全 文 ：第 34 卷第 20 期
2014年 10月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vol.34,No.20
Oct.,2014
http: / / www.ecologica.cn
基金项目:国家自然科学基金项目 ( 41276113, 41276114, 41006069); 国家高技术研究发展计划项目 ( 2012AA092104, 2013AA092901,
2013AA092902); 中国科学院战略性先导科技专项 A (XDA11020202); 三亚市院地科技合作项目(2013YD74); 国家海洋局近岸海域生态环境
重点实验室开放基金(201304)
收稿日期:2013鄄01鄄25; 摇 摇 网络出版日期:2014鄄03鄄11
*通讯作者 Corresponding author.E鄄mail: dongjunde@ vip.163.com
DOI: 10.5846 / stxb201301250159
黄小芳, 陈蕾, 张燕英, 凌娟, 龙丽娟,张偲,董俊德.基于 RFLP 技术的鹿角杯形珊瑚共附生固氮菌多样性分析.生态学报,2014,34(20):
5875鄄5886.
Huang X F, Chen L, Zhang Y Y, Ling J, Long L J,Zhang S,Dong J D.Diversity of nitrogen鄄fixing bacteria associated with the coral Pocillopora damicornis
analyzed by PCR鄄RFLP.Acta Ecologica Sinica,2014,34(20):5875鄄5886.
基于 RFLP技术的鹿角杯形珊瑚
共附生固氮菌多样性分析
黄小芳1,2,3, 陈摇 蕾1,2,3, 张燕英1,2, 凌摇 娟1,2, 龙丽娟1,张摇 偲1,董俊德1,2,*
(1. 中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室,中国科学院南海海洋研究所, 广州摇 510301;
2. 中国科学院南海海洋研究所海南热带海洋生物实验站, 三亚摇 572000; 3. 中国科学院大学, 北京摇 100049)
摘要:对三亚湾鹿回头与西沙石岛的常见鹿角杯形珊瑚(Pocillopora damicornis)的固氮酶 nifH 基因多样性进行了分析,并对其
共附生固氮微生物多样性进行了比较。 利用 TaqI和 Hae芋两种限制性内切酶分别对三亚湾珊瑚的粘液(SYN)、组织(SYZ)和
西沙珊瑚组织(XSZ)的阳性克隆子进行聚合酶链反应鄄限制性片段长度多态性(PCR鄄RFLP)分析,得到了 23,25和 13个 OTUs,
文库的覆盖率分别为 90.3%,87.5%和 94.1%,多样性指数 Shannon鄄Wiener指数(H)分别为 2.28,3.02和 2.08,Evenness指数(E)
分别为 0.5,0.65和 0.56。 研究结果表明:1)3个文库重要组成部分都是绿菌门(Chlorobia)和变形菌门(Proteobacteria)琢鄄亚门、
酌鄄亚门、啄鄄亚门细菌;2)3个文库绝大部分 OTUs的最相似序列来自珊瑚礁、海绵、水体、沉积物等环境中的不可培养细菌,反映
鹿角杯形珊瑚组织和粘液可能蕴含着丰富的尚未被培养的固氮菌资源;3)发现了两大重要的类群———分别与绿菌门和脱硫弧
菌属(Desulfovibrio)细菌序列最相似的类群,它们通过为珊瑚共生体提供有机氮源参与到珊瑚白化的调节或恢复过程中,在珊
瑚共生体营养物质的循环中充当重要角色;4)从多样性指数分析可以看出,SYZ的固氮微生物多样性高于 SYN,SYZ的固氮微
生物多样性高于 XSZ,反映了鹿角杯形珊瑚生活的地理位置不同,固氮菌共附生的生态位不同(如珊瑚粘液、组织等不同部
位),都将导致珊瑚共附生固氮菌多样性的差异。
关键词:鹿角杯形珊瑚;固氮菌;固氮酶基因 nifH;PCR鄄RFLP;生物多样性
Diversity of nitrogen鄄fixing bacteria associated with the coral Pocillopora
damicornis analyzed by PCR鄄RFLP
HUANG Xiaofang1,2,3, CHEN Lei1,2,3, ZHANG Yanying1,2, LING Juan1,2, LONG Lijuan1, ZHANG Si1,
DONG Junde1,2,*
1 CAS Key Laboratory of Tropical Marine Bio鄄resources and Ecology, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou
510301, China
2 National Experiment Station of Tropical Marine Biology, Sanya 572000, China
3 Graduate University of the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
Abstract: Coral reef ecosystem is known as “ tropical rainforest of the ocean冶 due to its high biodiversity and primary
productivity. Bacteria are known to be abundant and active in different coral niches, including coral surface mucus layer,
coral tissue, and surrounding reef waters. Coral鄄associated bacteria play important roles in resisting pathogen, cycling of
http: / / www.ecologica.cn
nitrogen, carbon and sulfur in coral reef ecosystem. Previous studies on coral microbiology in China mainly focused on the
genetic diversity of zooxanthellae and their ecological and physiological roles in corals, and so far few investigations have
been made in regard to the diversity of coral鄄associated bacteria, especially coral鄄associated diazotrophic bacteria. This
research aimed to elucidate the nifH gene diversity of nitrogen鄄fixing bacteria associated with P. damicornis, and compare
the nitrogen鄄fixing bacteria diversity. Three samples (mucus, tissue of coral P. damicornis from Sanya Bay and tissue of
coral P.damicornis from Xisha Islands) were investigated, which were named as SYN, SYZ and XSZ, respectively. The
nitrogenase gene nifH diversity of three coral samples were assessed using clone library construction in combination with
Polymerase Chain Reaction鄄restriction Fragment Length Polymorphism (PCR鄄RFLP). Different operational taxonomic unit
(OTU) groups (RFLP patterns) were recovered from the different coral samples after digested by the restriction enzymes
TaqI and Hae芋, respectively. As a result, 23 OTUs were recovered from 155 clones of SYN, 25 OTUs were recovered from
120 clones of SYZ, while 13 OTUs were recovered from 102 clones of XSZ with clone coverage was 90.3%,87.5% and
94郾 1%, Shannon鄄Wiener index (H) was 2.28, 3.02 and 2.08, Evenness index (E) was 0.5, 0.65 and 0.56, respectively.
