依5.63 f 0.0094依0.0004 d 90.62依0.11 a 123.70依9.16 d
Shannong No.22 ND35 1.35依0.01 a 65.76依3.34 f 0.0120依0.0005 d 91.28依0.17 a 200.15依26.23 b
摇 摇 同列不同小写字母表示 0.05 水平上差异显著
2.3摇 wzy2基因表达差异相对定量分析
图 1摇 脱水素基因 wzy2的定量 PCR扩增标准曲线
Fig.1摇 The standard curve of wzy2 quantitative PCR
图 2摇 脱水素基因 wzy2的目的片段融解曲线的单峰图
Fig.2摇 The single peak melting curve graph of the wzy2
2.3.1摇 wzy2标准曲线的建立
如图 1所示,试验建立的目的基因 wzy2 的标准曲
线是 cDNA浓度梯度的 lg 值对 Ct 值作图,其相关系数
为 0. 996,接近于 1,相关性很好,基本符合相对定量
2-驻驻Ct对样品的要求。
2.3.2摇 引物特异性检验及扩增曲线
从图 2、图 3可以看出,定量 PCR 鉴定的目的基因
扩增条件、引物设计均符合要求,PCR 的产物特异性
强,无非特异性片段产生。
2.3.3摇 干旱条件下,球毛壳菌 ND35 对苗期不同敏感型
小麦脱水素表达量的影响
按照相对定量 2-驻驻Ct方法对山农 16,山农 22 小麦
脱水素基因 PCR结果转化成表达量,为了直观,将测定
的数据制作成柱状图,结果如图 4所示。
从图 4 RT鄄PCR结果可以看出,30%土壤相对含水
量条件下,ND35处理均能提高两种小麦的脱水素基因
wzy2表达量,其中山农 16 抗旱型小麦脱水基因的表达
量是对照组的 2.21倍,山农 22 敏感型小麦的表达量是
对照组 2. 53 倍。 说明,干旱胁迫条件下,球毛壳菌
ND35可以明显提高小麦脱水素 wzy2基因的表达量,而
且对不同敏感型小麦的作用效果存在差异。
5216摇 18期 摇 摇 摇 丛国强摇 等:水分胁迫下内生真菌球毛壳 ND35对冬小麦苗期生长和抗旱性的影响 摇
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图 3摇 脱水素基因 wzy2的目的片段荧光定量 PCR扩增曲线图
摇 Fig. 3 摇 The fluorescence quantitative PCR curve of the
amplification fragment of wzy2
3摇 讨论
3.1摇 球毛壳菌 ND35 促进小麦根系和植株生长及其对
抗旱性的影响
根系作为水分吸收的主要器官,与植物抗旱性的形
成具有密切关系。 因此,植物的根系生长状况是衡量其
抗旱性的重要指标,影响其对土壤水分的吸收和利
用[17]。 多数研究认为,发达的根系可提高植物吸水效
率,增强其抗旱性能,如抗旱性大豆具有较大的根
系[18]。 Redman等人研究表明,内生菌的定殖促进了水
摇 图 4摇 球毛壳 ND35 对不同小麦品种脱水素基因 wzy2 表达量的
影响
Fig. 4 摇 Effects of Chaetomium globosum ND35 on expression of
wzy2 in different wheat varieties
稻的根部生长和发育,影响了植物体内营养在根和芽中
的分配,内生菌共生的植物优先将营养分配给根部,而
根部的发育则有利于植物对氮素的吸收和利用[19]。 此
外,叶片相对含水量作为植物抗旱性的关键指标,能够
准确说明植株的干旱适应性。 过去的研究证明,球毛壳
菌 ND35对杨树、黄瓜和板栗根系的发育具有明显促进
作用[20鄄21]。 本试验结果显示,山农 16 小麦 ND35 处理
组根系的平均长度、根冠比和植株总蛋白含量相对于对
照组更高,山农 22 小麦 ND35 处理组平均苗高大于对
照组,植株含水量也大于对照组;正常水分条件下,两种
小麦的苗高、根长和根系活力比对照组均显著提高,这
些数据表明球毛壳菌 ND35 处理的不同水分敏感型小
麦的植株生长和个体对干旱的适应性均强于对照组。
此外,球毛壳菌 ND35处理的小麦生长效率普遍提高,提前进入三叶期。 因此,球毛壳菌 ND35 促进两种小麦
品种根系发育所引起的小麦对水分和养分吸收利用能力的提高,以及个体生长期的提前所引起的小麦避旱能
力的提高可能是影响小麦抗旱性的重要原因。
3.2摇 球毛壳菌 ND35对增强小麦抗旱性的影响
干旱条件发生时,土壤水势的降低会迫使植物失水,从而对小麦造成直接或间接伤害。 小麦在根部积累
渗透胁迫物质可以降低植物细胞水势,达到减少植株失水的目的。 比较普遍的调节物质是脯氨酸、可溶性糖、
脱落酸及生长调节酶的活性,这些生理指标在植物抵御干旱胁迫、盐害等非生物胁迫方面发挥着重要作
