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摇 摇 摇 摇 摇 生 态 学 报
摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 (SHENGTAI XUEBAO)
摇 摇 第 31 卷 第 8 期摇 摇 2011 年 4 月摇 (半月刊)
目摇 摇 次
塔里木河下游胡杨径向生长与地下水的关系 安红燕,徐海量,叶摇 茂,等 (2053)………………………………
冲积平原区高程因子对土壤剖面质地构型的影响———以封丘县为例 檀满枝,密术晓,李开丽,等 (2060)……
臭氧胁迫对大豆叶片抗坏血酸鄄谷胱甘肽循环的影响 王俊力,王摇 岩,赵天宏,等 (2068)……………………
重要理化因子对小球藻生长和油脂产量的影响 张桂艳,温小斌,梁摇 芳,等 (2076)……………………………
北亚热带马尾松净生产力对气候变化的响应 程瑞梅,封晓辉,肖文发,等 (2086)………………………………
亚热带沟叶结缕草草坪土壤呼吸 李熙波,杨玉盛,曾宏达,等 (2096)……………………………………………
UV鄄B辐射对马尾松凋落叶分解和养分释放的影响 宋新章,张慧玲,江摇 洪,等 (2106)………………………
干旱胁迫下内生真菌感染对羽茅的生理生态影响 韩摇 荣,李摇 夏,任安芝,等 (2115)…………………………
蜜环菌对锌的耐性和富集特性 朱摇 林,程显好,李维焕,等 (2124)………………………………………………
干旱荒漠区狭叶锦鸡儿灌丛扩展对策 张建华,马成仓,刘志宏,等 (2132)………………………………………
黄土高原区不同植物凋落物搭配对土壤微生物量碳、氮的影响 王春阳,周建斌,夏志敏,等 (2139)…………
内蒙古典型草原克氏针茅与冰草的生存策略 孙摇 建,刘摇 苗,李胜功, 等 (2148)……………………………
荒漠沙柳根围 AM真菌的空间分布 贺学礼,杨摇 静,赵丽莉 (2159)……………………………………………
开放式昼夜不同增温对单季稻影响的试验研究 董文军,邓艾兴,张摇 彬,等 (2169)……………………………
醉马草免培养内生细菌的多样性 张雪兵,史应武,曾摇 军,等 (2178)……………………………………………
河南生态足迹驱动因素的 Hi_PLS分析及其发展对策 贾俊松 (2188)…………………………………………
禹城市耕地土壤盐分与有机质的指示克里格分析 杨奇勇,杨劲松,余世鹏 (2196)……………………………
旋覆花提取物对朱砂叶螨的生物活性及酶活性的影响 段丹丹,王有年,成摇 军,等 (2203)……………………
白洋淀湖滨湿地岸边带氨氧化古菌与氨氧化细菌的分布特性 叶摇 磊,祝贵兵,王摇 雨,等 (2209)……………
干旱胁迫条件下 6 种喀斯特主要造林树种苗木叶片水势及吸水潜能变化
王摇 丁,姚摇 健,杨摇 雪,等 (2216)
………………………………………
……………………………………………………………………………
桉树人工林物种多样性变化特征 刘摇 平,秦摇 晶,刘建昌,等 (2227)……………………………………………
海河流域湿地生态系统服务功能价值评价 江摇 波,欧阳志云,苗摇 鸿,等 (2236)………………………………
芦苇在微咸水河口湿地甲烷排放中的作用 马安娜,陆健健 (2245)………………………………………………
云南不同土壤铅背景值下大叶茶种群对铅的吸收积累特征及其遗传分化
刘声传,段昌群,李振华,等 (2253)
………………………………………
……………………………………………………………………………
长江口和杭州湾凤鲚胃含物与海洋浮游动物的种类组成比较 刘守海,徐兆礼 (2263)…………………………
江西大岗山地区 7—9 月降水量的重建与分析 乔摇 磊,王摇 兵,郭摇 浩,等 (2272)……………………………
山核桃免耕经营的经济效益和生态效益 王正加,黄兴召,唐小华,等 (2281)……………………………………
基于 GIS的广州市中心城区城市森林可达性分析 朱耀军,王摇 成,贾宝全,等 (2290)…………………………
专论与综述
土壤呼吸温度敏感性的影响因素和不确定性 杨庆朋,徐摇 明,刘洪升,等 (2301)………………………………
植物代谢速率与个体生物量关系研究进展 程栋梁,钟全林,林茂兹,等 (2312)…………………………………
耕地生态补偿实践与研究进展 马爱慧,蔡银莺,张安录 (2321)…………………………………………………
问题讨论
元谋干热河谷三种植被恢复模式土壤贮水及入渗特性 刘摇 洁,李贤伟,纪中华,等 (2331)……………………
研究简报
中微量元素和有益元素对水稻生长和吸收镉的影响 胡摇 坤,喻摇 华,冯文强,等 (2341)………………………
期刊基本参数:CN 11鄄2031 / Q*1981*m*16*296*zh*P* ￥ 70郾 00*1510*33*
室室室室室室室室室室室室室室
2011鄄04
封面图说: 巴西热带雨林———美丽的巴西北部玛瑙斯热带雨林景观。 位于南美洲的亚马逊河是世界上流域最广、流量最大的
河流,孕育了世界面积最大的热带雨林,雨林中蕴藏着极丰富的生物资源。
彩图提供: 中国科学院生态环境研究中心徐卫华博士摇 E鄄mail:xuweihua@ rcees. ac. cn
生 态 学 报 2011,31(8):2178—2187