The findings of this study showed that 1) Clone libraries demonstrated that the majority of retrieved sequences from coral
mucus and tissue libraries were identified to be Chlorobia and Proteobacteria ( including 琢鄄, 酌鄄 and 啄鄄Proteobacteria). 2)
Most of OTUs were related to those nifH gene sequences of uncultured bacteria from a variety of habitats in marine
environments, such as coral reef, sea sponges, ocean water column and marine sediment, which indicated coral
P. damicornis might harbored a large number of new diazotroph resources that had not yet been cultured. 3) The study also
found two bacterial group鄄 OTUs related to Chlorobia and Desulfovibrio, which may not be only as pathogenic bacteria as
described in the previous reviews, but also played important roles in nutrient cycles, defensing of coral symbionts, they
were suspected to resist coral bleaching by fixing nitrogen. 4) Shannon鄄Wiener index indicated that the diazotrophic
diversity of SYN was lower than that of SYZ, and diazotrophic diversity associated with XSZ was lower than that of SYZ,
showing that the community diversity of diazotroph assoiated with coral differed based on the geographic location and specific
environment characterices of the coral.
Key Words: Pocillopora damicornis; nitrogen鄄fixing bacteria; nifH; PCR鄄RFLP; biodiversity
摇 摇 珊瑚礁具有较高的生物多样性和高效的生产
力,故素有“海洋中的热带雨林冶之称,造礁石珊瑚主
要生存在氮素营养贫乏的海域中,生产力水平通常
受到可利用氮素营养的限制,原核生物的生物固氮
作用被认为是珊瑚礁海域可利用氮素的主要来
源[1鄄2]。 固氮菌是珊瑚虫共附生体中一类重要的功
能微生物,它们可以通过生物固氮作用固定无机氮
素,从而为珊瑚虫及其共生体提供重要的有机氮源。
这些有机氮不仅能为珊瑚共生体提供氮营养,而且
还可为整个珊瑚礁生态系统提供约 6%的可利用氮
源[3鄄4]。 通过现代分子生物学方法,如荧光原位杂交
(FISH)、变性梯度凝胶电泳(PCR鄄DGGE)、限制性片
段长度多态性(PCR鄄RFLP)等手段,发现固氮菌以较
高的丰度和多样性共附生于珊瑚虫的粘液层、组织
以及骨骼[5鄄8]中,而且绝大部分序列是利用非可培养
手段获得的序列,表明其蕴含着丰富的尚未实现纯
培养的固氮菌资源。
我国珊瑚礁主要集中分布于西沙群岛以及三亚
海域。 西沙群岛等南海诸岛珊瑚群落通过北迁繁衍
而对我国沿岸珊瑚礁的形成具有重要影响,是海南
岛、广东省和广西省沿岸珊瑚幼虫的补充源地[9鄄10]。
三亚湾与西沙群岛的珊瑚礁生态系统目前却受到了
不同程度的人类干扰:三亚湾是旅游胜地,大量的生
活污水的排入以及人类生产作业甚至是潜水旅游,
都对珊瑚礁的生长产生了极大的影响;西沙群岛远
离人类居住地,总体上受到人类的干扰较小,更能代
表珊瑚栖居的自然状态。 我国珊瑚微生物学研究还
处于初级阶段,对造礁石珊瑚内共附生固氮菌的多
样性研究还鲜有报道。 因此本论文选取在西沙石岛
和三亚湾鹿回头都普遍存在的鹿角杯形珊瑚
(Pocillopora damicornis)为研究对象[11],利用 PCR鄄
RFLP 的方法对其组织和粘液内的固氮酶基因 nifH
6785 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 34卷摇
http: / / www.ecologica.cn
多样性和系统发育进行分析和研究,探究其共附生
固氮菌的群落结构组成以及地理位置和人类干扰对
固氮菌多样性的影响。 旨在加深对珊瑚虫共附生功
能体的认知,为我国的造礁石珊瑚固氮菌的微生物
学以及珊瑚礁生态系统的氮素供给和可持续发展研
究提供了重要理论依据。
1摇 材料与方法
1.1摇 样品采集
鹿角石珊瑚样品分别采集于海南三亚鹿回头岸
礁(18毅13忆30" N, 109毅29忆15" E)和西沙群岛石岛
(16毅21忆45" N, 120毅21忆30" E)。 具体采用方法如
下,每个采样点采集样本(湿重约 1 Kg)3 份,样品间
相距 5 m左右。 截取珊瑚样品 4—6 cm,放入无菌标
本袋,标记后立即置于 4 益冰盒内保存[12]。
1.2摇 样品处理
珊瑚样品表面用无菌海水轻轻漂洗 3—4次,以
除去表面泥沙等附着物,随后 2 675伊g 离心收集粘
液,将珊瑚组织样品再次冲洗后用无菌锡箔纸包好,
放入无菌袋中-20 益保存[2,12鄄13]。 本研究选取了三
亚湾珊瑚样品的组织和粘液以及西沙珊瑚样品的组
织,分别标记为 SYZ,SYN和 XSZ。
1.3摇 基因组 DNA的提取以及固氮基因 nifH的 PCR
扩增和纯化回收
由于珊瑚样品中含有大量结构比较复杂的腐殖
酸,它们会极大的降低基因组 DNA 的得率,因此需