用[22]。 万里强等研究,抗旱性强的黑麦品种叶片的脯氨酸含量显著增加[23]。 一些研究还表明,干旱胁迫条
件下,菌根植物具有较高的脯氨酸积累[24]。 本试验中,干旱胁迫下的两种小麦叶片脯氨酸含量明显高于正常
水分组。 一方面,不同小麦品种间脯氨酸含量的变化和品种本身的遗传有关,从而表现出合成脯氨酸的潜力
有所不同[25]。 另一方面,在不同的遗传条件下,接种球毛壳菌 ND35 均可以提高小麦的脯氨酸含量。 说明在
干旱条件下,球毛壳菌 ND35可以促进小麦脯氨酸积累,在维持细胞渗透势方面起到积极作用。 另外,处理组
中的叶片可溶性糖含量及过氧化氢酶活性比对照组均有不同程度的提高。 叶片中的可溶性糖能够增强细胞
内渗透压,对植株抗旱,抗盐发挥不可替代的作用。 过氧化氢酶可以分解过氧化氢,最大限度地减少羟自由基
的形成。 MDA是细胞膜过氧化的主要产物之一,对膜和细胞中的许多生物功能分子如蛋白质、核酸和酶等均
有很强的破坏作用,其含量多少可作为细胞膜过氧化程度的指标之一[26],而本试验中球毛壳菌 ND35 处理组
MDA含量比对照组均有不同程度的降低。 以上生理指标表明,在干旱胁迫条件下,处理组小麦的抗旱性比对
照组均有不同程度的增强,反映出较高水平的抗旱适应性。
6216 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 35卷摇
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3.3摇 球毛壳菌 ND35提高小麦 wzy2基因表达对耐旱性的影响
小麦在生长发育进程中,干旱胁迫能诱导许多基因的表达,来缓解由于干旱所造成小麦机体损伤。 这种
由于调控因子引起的分子效应可能是植物耐旱机制的关键。 随着基因组学、蛋白质组学和微生物分子生物学
技术的日趋成熟,关于内生菌提高植物抗性基因表达的报道陆续发布。 Sherameti 等研究发现,在干旱胁迫
下,接种印度梨形孢(Piriformospora indica)的拟南芥植株 RD29A、ERA1、DREB2A、CBL1 等抗逆性相关基因的
表达都有不同程度的上调,而在未接菌的植株中的表达相对滞后[27];Sun 等人的研究表明内生菌在甘蓝体内
定殖后,会促进甘蓝叶片中抗旱相关基因的表达,并提高抗旱相关蛋白的表达,从而赋予甘蓝更强的抗旱能
力[28];Ownley 等人发现内生菌的侵染能增强植物抗病基因的表达[29]。 因此,研究相关干旱诱导基因在胁迫
条件下其 mRNA水平的表达,很大程度上为揭示作物的抗旱机制提供了不可缺少的信息。 现有的研究认为
脱水素是一种常见的干旱诱导基因,与植物耐脱水性密切相关。 一方面,脱水素在植物受到干旱失水时,能够
部分代替水分子,保持细胞液处于溶解状态,从而稳定细胞的结构[30];另一方面,脱水素还起到分子伴侣和亲
水性溶质作用,在水分胁迫条件下可以稳定蛋白质的结构并保持其功能,所以脱水素基因在干旱胁迫植株中
大量表达[31]。 本试验结果表明,在干旱胁迫条件下,接种球毛壳菌 ND35的两种小麦品种的 wzy2基因的表达
量较对照组均显著提高。 由此说明球毛壳菌 ND35 可能通过上调干旱诱导基因 wzy2 的表达量,提高小麦耐
脱水性来适应个体对干旱胁迫响应,从而提高小麦的耐旱能力,这也为球毛壳菌 ND35 提高小麦干旱适应性
提供了依据。
综上所述,本试验说明接种球毛壳菌 ND35 能够促进两种不同水分敏感型小麦的根系和植株发育,协调
个体细胞内物质来提高小麦的耐旱和避旱能力,上调干旱诱导基因表达,从而提高个体对干旱胁迫的适应性。
具体从 3个方面得到验证:(1)球毛壳菌 ND35促进小麦根系和植株生长,小麦生长效率提高,提前进入三叶
期,增强小麦避旱性,同时提高小麦根系活力,增强小麦耐旱性;(2)球毛壳菌 ND35 提高小麦细胞内水分,糖
分,脯氨酸含量,降低丙二醛造成的细胞膜氧化伤害,增强过氧化氢酶活性,这些对维持和提高小麦正常渗透
势,增强小麦耐旱性起到关键作用。 (3)通过荧光定量手段检测发现,球毛壳菌 ND35会促进小麦脱水素基因
wzy2的表达,进而提高抗旱相关蛋白的表达,使小麦获得更强的耐脱水性和抗旱能力。 另外,根系作为首先
感应水分胁迫的器官,球毛壳菌 ND35是否增加根系细胞对干旱胁迫的感应能力,是否增加植物对干旱胁迫
信号的传导以及是否对更多品种小麦的抗旱性产生同样的效果,有待深入研究。
参考文献(References):
[ 1 ]摇 Chen Y, Xie X G, Ren C G, Dai C C. Degradation of N鄄heterocyclic indole by a novel endophytic fungus Phomopsis liquidambari. Bioresource
Technology, 2013, 129: 568鄄574.