Acta Ecologica Sinica
http: / / www. ecologica. cn
基金项目:973 计划前期研究专项(2008CB417214);新疆特殊环境微生物实验室开放课题(XJYS0203鄄2009鄄02)
收稿日期:2010鄄04鄄08; 摇 摇 修订日期:2010鄄07鄄27
*通讯作者 Corresponding author. E鄄mail: loukai02@ mail. tsinghua. edu. cn
醉马草免培养内生细菌的多样性
张雪兵1,2,史应武1,曾摇 军1,娄摇 恺1,*
(1. 新疆农业科学院微生物应用研究所, 乌鲁木齐摇 830091; 2. 新疆农业大学食品学院, 乌鲁木齐摇 830052)
摘要:为了解醉马草内生细菌的组成和多样性,采用液氮研磨法提取醉马草总 DNA,利用内生细菌 16S rRNA 基因特异性引物
对醉马草总 DNA 进行 16S rRNA 基因扩增,构建醉马草内生细菌 16S rRNA基因文库。 对筛选到 249 个克隆进行 Hae 睾酶切分
析,得到 57 个操作分类单元(OTUs)。 系统发育分析将其归为 4 个门:变形杆菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线
菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)以及 1 个未知类群。 其中 74%的克隆与可培养细菌中的 37 个属具有高的 16S
rRNA基因序列相似性 (97%—100% ),其中芽孢杆菌属(Bacillus spp. )、红球菌属(Rhodococcus spp. )、黄杆菌属(Flavobacterium
spp. )、黄单胞杆菌属(Xanthomonas spp. )最为丰富。 另外 26%的克隆序列与 GenBank 中已存细菌 16S rRNA 基因序列相似性
小于 96% 。 研究结果表明,醉马草中可培养内生细菌丰富,多样并且可能存在一些潜在新物种或新类群。
关键词:醉马草;内生细菌;免培养法;生物多样性
Endophytic bacterial diversity in Achnatherum inebrians by culture鄄independent
approach
ZHANG Xuebing1,2, SHI Yingwu1,ZENG Jun1, LOU Kai1,*
1 Institute of Microbiology, Xinjiang Academy of Agricultural Sciences Urumqi 830091,China
2 College of Food Science of Xinjiang Agricultural University Urumqi 830052,China
Abstract: Achnatherum inebrians (Hance) Keng, which is belonged to genus Achnatherum Beauv, Gramineae family, also
known as Oxytropis glabra, is one of poisonous perennial herbs on grassland and is wildly distributed in Inner Mongolia,
Ningxia, Gansu, Qinghai and Xinjiang province of northwest China. It is toxic to hoofed mammals of the genus Equus,
however, they are hardy and easy to grow in arid and semi鄄arid areas and played active role in improving ecological
environment. The toxic ingredients extracted from the plant are usually used as anti鄄cancer drugs, immune modulators; such
as Swainsonine, one of well studied anti鄄cancer drugs that often used to stimulate bone marrow cell proliferates. Therefore,
the plant is worth of fullly usage and utilizing it rationally. In this study, a culture鄄independent of analysis were chosen to
investigate the endophytic bacterial composition and diversity associated in Achnatherum inebrians. Total community DNA
were extracted by modified CTAB鄄SDS DNA extraction protocol from plant stem, leaf and root which were grinded up using