要先对样品进行去腐殖酸预处理[14],然后使用
BIOMIGA的 EZgeneTM土壤 gDNA提取试剂盒进行珊
瑚组织(5 g)和粘液(500 滋L)总 DNA 的提取,采用
Olson N.D.设计的固氮酶基因 nifH简并引物(正向引
物 5忆鄄ATG TCG GYT GYG AYC CSA ARG C鄄3忆,反向
引物 5忆鄄ATG GTG TTG GCG GCR TAV AKS GCC
ATC AT鄄3忆)进行扩增[2],目的片段约 387—389 bp。
PCR反应体系(25 滋L)包括:premix Taq 12.5 滋L,引
物( 1 滋mol / L) 0. 5 滋L, BSA ( 1%) 0. 5 滋L, DMSO
(10%)1 滋L;PCR 扩增程序为:95 益预变性 5 min;
95 益 40 s,55 益 40 s,72 益 40 s,30个循环;最后 72
益延伸 6 min。 构建文库时,选取同一样品的 3 份重
复,分别抽提总 DNA 后进行固氮酶 nifH 基因的扩
增,将这些目的基因的 PCR 产物混合后,采用 DNA
纯化回收试剂盒(TAKARA)将目的条带进行纯化,
置于-20 益备用。
1.4摇 扩增产物的克隆和 RFLP 分析
将 nifH基因片段与 pMD18鄄T 载体连接后转入
大肠杆菌 DH5琢中,通过蓝白斑筛选初筛,使用载体
的特异性扩增引物 M13 / RV 对菌落进行 PCR 扩增
以检测阳性克隆[15]。 PCR反应体系(25 滋L)和扩增
程序同 1.3。 将所获得的阳性克隆分别进行限制性
内切酶 Taq玉和 Hae芋酶切[16鄄17],酶切产物经过
3郾 0%琼脂糖凝胶电泳检测后做分析带型。
1.5摇 3个文库的固氮细菌的多样性指数分析
本文采用 Shannon鄄Wiener指数(H),Evenness指
数(E)来分析和反映鹿角杯形珊瑚共附生固氮菌的
多样性。 计算公式分别为:
H = -移(Pi)(lnPi)
式中,Pi = Ni / N,Ni 指各个 OTU 的克隆子数,N 指
文库的总阳性克隆子数。
E = H / Hmax
式中,H为 Shannon鄄Wiene指数,Hmax = lnS,S 指每个
文库的总 OTU 数。 H 可估算群落多样性的高低,E
用来描述文库中个体的均一度[18]。
1.6摇 固氮酶基因序列系统发育分析
将具有相同酶切带型的克隆子归为一个 OTU
(Operational Taxonomic Units),每个 OTU 挑取一个
代表送上海美吉医药科技有限公司测序;然后通过
BLAST软件在 GenBank 数据库进行序列比对分析,
获取相近典型菌株的 nifH 基因序列;最后使用
Clustal W和 Mega 5.0[19]软件中的邻接法(Neighbor鄄
Joining)建立 nifH 基因的系统进化发育树,自举值
为 1000[16]。
2摇 结果与分析
2.1摇 摇 固氮酶 nifH基因的文库以及 RFLP 分析
将扩增回收后的 nifH 基因片段进行连接、转化
和培养。 随机挑取白色菌落,经过菌落 PCR 阳性检
测后,分别选取了 SYN,SYZ和 XSZ 3个文库的 155,
120和 102个阳性克隆子进行限制性内切酶 Taq玉
和 Hae芋酶切分析。 根据酶切条带的大小和数目进
行谱带分型,并计算其文库覆盖率(用 C表示),计算
公式为:
C = [1-(n1 / N) ] 伊100%
式中,N代表阳性克隆子数,n1代表在文库中仅出现
7785摇 20期 摇 摇 摇 黄小芳摇 等:基于 RFLP 技术的鹿角杯形珊瑚共附生固氮菌多样性分析 摇
http: / / www.ecologica.cn
一次的 OTU数量[20]。 SYN 文库有 23 种谱带类型,
SYZ文库有 25 种谱带类型,XSZ 文库得到 13 种
RFLP 谱带类型,即分别代表了 23、25、13 种 OTUs,
其中 SYN,SYZ和 XSZ 这 3 个文库的 n1 分别为 15,
15和 6,覆盖率分别为 90.3%,87.5%和 94.1%,表明
这 3个文库固氮菌多样性覆盖程度能够较完整的反
映珊瑚粘液和组织内共附生的固氮细菌丰度和固氮
菌群落结构组成。
2.2摇 nifH基因的测序结果和系统发育分析
固氮生物多种多样,但其生物固氮作用都需要
共同的固氮酶基因 nifH 的参与,该基因高度保守但
也存在可变的 DNA 序列区,并且 nifH基因的系统发
育与 16S rDNA 具有一致性[21鄄24],表明 nifH 基因是
研究固氮微生物群落结构很好的标记。 因此通过对
鹿角杯形珊瑚共附生固氮菌的 nifH基因序列进行系
统发育对比,来了解珊瑚的固氮菌多样性和群落结
构组成。
将每个 OTU 的代表克隆子 nifH 基因序列在
GenBank 数据库进行对比分析,通过 Clustal W 和
Mega 5.0软件以邻接法(Neighbor鄄Joining)构建 nifH
基因的系统进化发育树(图 1),并利用 OriginPro8 软
件分析了各文库含固氮类群的百分组成(图 2)。 从
系统进化树可以发现,这 3 个文库中均包含了绿菌
门细菌和变形菌门 琢鄄、酌鄄和 啄鄄亚门细菌,但多样性差
异明显:SYN 文库中共有 16 个 OTUs 属于变形菌门
酌鄄、啄鄄亚门,绿菌门的克隆子数占到了克隆子总数的
78.7%,为绝对优势类群;SYZ文库中变形菌门 琢鄄、酌鄄
和 啄鄄亚门的 OTUs 分布比较均一,分别为 7,9 和 6
个,其中变形菌门 琢鄄、酌鄄亚门的克隆子数占到了克隆
子总数的 87.5%,为绝对优势类群;XSZ 文库中变形
菌门 琢鄄亚门的 OTUs 有 8 个,占了整个文库的
61郾 5%,而变形菌门 酌鄄亚门的克隆子数占到了克隆
子总数的 70.6%,为绝对优势类群。
8785 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 34卷摇
http: / / www.ecologica.cn
9785摇 20期 摇 摇 摇 黄小芳摇 等:基于 RFLP 技术的鹿角杯形珊瑚共附生固氮菌多样性分析 摇
http: / / www.ecologica.cn
图 1摇 3个鹿角杯形珊瑚样品的 nifH型固氮细菌克隆文库的系统进化树分析
Fig.1摇 Phylogenetic analysis of nifH鄄containing clones from SYN, SYZ and XSZ of P. damicornis