[ 2 ] 摇 Hesse U, Sch觟berlein W, Wittenmayer L, F觟rster K, Warnstorff K, Diepenbrock W, Merbach W. Effects of Neotyphodium endophytes on growth,
reproduction and drought鄄stress tolerance of three Lolium perenne L. genotypes. Grass and Forage Science, 2003, 58(4): 407鄄415.
[ 3 ] 摇 Elmi A A, West C P, Robbins R T, Kirkpatrick T L. Endophyte effects on reproduction of a root鄄knot nematode (Meloidogyne marylandi) and
osmotic adjustment in tall fescue. Grass and Forage Science, 2000, 55(2): 166鄄172.
[ 4 ] 摇 李飞, 李春杰. 内生真菌对禾草类植物抗旱性的影响. 草业科学, 2006, 23(3): 57鄄62.
[ 5 ] 摇 石晶盈, 陈维信, 刘爱媛. 植物内生菌及其防治植物病害的研究进展. 生态学报, 2006, 26(7): 2395鄄2401.
[ 6 ] 摇 Swarthout D, Harper E, Judd S, Gonthier D, Shyne R, Stowe T, Bultman T. Measures of leaf鄄level water鄄use efficiency in drought stressed
endophyte infected and non鄄infected tall fescue grasses. Environmental and Experimental Botany, 2009, 66(1): 88鄄93.
[ 7 ] 摇 米士伟, 戴杨, 刘晓光, 孟庆果, 高克祥, Mendgen K. 球毛壳 ND35 菌株在宿主植物上的侵染定殖. 植物保护学报, 2011, 38(6):
493鄄498.
[ 8 ] 摇 印敬明, 刘晓光, 万慧, 肖守华, 高克祥, 王庆华. 螺旋毛壳(Chaetomium spirale)ND35 防病促生作用初探. 莱阳农学院学报: 自然科学
版, 2006, 23(4): 272鄄275.
[ 9 ] 摇 孟庆果, 刘晓光, 高克祥, 康振生, 王海清. 球毛壳 ND35 在杨树的定植及对酶活性的影响. 植物保护学报, 2009, 36(1): 91鄄92.
[10] 摇 米士伟. 球毛壳 ND35在宿主植物上的侵染定殖及其菌肥研制初探. [D]. 泰安: 山东农业大学, 2012
[11]摇 张薇, 胡尚连. 小麦高分子量谷蛋白 12亚基基因 mRNA的定量分析. 种子, 2006, 25(5): 35鄄37, 40鄄40.
7216摇 18期 摇 摇 摇 丛国强摇 等:水分胁迫下内生真菌球毛壳 ND35对冬小麦苗期生长和抗旱性的影响 摇
http: / / www.ecologica.cn
[12]摇 Roche J, Hewezi T, Bouniols A, Gentzbittel L. Real鄄time PCR monitoring of signal transduction related genes involved in water stress tolerance
mechanism of sunflower. Plant Physiology and Biochemistry, 2009, 47(2): 139鄄145.
[13] 摇 刘鹏, 张洪勇, 陈雪燕, 孙敬福, 裴艳婷, 李惠荣, 杨秀凤, 王玮. 抗旱高产小麦新品种—山农 16. 麦类作物学报, 2011, 31( 2):
388鄄388.