liquid nitrogen grinding method after strictly surface鄄sterilization. To construct 16S rDNA clone libraries, endophytic
bacterial specific primer pair 799F and 1492R were selected to amplify bacterial 16S rDNA partial gene, and then PCR
products were ligated into a PMD18鄄T Vector and transformed into Escherichia coli DH 5琢. Transformants were selected by
blue and white selection. Positive clones were analyzed by Restriction Fragment length polymorphism (RFLP), and clones
with unique RFLP patterns were selected for sequencing, alignment and constructing 16S rRNA gene phylogenetic tree. In
total 249 clones were screened, which could be grouped into 57 operational taxonomic units (OTUs), based on Hae III
digestion. These were divided into four phyla (Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria, Bacteroides) and one unknown
group by phylogenetic analysis. Of them, 74% of clones classified into 37 genera of bacteria phylum were highly related to
cultivable species with high 16S rRNA gene similarity (>96% sequence similarity); and among them genera Bacillus spp. ,
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Rhodococcus spp. , Flavobacterium spp. , Xanthomonas spp. , were most abundant; In addition, 26% of clones showed less
than 96% of 16S rRNA gene identity with bacterial sequences deposited in GenBank database. Besides, rarefaction curve
reaches clear saturation and its Coverage C value is 93% , indicating that most of the estimated endophytic bacterial
diversity was sampled and 249 positive clones for enzyme digestion were enough good to the community investigation. These
results suggest that Achnatherum inebrians harbors a diversity of cultivable endophytic bacteria and maybe existence of some
potential novel species or lineages.
Key Words: Achnatherum inebrians; endophytic bacterial; culture鄄independent; biodiversity
醉马草[Achnatherum inebrians (Hance) Keng. ]为禾本科(Gramineae)芨芨草属(Achnatherum Beauv. ),多
年生草本植物,原产于欧亚两洲,在我国主要分布于甘肃、新疆、内蒙古等地。 醉马草具有抗高寒、耐干旱等优
势,所以分布广、适应性强。 醉马草是我国北方主要的烈性毒草之一,主要危害马属动物(马、驴、骡),尤其是
近些年来由于过度放牧造成草场退化,而醉马草乘机蔓延成为畜牧业一大危害。 在新疆醉马草广泛分布于天
山南北,覆盖度最高可达 85% ,有重要的生态价值[1]。
近年来,研究发现醉马草内生真菌带菌率几乎达到 100% [2鄄3],利用内生菌防治作物病虫害、开发有益内
生菌以提高作物产量和品质,对农业可持续发展具有重要意义。 研究醉马草内生菌多样性,有助于阐明内生
菌与醉马草共生过程中功能和潜在作用。 目前对于植物内生菌的研究主要采用培养的方法,然而培养的方法
仅能分离到很少的植物内生菌,不足以反映植物内生菌多样性。 非培养方法可以补充培养方法的不足,较为
完整的解析植物内生菌种类,但是目前利用非培养方法对醉马草内生菌多样性研究未见报道。 1994 年 G. W.