图 2摇 鹿角杯形珊瑚共附生固氮菌 nifH基因克隆文库落所含类群的百分比
Fig.2摇 Percents of different phylum in nifH clones of N2 鄄fixing bacteria communities associated with P. damicornis
A: 基于克隆文库 OTU数目,B: 基于克隆子数; SYN: 三亚湾珊瑚粘液样品编号,SYZ: 三亚湾珊瑚组织样品编号,XSZ: 西沙珊瑚组织样品
编号
0885 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 34卷摇
http: / / www.ecologica.cn
摇 摇 与 3个克隆文库 nifH基因序列的遗传相似性最
高的序列,绝大部分为非可培养手段获取的序列,其
样品来源非常广泛,不仅涉及到了海洋领域如海水
水域、海水沉积物,也有陆地土壤,甚至还包括了植
物根系和动物,只有很少数的克隆子与可培养的细
菌具有较高同源性(图 1 和表 1),反映鹿角杯形珊
瑚组织和粘液可能蕴含着丰富的尚未被培养的固氮
菌资源。 通过对比发现,SYN 文库中与数据库中可
培养细菌相似性最高的克隆子数最少,仅占整个克
隆文库的 3.9%:5 个克隆子与从土壤中分离到的圆
褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)相似性为 98%;克
隆子 SYN102 与日本慢生根瘤菌 ( Bradyrhizobium
japonicum)的相似性仅为 89%。 SYZ 文库中约有
36郾 3%的克隆子数与文献报道的可培养细菌近缘,
在 3 个文库中的比例最高:SYZ18 克隆子与反硝化
慢生根瘤菌(Bradyrhizobium denitrificans)的相似性
为 96%;36 个克隆子与圆褐固氮菌有 98%的相似
性;6 个克隆子与坚韧类芽孢杆菌 ( Paenibacillus
durus)表现出 98%的相似性。 XSZ 文库中有 21.6%
的克隆子的近缘序列来源于可培养细菌:11 个克隆
子与反硝化慢生根瘤菌表现出 98%的相似性;另有
11个克隆子与克雷伯氏菌 (Klebsiella sp.)表现出
99%的相似性。 在这些可培养细菌中,发现圆褐固
氮菌同时存在于三亚湾鹿回头的珊瑚组织和粘液
中,但是在西沙珊瑚组织中却并未检测到该种细菌。
圆褐固氮菌具有较强的固氮能力,它能独立进行固
氮作用[25]。 这可能是由于三亚湾受到岛内陆生环
境的影响,陆源固氮菌被冲刷到海水后,适应了珊瑚
组织的内环境。 在三亚湾和西沙的珊瑚组织中都检
测到了反硝化慢生根瘤菌,说明这一类固氮细菌可
能对环境具有较强的适应性,能够抵抗变化的环境。
在优势固氮细菌类群方面,SYN,SYZ 和 XSZ 文
库也表现出很大的差异(表 1)。 SYN 的固氮细菌克
隆文库中有两个优势的菌种:SYN1 和 SYN5 与夏威
夷蔷薇珊瑚(Hawaiian Montipora corals)非可培养克
隆子 Mf21鄄C10鄄C09 的相似性为 88%—90%,在系统
发育分类上与绿菌门(Choloria)细菌最相似,其中
SYN1为绝对优势菌种(94 个克隆子,60.6%),SYN5
则占到了整个克隆文库的 16.8%(26 个克隆子),这
2个 OTU所包含的克隆子数占到了整个克隆文库的
77.4%,是整个文库中的优势类群。 SYZ 克隆文库中
也有 2 个优势的菌种,占了整个文库克隆子数的
65%:其中 SYZ5(49个克隆子)代表着最大一类优势
菌种,与海绵(marine sponge)中的一种共附生固氮菌
clone IS3D01有 97%的相似性;另外一类代表编号为
SYZ1的优势菌种(29 个克隆子)与从农田中分离到
的可培养的圆褐固氮菌表现出 98%的相似性。 相比
之下,XSZ组织中的固氮细菌的多样性虽没有前两
个文库高,但有 4个优势的菌种,占整个克隆子文库
数量的 90.2%,分别是:1)XSZ3(61 个克隆子)与土
壤中的非可培养自生固氮菌 clone g1鄄PA16 相似性
约 94%—95%;2)XSZ11,XSZ16(11 个克隆子)与切
叶蚁 Acromyrmex echinatior内可培养细菌克雷伯氏菌
Klebsiella sp. CRPV0611 具有 99% 的相似性; 3 )
XSZ12(11个克隆子)与镍矿中的发现的非可培养细
菌 clone SERD鄄42A有 95%的相似性,这类细菌在对
镍矿先锋植物的生长有促进作用;4)XSZ47(9 个克
隆子)与华南地区豆科植物中共生的根瘤菌属反硝
化慢生根瘤菌有 98%的相似性。
这 3个文库中都有一类克隆子,其最相似的序
列均来源于夏威夷蔷薇珊瑚 (Hawaiian Montipora
corals)组织(表 1)。 它们唯一共有的克隆子(SYN1,
SYZ34,XSZ65)均与夏威夷珊瑚组织中的克隆子
Mf21鄄C10鄄C09 ( EU693444 ) 聚 类 到 了 绿 菌 门
(Chlorobia),相似性达 78%—99%。 绿菌门细菌是
一类能进行不产氧的专性厌氧光合细菌,同时也具
有固氮作用,因此能利用各种形式的碳素和氮素作
为自己的碳源和氮源[26]。 这表明绿菌门细菌可能
普遍存在于珊瑚共附生微生物中,其丰度随附生珊
瑚的种类或部位不同而发生变化。 绿菌门细菌有可
能在珊瑚白化阶段,虫黄藻大量排出体外后,为珊瑚
健康的恢复发挥了巨大的作用。 它们同时具备光合
作用和固氮作用的功能,因此就大大降低了对光合
固碳的依赖性。 当虫黄藻排出珊瑚虫体外后,此时
珊瑚共附生体仍能通过绿菌门细菌获取有机氮源和
氮源,这也为游离的虫黄藻重新回到宿主体内,珊瑚
恢复健康创造条件。 同时还发现这 3 个文库的 啄鄄亚
门克隆子均与脱硫弧菌属(Desulfovibrio sp.)的发育
地位最相近,相似性为 78%—86%。 目前普遍认为
脱硫弧菌是一类致病菌,是珊瑚黑带病的病原体之
一[27鄄28],在本次研究中发现了一类具有固氮潜能的
与脱硫弧菌属细菌最相近的 啄鄄亚门克隆子,这有力
1885摇 20期 摇 摇 摇 黄小芳摇 等:基于 RFLP 技术的鹿角杯形珊瑚共附生固氮菌多样性分析 摇
http: / / www.ecologica.cn
的揭示了脱硫弧菌在珊瑚中的角色并不仅仅限于致
病菌,他们极有可能通过如固氮作用为珊瑚虫提供