[14] 摇 王学奎. 植物生理生化实验原理和技术 (第二版) . 北京: 高等教育出版社, 2006: 118鄄281.
[15] 摇 赵鑫, 张林生. 小麦脱水素基因 wzy2表达量实时荧光定量 PCR方法的建立和应用. 西北植物学报, 2011, 31(5): 1045鄄1049.
[16] 摇 Shi J F, Mao X G, Jing R L, Pang X B, Wang Y G, Chang X P. Gene expression profiles of response to water stress at the jointing stage in wheat.
Agricultural Sciences in China, 2010, 9(3): 325鄄330.
[17] 摇 丁红, 张智猛, 戴良香, 康涛, 慈敦伟, 宋文武. 干旱胁迫对花生根系生长发育和生理特性的影响. 应用生态学报, 2013, 24(6):
1586鄄1592.
[18] 摇 杨秀红, 吴宗璞, 张国栋. 对肥水条件反应不同的大豆品种根系性状的比较研究. 中国油料作物学报, 2001, 23(3): 23鄄25.
[19] 摇 Redman R S, Kim Y O, Woodward C J D A, Greer C, Espino L, Doty S L, Rodriguez R J. Increased fitness of rice plants to abiotic stress via
habitat adapted symbiosis: a strategy for mitigating impacts of climate change. PLoS One, 2011, 6(7): e14823.
[20] 摇 Yu X Y, Meng Q G, Ren S D, Liu Z Y, Wang M Y, Gao K X. Effect of Chaetomium globosum ND35 on plant growth and preliminary study of its
biocontrol efficacy. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2009, 37(34): 16900鄄16902.
[21] 摇 孟庆果. 内生菌球毛壳 ND35在寄主植物中的侵染过程及其定殖后对植物的影响与分子检测 [D]. 泰安: 山东农业大学, 2009.
[22] 摇 Armengaud P, Thiery L, Buhot N, March G G, Savour佴 A. Transcriptional regulation of proline biosynthesis in Medicago truncatula reveals
developmental and environmental specific features. Physiologia Plantarum, 2004, 120(3): 442鄄450.
[23] 摇 万里强, 李向林, 石永红, 何峰, 贾亚雄. PEG胁迫下 4个黑麦草品种生理生化指标响应与比较研究. 草业学报, 2010, 19(1): 83鄄88.
[24] 摇 Ruiz鄄Lozano J M, Azcon R, Gomez M. Effects of arbuscular鄄mycorrhizal Glomus species on drought tolerance: physiological and nutritional plant
responses. Applied and Environmental Microbiology, 1995, 61(2): 456鄄460.
[25] 摇 张述义, 邵嘉鸣, 李新凤, 刘玲玲, 刘慧. 水分胁迫对小麦芽和根中脯氨酸含量及电导率的影响. 干旱地区农业研究, 2013, 31(3):
150鄄154.
[26] 摇 赵宏伟, 李秋祝, 魏永霞. 不同生育时期干旱对大豆主要生理参数及产量的影响. 大豆科学, 2006, 25(3): 329鄄332.
[27] 摇 Sherameti I, Tripathi S, Varma A, Oelm俟ller R. The root鄄colonizing endophyte Pirifomospora indica confers drought tolerance in Arabidopsis by
stimulating the expression of drought stress鄄related genes in leaves. Molecular Plant鄄Microbe Interactions, 2008, 21(6): 799鄄807.
[28] 摇 Sun C, Johnson J M, Cai D G, Sherameti I, Oelm俟ller R, Lou B G. Piriformospora indica confers drought tolerance in Chinese cabbage leaves by
stimulating antioxidant enzymes, the expression of drought鄄related genes and the plastid鄄localized CAS protein. Journal of Plant Physiology, 2010,
167(12): 1009鄄1017.
[29] 摇 Ownley B H, Gwinn K D, Vega F E. Endophytic fungal entomopathogens with activity against plant pathogens: ecology and evolution. BioControl,
2010, 55(1): 113鄄128.
[30] 摇 王君丹, 胡鸢雷,魏晓, 于鹏之, 车代弟, 林忠平. 脱水素基因转化的矮牵牛对干旱胁迫的反应. 分子植物育种, 2004, 2(3): 369鄄374.
[31] 摇 Dhanaraj A L, Slovin J P, Rowland L J. Isolation of a cDNA clone and characterization of expression of the highly abundant, cold acclimation鄄
associated 14 kDa dehydrin of blueberry. Plant Science, 2005, 168(4): 949鄄957.
8216 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 35卷摇