Bruch等从醉马草幼苗中分离到内生菌[4],本课题组前期采用组织和研磨分离法从醉马草中分离到 89 株内
生细菌,与拟杆菌门 ( Bacteroidetes ),厚壁菌门 ( Firmicutes ),放线菌门 ( Proteobacteria ),放线菌门
(Actinobacteria)中的 8 个属的 16S rRNA 基因相似性达到 97%—100% ,主要优势种群为芽孢杆菌属
(Bacillus)。 本文通过构建 16S rRNA基因文库对醉马草内生细菌的组成及多样性进行分析,为深入研究醉马
草内生菌生态系统的功能微生物奠定基础,从而也为发挥醉马草积极作用等方面提供理论依据和基础资料。
1摇 材料和方法
1. 1摇 材料
1. 1. 1摇 样品
样品采于 2008 年 5 月和 7 月,采样地位于乌鲁木齐南山,海拔 1074—1700 m,东经 87毅21忆31义,北纬 43毅
36忆49义。 采用间隔 10m的 5 点取样法(东、南、西、北、中),每点选取供试草 1 株,每株草取根、茎、叶、种子(成
熟期),每种器官取样 2 个。 将样品装入无菌食品保鲜袋,带回实验室 4益保藏。
1. 1. 2摇 主要试剂和仪器
PCR仪为 Eppendorf AG 22331 Hamburg;PCR引物、TaqDNA 聚合酶和 PMD19鄄T Vector 载体购自 TaKaRa
公司;凝胶成像系统 GK鄄330C购自美国联合生物科技有限公司。
1. 2摇 醉马草的表面消毒[5]
分离前,将采回的样本用自来水洗净,并用无菌纸吸干水分,切取根、茎、叶成 1. 0 cm长的小段,将种子粒
从植株上剥离开再进行组织表面消毒。 分别取等量的根、茎、叶、种子先用自来水冲洗干净,再用无菌水冲洗
1 次;在 75%的乙醇浸泡 30s,然后在 0. 1%的升汞中浸泡 1min;无菌水淋洗 5 次,在无菌条件下晾干;取最后
一次淋洗水分别涂于 LB平板上,28益培养 72h,检测表面灭菌效果。
1. 3摇 醉马草总 DNA的提取
总 DNA的提取方法参见文献[5]并稍做修改:(1)将表面灭菌处理后的实验材料各取 1g 放入无菌研钵
中,适量添加液氮用力将醉马草组织研成粉末;(2)将 1g粉末转移至无菌离心管中,加入 9mL CTAB抽提缓冲
9712摇 8 期 摇 摇 摇 张雪兵摇 等:醉马草免培养内生细菌的多样性 摇
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液 (2%CTAB;100 mmol / L Tris鄄HCl pH 8. 0;1. 4mol / L NaCl;20mmol / L EDTA;1. 5% Polyvinyl鄄pyrrolidone,PVP;
0. 5% 2鄄mercaptoethanol )颠倒混匀;(3)60益水浴 45 min,期间颠倒混匀数次;(4)加入等体积的氯仿:异戊醇
(24:l),彻底混匀,4益,12000 r / min离心 10 min;(5)上清转移至无菌离心管,重复步骤 4 一次;(6)将上清转
移至无菌离心管,加入 2 / 3 体积预冷异丙醇混匀,-20益放置 2h;(7)4益,12000 r / min 离心 10 min,弃上清。
(8)沉淀用 70%乙醇洗涤脱盐,离心,弃上清;(9)干燥 DNA,加适量无菌水或 TE(Ph8. 0)溶解;(10)加入
RNase (使用前 100益煮沸 10 min 以灭活残留的 DNase)使终浓度达 50滋g / mL,37益水浴 30min;取出储存于
-20益备用。
1. 4摇 16S rRNA基因的 PCR扩增
分别以制得的 DNA和醉马草表面消毒时的最后一次淋洗水作为 PCR 扩增的模板,使用细菌通用引物
799f[6]:5忆鄄AACAGGATTAGATACCCTG鄄 3忆和 1492r[7]:5忆鄄GGTTACCTTGTTACGAC TT鄄 3忆。 PCR 反应体系(25
滋L):25 滋L Premix Taq,各 0. 5 滋L 引物 (l0滋mol / L),1 滋L DNA(100 ng),23 滋L ddH2O。 PCR反应条件:95益