营养和次级代谢产物,参与珊瑚共生体营养物质的
循环,与宿主珊瑚间建立着互惠互利的共生关
系[2,29]。 近年来,三亚旅游业的快速发展和周围养
殖场的增多导致了大量的生活污水和污染物排放入
海域中,这导致珊瑚礁生态系统生活于高营养(高浓
度溶解氧,磷或有机质)负荷下的压力环境[30],这种
外界环境的压力极有可能使这些脱硫弧菌转化为条
件致病菌,通过竞争取代先前优势种群而占据统治
地位从而使珊瑚患病。 因此需要通过研究珊瑚共附
生脱硫弧菌的动态变化来监测珊瑚的健康状况,从
而为保护珊瑚礁生态系统起到理论指导和技术
支持。
表 1摇 3个珊瑚共附生固氮酶基因 nifH的克隆文库序列的来源和比较
Table 1摇 Homologous comparison of bacterial nifH sequence and sequence comparison of the SYN, SYZ, XSZ clone
克隆文库 Clone libraries
SYN
OTU
(Operational
Taxonomic
Unit)编号
克隆子数
Number of
clones
SYZ
OTU编号
克隆子数
Number of
clones
XSZ
OTU编号
克隆子数
Number
of clones
最相似序列 Similarity
序列号
GenBank
accession
number
来源
Origins
SYN123
SYN18
SYN13
SYN186
1
3
5
1 SYZ29 1 HQ455869 中国南海
SYN94 1 HM750822 盐沼地植物根际
SYZ27 1 HM750623
SYZ110 1 HM750623
SYN81 1 FJ807378 红树林根际
SYN118 1 SYZ91 3 FJ807380
SYZ111 1 EF191077
SYN2 5 SYZ1SYZ17
29
1 EF634050 农田土壤
SYZ86 6 EF634052
SYN191 2 EU693399 夏威夷蔷薇珊瑚
SYN7 1 EU693410
SYN25 1 EU693408
SYN185 1 EU693385
SYN40 1 EU693380
SYN1
SYN5
SYN44
94
26
1
SYZ34 1 XSZ65 1 EU693444
SYZ156
SYZ93 5 EU693378
XSZ63 1 EU693442
SYN87 1 HM063813 中国南海沉积物
SYN52 1 HM063790
SYZ41 1 HM063800
SYZ101 1 HQ223603
SYN22 2 FJ686527 胶州湾沉积物
SYN61 1 FJ686502
SYN102 1 GQ289583 稻田土壤
SYN11 1 SYZ132 1 HM999421 加勒比海珊瑚Montastraea cavernosa
SYN53 3 EF174829 大堡礁
2885 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 34卷摇
http: / / www.ecologica.cn
续表
克隆文库 Clone libraries
SYN
OTU
(Operational
Taxonomic
Unit)编号
克隆子数
Number of
clones
SYZ
OTU编号
克隆子数
Number of
clones
XSZ
OTU编号
克隆子数
Number
of clones
最相似序列 Similarity
序列号
GenBank
accession
number
来源
Origins
SYZ190 1 FN665896 非豆科植物根际
XSZ115 1 FN665903
SYZ99 1 EU048169 高粱根际
SYZ35 1 AY601064 青藏高原土壤
SYZ36 1 AJ716402 矿区废弃地
SYZ18 1 XSZ2XSZ47
2
9 HM047125 落花生和紫花扁豆根际
SYZ5 49 EU593995 佛罗里达海绵
XSZ55 2 EU593996
XSZ86 1 EU594002
XSZ110 1 EU594008
SYZ84 1 GQ426255 热泉
SYZ19 4 GU193141 海洋微生物垫
SYZ6 3 DQ098215 切萨皮克海湾
SYZ89
SYZ12
4
2 AF227935 巴哈马群岛珊瑚礁
XSZ12
XSZ120
11
1 AJ716340 镍矿区植物根际
XSZ16
XSZ11
11 FJ593768 切叶蚁共生体
XSZ3 61 AY196416 土壤自生固氮菌
摇 摇 SYN: 三亚湾珊瑚粘液样品编号,SYZ: 三亚湾珊瑚组织样品编号,XSZ: 西沙珊瑚组织样品编号
摇 摇 由于鹿角杯形珊瑚生活的地理位置不同( SYZ
与 XSZ),以及固氮菌共附生的生态位不同(如珊瑚
粘液、组织等不同部位) (SYN 与 SYZ),导致共附生
固氮微生物多样性之间的差异。 将本研究所得的 3
个文库中固氮细菌的多样性指数进行比较(表 2):
SYZ文库的 H 指数和 E 指数均高于 SYN,其中 SYZ
的 H指数为 3.02,SYN的 H指数为 2.28,表明三亚珊
瑚组织内的固氮细菌的多样性高于三亚珊瑚粘液中
的共附生固氮菌。 可能是由于造礁石珊瑚的粘液具
有免疫防线的作用,这些由珊瑚虫分泌的粘多糖和
蛋白质等组成的粘液是珊瑚的第一道免疫防线,具
有抗菌抑菌的作用,因此珊瑚粘液中的共附生微生
物数量较少[31]。 比较三亚组织和西沙组织的固氮
菌多样性,发现西沙珊瑚组织中的固氮菌多样性明
显低于前者,其中 SYZ 的 H 指数、E 指数分别为
3郾 02,0.65;而 XSZ的 H指数、E指数仅为 2.08,0.56。
这可能与它们生活的环境有关系。 在正常的自然不
受人类干扰的状态下,共附生于珊瑚组织中的固氮
菌是一类数量不多的细菌,但是由于受到了外界环
境的干扰,陆源固氮菌被冲刷到三亚湾的海水中,珊
瑚虫为了获取足够的氮素,便主动从周围水体、沉积
环境中捕获固氮菌[32],导致珊瑚组织内附生细菌与
周围海水、沉积物甚至是与其同为腔肠动物的海绵
共附生固氮菌直接进行了交流,这些外源固氮菌进
入珊瑚组织内部,适应了珊瑚组织内环境。 这种固
氮菌多样性的增加,有利于提高对珊瑚共附生体氮
素营养的供应,尤其是为虫黄藻提供足够的氮源氨,
提高其光合作用效率。 这有利于提高珊瑚共附生体
对外界环境适应性和抵御能力。
SYN固氮功能基因 nifH 克隆文库的克隆子与
NCBI数据库中最相近序列的相似度为 81%—99%,
平均相似度为 89.9%;SYZ 克隆子与其最相近序列
的相似度达 83%—100%,平均值为 92.2% ;XSZ 克
隆子与其最相近序列的相似度达 85%—99%,平均
值相似度值是这 3 个文库中最高的,但也仅为
95郾 1%。 综合这 3 个文库的分析结果,可以看出许
3885摇 20期 摇 摇 摇 黄小芳摇 等:基于 RFLP 技术的鹿角杯形珊瑚共附生固氮菌多样性分析 摇
http: / / www.ecologica.cn
多克隆子与 GenBank 中最相近序列的相似性都很
低,说明珊瑚共附生固氮细菌不仅种类丰富,还可能
含有许多尚未被培养的新种, 这些共附生的固氮微
生物在珊瑚虫组织内长期的进化过程中,与珊瑚虫
及其共附生体保持高度的互作与协同作用,形成了
一个复杂但又紧密联系的功能复合体[33], 因此这些
菌很难通过传统的可培养方法被单独培养,多样性
较高的固氮细菌群落在整个珊瑚礁生态系统的生物
地球化学循环中发挥着重要作用。
表 2摇 SYN、SYZ与 XSZ固氮细菌多样性指数分析
Table 2 摇 Summary of RFLP analysis of nifH gene fragments from N2 鄄fixing bacteria communities in SYN, SYZ and XSZ comparation
of diversity
分布地区
Location
样品位点
Station
文库 OTU
(Operational
Taxonomic Unit)
总数(S)
Total OTUs (S)
香农多样性指数(H)
Shannon忆s diversity
index (H)
均一度指数(E)
Evenness index(E)
三亚湾 Sanya bay SYN 23(155) 2.28 0.50
三亚湾 Sanya bay SYZ 25(120) 3.02 0.65
西沙群岛 Xisha island XSZ 13(102) 2.08 0.56
摇 摇 SYN: 三亚湾珊瑚粘液样品编号,SYZ: 三亚湾珊瑚组织样品编号,XSZ: 西沙珊瑚组织样品编号
3摇 小结
本课题组曾对海南省三亚湾潮间带典型的海洋
近岸生态系统的固氮活性进行了研究,结果显示了
微藻垫生物群落、海草生态系统和珊瑚礁生态群落
固氮活性均高于沿岸水域系统的固氮活性,说明固
氮微生物在该海域的氮素循环供给中起着重要的作
用[14,34鄄35]。 对珊瑚礁生态系统而言,珊瑚虫共附生
固氮菌的固氮作用对维持整个珊瑚礁生态系统的稳
定和增长也起到了至关重要的作用。 本研究选取了
广泛分布于我国南海海域的鹿角杯形珊瑚,对其三
亚珊瑚样品的粘液(SYN)和组织(SYZ)以及西沙珊
瑚样品的组织(XSZ)的共附生固氮菌的固氮酶基因
nifH进行多态性分析。 结果显示:
(1)在文库覆盖率能较好反映共附生的固氮细
菌丰度和固氮菌落结构的情况下,发现这 3 个文库
中的绝大部分序列来自尚未实现纯培养的细菌,表
明珊瑚礁生态系统中可能栖息着大量的新的固氮微
生物。
(2)这 3个克隆文库中多数的固氮酶 nifH 基因
的相近序列来源于其他海域的珊瑚虫共附生固氮
菌,这表明有一类普适性固氮菌在大多数的珊瑚虫
中均发挥着重要的固氮作用,通过为珊瑚虫提供可
利用的氮素营养从而实现了珊瑚虫宿主和微生物共
附生体的互惠互利关系。 还发现了另一类克隆子与
海绵、海洋水体及其海洋沉积物中不可培养的固氮
菌具有较高(96%—99%)的相似性,系统发育地位
相近。 这意味着珊瑚虫共附生固氮微生物与其周围
的环境有着密切的联系,它们之间能够互相交流和
转移,从而更好的发挥其在珊瑚礁生态系统的氮素
生物地球化学循环中的重要作用。
(3)通过对 3个文库的比对分析,本研究发现了
两大类重要的种群:分别与绿菌门(Chlorobia)和脱
硫弧菌属(Desulfovibrio)细菌序列最相似的类群。 绿
菌门的固氮菌在我国南海海域的鹿角珊瑚的组织和
粘液中均有发现,尤其在 SYN 文库中它以 78%的比
率占到了绝对优势。 结合此前在夏威夷的蔷薇珊瑚
组织的共附生固氮微生物亦有发现,绿菌门细菌可
能是活体珊瑚中的一类重要的固氮微生物。 在本次
研究中发现了一类具有固氮潜能的与脱硫弧菌属细
菌最相近的 啄鄄亚门克隆子,这有力的证明了脱硫弧
菌在珊瑚中的角色并不仅仅限于致病菌,它们极有
可能通过如固氮作用为珊瑚虫提供营养和次级代谢
产物,参与珊瑚共生体营养物质的循环与宿主珊瑚
间建立着互惠互利的共生关系。
(4)虽然这些样品都是同一种造礁石珊瑚,但是
随着造礁石珊瑚生活的地理位置不同,固氮菌共附
生的部位不同,都导致了这些共附生固氮菌多样性
的差异。 通过对三亚珊瑚样品的粘液和组织的 nifH
基因文库的比较可发现,珊瑚虫组织和粘液中的共
附生固氮菌的群落组成是不一致的,该鹿角珊瑚虫
粘液中的优势菌群聚类到了绿菌门中,而珊瑚虫组
4885 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 34卷摇
http: / / www.ecologica.cn
织中的优势菌为变形菌门细菌;而对三亚珊瑚组织
SYZ 文库与西沙珊瑚组织 XSZ 文库比较发现,其共
附生固氮菌也存在较大的差异,前者的多样性明显
高于后者,表明珊瑚共附生固氮菌多样性与鹿角杯
形珊瑚生活的地理位置有着密切的关系,相比远离
大陆的西沙群岛而言,三亚湾的旅游、生活等人类活
动更大程度的影响着珊瑚礁生态系统共附生固氮菌
的生境,由于受到了人类的干扰,导致珊瑚组织内附
生细菌与周围海水、沉积物共附生固氮菌直接进行
了交流,这些外源固氮菌进入珊瑚组织内部,导致了
固氮菌多样性的增加,这在一定程度上提高了对珊
瑚共附生体氮营养的供给,也是珊瑚共附生体面对
外界不良环境时的抵御机制之一。
References:
[ 1 ] 摇 Gregory A, Lipschultz P F, McClelland J. Assimilation and
partitioning of prey nitrogen within two anthozoans and their
endosymbiotic zooxanthellae. Marine Ecology Progress Series,
2003, 262: 125鄄136.
[ 2 ] 摇 Olson N D, Ainsworth T D, Gates R D, Takabayashi M.