4 min;94益 1 min,55益 1 min,72益 1. 5 min,30 个循环;72益 8 min。
1. 5摇 16S rRNA基因文库的构建
扩增后将 730 bp的条带用 PCR产物纯化试剂盒回收和纯化,并与 PMD19鄄T Vector载体连接,转化 E. coli
DH 5琢感受态细胞。 以氨苄青霉素(100 滋g / mL)抗性和蓝白斑筛选阳性转化子。 选择的阳性转化子进行扩
增,扩增引物,正向 Primer M13F( -47) 5忆鄄CgCCAgggTTTTCCCAgTCACgAC鄄3忆;反向 Primer M13R( -48 )5忆鄄
AgCggATAACAATTTCACACAggA鄄3忆。 PCR扩增条件:95益 8 min;94益 40 s,55益 40 s,72益 1. 5 min,共 30 个
循环;72益 7 min。 通过 1%的琼脂糖凝胶电泳进一步验证插入的外源片段应大约为 750 bp左右。
1. 6摇 酶切分析及 16S rRNA基因的序列测定
取 17. 5 滋L的 16S rRNA基因的菌落 PCR产物,加入 0. 5 滋L Hae 睾、2 滋L相应的 10伊M Buffer,使反应体
系为 20 滋L。 37益恒温过夜酶切。 酶切产物用 2. 5%琼脂糖凝胶进行电泳检测。 选取酶切图谱不同的克隆送
到上海生工生物技术有限公司进行 16S rRNA基因的直接测序(以 M13—47 为正向引物,M13—48 为下游引
物)。
1. 7摇 多样性指数分析
采用覆盖率(Coverage value, C),香农多样性指数(Shannon Index,H忆),辛普森指数(Simpson Index,D)对
16S rRNA基因克隆文库进行微生物多样性评价分析。 C 值理论上表示 16S rRNA 基因克隆文库中所包含的
微生物种类(OTU)占样品中全部微生物种类的比例。 C=1-n1 / N,N代表 16S rRNA克隆文库的库容,n1 代表
在 16S rRNA克隆文库仅出现一次的 OTU 的数量[8]。 香农多样性指数和辛普森指数的计算通过 Biodap
(BIODIVERSITY DATA ANALYSIS PACKAGE)软件进行分析[9]。
1. 8摇 基于 16S rRNA基因的系统发育树构建
通过 NCBI 的 VECTER SCREEN 去除测序所得的 16S rRNA 基因的载体片段,用 Blast 搜索程序从
GenBank数据库中调出相似性较高的相关菌株的 16S rRNA基因序列,用 CLUSTSL X 进行多序列比对[10],系
统进化距离矩阵根据 Kimura模型估算,用 MEGA 4. 0 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis)软件包采用邻
接法构建系统进化树[11]。 重复取样 1000 次进行自展值分析来评估系统进化树的拓扑结构的稳定性[12]。 本
研究中得到的序列已提交 GenBank数据库,收录号分别为 GU942752鄄GU942808。
2摇 结果
2. 1摇 样品总 DNA提取和 16S rRNA基因的 PCR扩增
提取的醉马草总 DNA片段较为完整,基因组片段大于 23kb(图 1鄄A)。 通过细菌 16S rRNA 基因特异性
PCR扩增,得到大小为 750bp左右的目的片段,同时还扩增出 1000bp 左右的片段,推测可能是醉马草线粒体
18S rRNA的部分序列,以醉马草表面消毒时的最后一次淋洗水作为 PCR 扩增的模板没有扩增出基因组的片
段,如图 1鄄B。
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摇 图 1摇 醉马草基因组 DNA (A) 和醉马草内生细菌 16S rRNA 的
基因片段的 PCR扩增结果(B)
Fig. 1摇 Agarose gel electrophoresis of total DNA of Achnatherum
inebrians (A) and the results of 16S rRNA amplification (B)
A: M:Lambda DNA Marker; Lane 1:醉马草基因组 DNA 电泳图.
B: M: Maker吁, Lane 1:醉马草内生细菌 16S rRNA 基因片段的
PCR扩增
2. 2摇 16S rRNA基因克隆文库阳性转化子的筛选与酶
切分析
从所构建的 16S rRNA基因文库中随机选择了 249
个阳性克隆,用质粒上的通用引物进行菌落 PCR 扩增,
扩增产物以六碱基限制性内切酶 Hae 睾 对大约 900bp
的阳性克隆插入片段(包括载体片段)进行酶切。 部分
酶切图谱检测结果如图 2。
由图 2 可见酶切产物得到片段大小在 100—700bp
之间,其总和都接近于未消化的 PCR 产物全长。 得到
了 57 个酶切图谱不同的克隆,送到上海生工生物技术
有限公司进行外源 PCR产物的直接测序。 根据酶切图
谱和克隆测序结果的不同,将 249 个克隆分为 57 个
OTUs。
2. 3摇 基因文库多样性指数分析
采用 coverage value, Shannon Index, Simpson Index
进行克隆文库的细菌多样性评价分析。 根据公式经计
算得到克隆文库的多样性指数。 克隆文库包含 249 个
克隆,覆盖率 ( Coverage C)为 93. 17% ,有 57 种 16S
rRNA基因型,香农多样性指数为 2. 96,均匀度为 0. 91,
图 2摇 醉马草内生细菌 16S rDNA克隆文库 RFLP分析
Fig. 2摇 RFLP analysis of 16S rDNA clone library
A: M: 50bp markerladder; 2—23: 16S rDNA PCR产物 Hae芋酶切图谱. B: M. :100bp markerladder; 16S rDNA PCR产物 Hae芋酶切图谱
辛普森指数为 0. 11,基本可以代表本醉马草样品的内生细菌多样性。 从稀有度曲线和文库覆盖率 Coverage C
为 93. 17%可以看出,文库已很接近饱和,表明这些克隆代表了文库中大多数细菌的多样。
2. 4摇 基于 16S rRNA基因序列的系统发育分析
选择 16S rRNA基因的不同酶切带型所对应的阳性克隆进行测序,序列比对表明 249 个阳性克隆序列分别
归属于细菌域的 4个类群:变形菌门(Proteobacteria),厚壁菌门(Firmicutes),放线菌门(Actinobacteria),拟杆菌
门(Bacteroidetes);分别归属于 25个不同科,布鲁氏菌科(Brucellaceae), 柄杆菌科(Caulobacteraceae),莫拉菌科
(Moraxellaceae),地杆菌科(Geobacteraceae),芽孢杆菌科(Bacillaceae),草酸杆菌科(Oxalobacteraceae),丛毛单胞
菌科 ( Comamonadaceae),黃色单胞菌科 (Xanthomonadaceae),火色杆菌科 ( Flammeovirgaceae),泉发菌科
(Crenotrichaceae),间孢囊菌科( Intrasporangiaceae),生丝微菌科(Hyphomicrobiaceae),黄杆菌科(Flavobacteriace鄄
ae),微单胞菌科(Micromonosporaceae),多囊菌科(Polyangiaceae),根瘤菌科(Rhizobiaceae),粘细菌科(Myxobac鄄
terium),微球菌科(Micrococcaceae),嗜甲基菌科(Methylophilaceae),假单胞菌科(Pseudomonadaceae),诺卡氏菌
1812摇 8 期 摇 摇 摇 张雪兵摇 等:醉马草免培养内生细菌的多样性 摇
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图 3摇 醉马草内生细菌 16S rDNA克隆文库稀有度曲线
摇 Fig. 3摇 Rarefaction curves generated for 6S rDNA of endophytic
bacterial in clone library
科(Nocardiaceae),假单胞杆菌科 (Pseudomonadaceae),
Ginsengiterrae,Cyclobacteriaceae,Cryomorphaceae。 文库中
65%的克隆分别与苍白杆菌属(Chrobactrum), 芽孢杆菌
属(Bacillus), 红球菌属(Rhodococcus),黄杆菌属(Fla鄄
vobacterium)等 31个属的细菌 16S rRNA基因相似性大于
96%;有 15%的克隆序列与 Promicromonospora,Nocardia,
Legionella和 Novosphingobium属的细菌的相似性分别在
93%—95%之间;还有约 8%的克隆序列与 Uncultured
bacteria的相似度较高,结果表明醉马草内生菌中还存在
新的分类单元。 变形杆菌门(Proteobacteria)是该克隆文
库中的优势类群,包含了 143 个克隆,占克隆文库的
57%;而其中 琢鄄proteobacteria 占克隆文库的 16%,酌鄄pro鄄
teobacteria占克隆文库的 8%,啄鄄proteobacteria 占克隆文库的 2%,着鄄proteobacteria 占克隆文库的 3%,而 茁鄄pro鄄
teobacteria的克隆最多为 70个,约占克隆文库的 28%。 厚壁菌门是该克隆文库的第二大优势类群,占克隆文库
的 12%,包含了 31个克隆子。 这些克隆子与 Bacillus 的细菌序列相似性在 98%以上, Bacillus 为该克隆文库中
的最优势菌属,与前期对醉马草内生菌可培养的研究结果一致。 放线菌门的细菌占克隆文库的 7%。 拟杆菌门
的细菌占克隆文库的 11%。 具体结果见表 1。