Diazotrophic bacteria associated with Hawaiian Montipora corals:
Diversity and abundance in correlation with symbiotic
dinoflagellates. Journal of Experimental Marine Biology and
Ecology, 2009, 371(2):140鄄146.
[ 3 ] 摇 Wilkinson C R, Williams D M, Sammarco P W, Hogg R W,
Trott L A. Rates of nitrogen fixation on coral reefs across the
continental shelf of the central Great Barrier Reef. Marine
Biology, 1984, 80(3):255鄄262.
[ 4 ] 摇 Williams W M, Viner A B, Broughton W J. Nitrogen fixation
( acetylene reduction) associated with the living coral Acropora
variabilis. Marine Biology, 1987, 94(4): 531鄄535.
[ 5 ] 摇 Crossland C J, Barnes D J. Acetylene reduction by coral
skeletons. Limnology and Oceanography, 1976, 1:153鄄156.
[ 6 ] 摇 Chimetto L A, Brocchi M, Thompson C C, Martins R C, Ramos
H R, Thompson F L. Vibrios dominate as culturable nitrogen鄄
fixing bacteria of the Brazilian coral Mussismilia hispida.
Systematic and Applied Microbiology, 2008, 31(4): 312鄄319.
[ 7 ] 摇 Wegley L, Edwards R, Rodriguez鄄Brito B, Liu H, Rohwer F.
Metagenomic analysis of the microbial community associated with
the coral Porites astreoides. Environmental Microbiology, 2007, 9
(11): 2707鄄2719.
[ 8 ] 摇 Lesser M P, Mazel C H, Gorbunov M Y, Falkowski P G.
Discovery of symbiotic nitrogen鄄fixing cyanobacteria in corals.
Science, 2004, 305(5686): 997鄄1000.
[ 9 ] 摇 Wang D Y, Wang H J, Li Y C, Yang Y, Liang W. Preliminary
study of coral larvae supplementary source around Leizhou
Peninsula. Journal of Tropical Oceanography, 2011, 30 ( 2):
26鄄32.
[10] 摇 Huang H, You F, Lian J S, Yang J H, Li X B, Dong Z J,
Zhang C L, Yuan T. Species diversity and distribution of
scleractinian coral at Xisha Islands, China. Biodiversity Science,
2011, 19(6): 710鄄715.
[11] 摇 Zhang Q M. The biodiversity of coral reefs of Luhuitou of Sanya
in danger. Science News, 2003, 9: 24鄄25.
[12] 摇 Rohwer F, Breitbart M, Jara J, Azam F, Knowlton N. Diversity
of bacteria associated with the Caribbean coral Montastraea
franksi. Coral Reefs, 2001, 20(1):85鄄91.
[13] 摇 Koren O, Rosenberg E. Bacteria associated with mucus and
tissues of the coral Oculina patagonica in summer and winter.
Applied and Environmental Microbiology, 2006, 72 ( 8 ):
5254鄄5259.
[14] 摇 Zhang Y Y. Marine Nitrogen Fixation Rates and the Diversity of
Marine Nitrogen鄄Fixing Microorganism in Sanya Bay, South
China[ D]. Beijing: Graduate School of Chinese Academy of
Sciences, 2008: 59.
[15] 摇 Trower M K. In vitro mutagenesis protocols / / Methods in
Molecular Medicine. Totowa NJ: Humana Press, 1996, 57:
157鄄165.
[16] 摇 Poly F, Monrozier L J, Bally R. Improvement in the RFLP
procedure for studying the diversity of nifH genes in communities
of nitrogen fixers in soil. Research in Microbiology, 2001, 152
(1): 95鄄103.