表 1摇 醉马草内生细菌 16S rRNA基因序列分析结果
Table 1摇 Distribution of 16S rRNA detected from endophytes in Achnatherum inebrians
分类
Group
OUT数 /个
Number
of OUTs
克隆子数 /个
Number
of clones
克隆子百分比
%Total
Clones
摇 摇 摇 比对结果
摇 摇 摇 Closest NCBI match
相似性
% Identity
Alpha鄄proteobacteria 5 40 0. 16
C1 19 0. 08 Ochrobactrum anthropi(AY917134) 90
C5 2 0. 01 Phenylobacterium lituiforme(NR_029117) 96
C19 5 0. 02 Brevundimonas sp. ( FJ197848) 99
C122 12 0. 05 Devosia insulae(EF012357) 97
C152 2 0. 01 Rhizobium galegae(Z79620) 100
Beta鄄proteobacteria 18 70 0. 29
C12 11 0. 04 Janthinobacterium agaricidamnosum(AY167838) 99
C13 9 0. 04 Acidovorax delafieldii(AB269774) 100
C58 2 0. 01 Massilia sp. ( FM955855) 99
C59 3 0. 01 Massilia brevitalea(EF546777) 93
C61 3 0. 01 Massilia aurea(AM231588) 99
C62 1 0. 01 Oxalicibacterium faecigallinarum(AB469788) 90
C123 1 0. 01 Beta proteobacterium(GU213399) 97
C139 2 0. 01 Pelomonas saccharophila(AM501432) 98
C149 3 0. 01 Polaromonas rhizosphaerae(EF127651) 99
C156 3 0. 01 Massilia niabensis(EU808006) 99
C157 1 0. 01 Janthinobacterium sp. (D84590. 2) 98
C166 4 0. 02 Oxalobacteraceae bacterium(DQ337591) 90
C170 1 0. 01 Herbaspirillum rubrisubalbicans(FJ605419) 94
C174 12 0. 05 Methylophilus freyburgensis(AJ517772) 99
C191 1 0. 01 Janthinobacterium lividum(EU275366) 90
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摇 摇 续表
分类
Group
OUT数 /个
Number
of OUTs
克隆子数 /个
Number
of clones
克隆子百分比
%Total
Clones
摇 摇 摇 比对结果
摇 摇 摇 Closest NCBI match
相似性
% Identity
C207 2 0. 01 Variovorax paradoxus(GQ920616) 100
C254 1 0. 01 Methylibium fulvum(AB245357) 98
C309 10 0. 04 Massilia timonae(AJ871463. 1) 98
Gamma鄄proteobacteria 5 20 0. 08
C6 8 0. 03 Acinetobacter johnsonii(GQ169068) 100
C25 4 0. 02 Lysobacter brunescens(GQ859167) 97
C57 2 0. 01 Xanthomonas albilineans(FP565176) 97
C77 4 0. 02 Perlucidibaca piscinae(DQ664237) 98
C226 2 0. 01 Pseudomonas thivervalensis(EU721607) 100
Delta鄄proteobacteria 4 5 0. 02
C7 1 0. 01 Geobacter bremensis(NR_026076. 1) 97
C146 2 0. 01 Sorangium cellulosum(GU299045. 1) 95
C160 1 0. 01 Myxobacterium(AB246770) 95
C271 1 0. 01 Geobacter bemidjiensis(CP001124) 98
Epsilon鄄proteobacteria 2 8 0. 03
C16 5 0. 02 Epsilon鄄proteobacterium(GQ354902) 94
C17 3 0. 01 Epsilon鄄proteobacterium(AB174846) 100
Flavobacteria 5 17 0. 12
C3 8 0. 09 Algoriphagus(AB197852) 93
C108 1 0. 03 Phycicoccus jejuensis(DQ345443) 93
C138 1 0. 01 Flavobacterium segetis(AY581115) 99
C155 5 0. 02 Flavisolibacter ginsengiterrae(AB267476) 93