[17] 摇 Widmer F, Shaffer B T, Porteous L A, Seidler R J. Analysis of
nifH gene pool complexity in soil and litter at a douglas fir forest
site in the oregon cascade mountain range. Applied and
Environmental Microbiology, 1999, 65(2): 374鄄380.
[18] 摇 Magurran A E. Population differentiation without speciation.
Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series
B: Biological Sciences, 1998, 353(1366): 275鄄286.
[19] 摇 Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar
S. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using
maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum
parsimony methods. Molecular Biology and Evolution, 2011, 28
(10): 2731鄄2739.
[20] 摇 Wagner M, Loy A. Bacterial community composition and function
in sewage treatment systems. Current Opinion in Biotechnology,
2002, 13(3):218鄄227.
[21] 摇 Zehr J P, Jenkins B D, Short S M, Steward G F. Nitrogenase
gene diversity and microbial community structure: a cross鄄system
comparison. Environmental Microbiology, 2003, 5 ( 7 ):
539鄄554.
[22] 摇 Steward G F, Jenkins B D, Ward B, Zehr J P. Development and
testing of a DNA macroarray to assess nitrogenase ( nifH) gene
diversity. Applied and Environmental Microbiology, 2004, 70
(3): 1455鄄1465.
5885摇 20期 摇 摇 摇 黄小芳摇 等:基于 RFLP 技术的鹿角杯形珊瑚共附生固氮菌多样性分析 摇
http: / / www.ecologica.cn
[23] 摇 Young J P W. Phylogenetic classification of nitrogen鄄fixing
organisms / / Stacy G, Burris R H, Evans H J, eds. Biological
Nitrogen Fixation. New York: Chapman and Hall, 1992: 43鄄86.
[24] 摇 Young J P W. Molecular phylogeny of rhizobia and their
relatives / / Palacios R, Mora J, Newton W E, eds. New Horizons
in Nitrogen Fixation. London: Kluwer Academic Publishers,
1993: 587鄄592.
[25] 摇 Ashby S F. Some observations on the assimilation of atmospheric
nitrogen by a free living soil organism鄄Azotobacter chroococcum of
beijerinck. Journal of Agricultural Science, 1907, 2(1): 35鄄51.
[26] 摇 Keppen O I, Berg I A, Lebedeva N V, Taisova A S, Kolganova
T V, Slobodova N V, Bulygina E S, Turova T P, Lvanovskii R
N. Chlorobaculum macestae sp. nov., a New Green Sulfur
Bacterium. Microbiology, 2008, 77(1): 69鄄77.
[27] 摇 Kuta K G, Richardson L L. Ecological aspects of black band
disease of corals: relationships between disease incidence and
environmental factors. Coral Reefs, 2002, 21(4): 393鄄398.
[28] 摇 Frias鄄Lopez J, Zerkle A L, Bonheyo G T, Fouke B W.
Partitioning of bacterial communities between seawater and
healthy, black band diseased, and dead coral surfaces. Applied
and Environmental Microbiology, 2002, 68(5): 2214鄄2228.
[29] 摇 Bourne D G, Munn C B. Diversity of bacteria associated with the
coral Pocillopora damicornis from the Great Barrier Reef.
Environmental Microbiology, 2005, 7(8): 1162鄄1174.
[30] 摇 Zhao M X, Yu K F, Zhang Q M, Shi Q. Spatial pattern of coral
diversity in Luhuitou fringing reef, Sanya. Acta Ecologica Sinica,
2008, 28(4): 1419鄄1428.
[31] 摇 Rosenberg E, Kellogg C A, Rohwer F. Coral microbiology.
Oceanography, 2007, 20(2):146鄄154.
[32] 摇 Rohwer F, Seguritan V, Azam F, Knowlton N. Diversity and
distribution of coral鄄associated bacteria. Marine Ecology Progress
Series, 2002, 243: 1鄄10.
[33] 摇 Fiore C L, Jarett J K, Olson N D, Lesser M. Nitrogen fixation
and nitrogen transformations in marine symbioses. Trends in
Microbiology, 2010, 18(10):455鄄463.
[34] 摇 Zhang Y Y, Dong J D, Zhang S, Wang Y S, Wang H K, Huang
L M. Studies on nitrogen fixation physiology of marine
cyanobacteria Calothrix sp. strain MCT1 and Lyngbya sp. strain
MCT6. Journal of Tropical Oceanography, 2006, 25(4): 46鄄50.
[35] 摇 Ling J, Dong J D, Zhang Y Y, Cai C H, Wang Y S, Zhang S.
Isolation and characterization of a N2 鄄fixing bacterium from coral
reef鄄seagrass ecosystem. Microbiology, 2010, 37(7): 962鄄968.
参考文献:
[ 9 ] 摇 王道儒, 王华接, 李元超, 杨毅, 梁文. 雷州半岛珊瑚幼虫补
充来源初步研究. 热带海洋学报, 2011, 30(2): 26鄄32.
[10] 摇 黄晖, 尤丰, 练健生, 杨剑辉, 李秀保, 董志军, 张成龙, 袁
涛. 西沙群岛海域造礁石珊瑚物种多样性与分布特点. 生物多
样性, 2011, 19(6): 710鄄715.
[14] 摇 张燕英. 南海三亚湾海洋生物固氮效率及固氮生物多样性研
究[D]. 北京: 中国科学院研究生院, 2008: 59.
[30] 摇 赵美霞, 余克服, 张乔民, 施祺. 三亚鹿回头石珊瑚物种多样
性的空间分布. 生态学报, 2008, 28(4): 1419鄄1428.
[34] 摇 张燕英, 董俊德, 张偲, 王友绍, 王汉奎, 黄良民. 海洋固氮
蓝藻 Calothrix sp.与 Lyngbya sp.固氮生理的研究. 热带海洋学
报, 2006, 25(4): 46鄄50.
[35] 摇 凌娟, 董俊德, 张燕英, 蔡创华, 王友绍, 张偲. 一株珊瑚礁鄄
海草床复合生态系统固氮菌的分离与鉴定. 微生物学通报,
2010, 37(7): 962鄄968.
6885 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 34卷摇