C159 2 0. 01 Algoriphagus locisalis(AY835923) 93
Sphingobacteria 5 12 0. 05
C34 6 0. 02 Cyclobacteriaceae bacterium(FJ798610) 92
C55 2 0. 01 Niastella koreensis(DQ244077) 97
C69 1 0. 01 Terrimonas ferrugineum(AM230484) 97
C132 2 0. 01 Algoriphagus hitonicola(EF488486) 99
C133 1 0. 01 Sphingobacteriales bacterium(AB540003) 97
Bacilli 3 31 0. 12
C11 29 0. 11 Bacillus subtilis(GQ980239) 98
C204 1 0. 01 Bacillus niacini(EU221338) 99
C315 1 0. 01 Bacillus licheniformis(GU323372) 99
Actinobacteridae 5 17 0. 07
C144 1 0. 01 Actinoplanes nipponensis(AB047498) 94
C161 4 0. 02 Arthrobacter sulfonivorans(FM955888) 100
C268 5 0. 02 Rhodococcus sp. ( DQ337546) 99
C286 5 0. 02 Actinobacterium(GU167988) 99
Uncultured bacteria 5 19 0. 08
C30 3 0. 01 Uncultured marine bacterium clone(FJ826007) 99
C88 2 0. 01 Uncultured actinobacterium clone(EF220368) 99
C182 7 0. 03 Uncultured prokaryote clone(GU208351) 97
C224 1 0. 01 Uncultured bacterium clone(AF422685) 93
C225 6 0. 02 Uncultured Haliangiaceae bacterium clone (EU665118) 96
3812摇 8 期 摇 摇 摇 张雪兵摇 等:醉马草免培养内生细菌的多样性 摇
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根据 16S rRNA基因序列构建细菌系统发育树(图 4A), 归属于 琢鄄proteobacteria类群的 40 个克隆序列与
相应的已知细菌具有相近亲缘关系,包括 5 个 OTUs。 其中 19 个克隆序列与 Ochrobactrum anthropi 的细菌的
序列相似性为 90% ;2 个克隆与 Phenylobacterium lituiforme 序列相似性为 96% ;2 个克隆聚在 Rhizobium
galegae簇,与 Rhizobium galegae的序列相似性高达 100% ;7 个克隆与 Devosia insulae(EF012357)的序列相似
性为 97% ;有 5 个克隆序列 Brevundimonas sp.的细菌序列相似性分别为 99% 。
茁鄄proteobacteria是该文库中的最优势类群,包含 70 个克隆,代表了 18 个 OTUs。 其中有 11 个克隆序列与
Janthinobacterium agaricidamnosum(AY167838)的序列相似性高达 99% ,是该克隆文库中第二大优势菌属。 有
4812 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 31 卷摇
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图 4摇 Neighbor鄄joining法构建醉马草内生细菌 16S rDNA克隆文库系统发育树
Fig. 4摇 Neighbor鄄joining phylogenetic tree based on bacterial 16S rRNA gene clone library from Achnatherum inebrians
A: 琢 \变形菌门,茁鄄变形菌门,酌鄄变形菌门,啄鄄变形菌门,着鄄变形菌门, B:高 G+C革兰氏阳性菌,拟杆菌门,低 G+C革兰氏阳性菌
1 个克隆序列与 Oxalicibacterium faecigallinarum(AB469788)的序列相似性较低,为 90% 。 5 个克隆序列分别
与 Oxalobacteraceae bacterium(DQ337591) 和 Janthinobacterium lividum(EU275366)的序列相似性较低,均为
90% 。 有 29 个克隆分别与食酸菌属 Acidovorax delafieldii ( AB269774 )、 Massilia aurea ( AM231588 )、
Polaromonas rhizosphaerae( EF127651)、嗜甲基菌属 Methylophilus freyburgensis ( AJ517772)、Massilia niabensis
(EU808006)、Janthinobacterium sp. (D84590)、Pelomonas saccharophila(AM501432)的相似性均在 97%以上。
克隆文库中的 20 个克隆子聚在 酌鄄 proteobacteria簇,与其中的 5 个已知属的相似性在 97%以上。 各有一
个克隆子分别与 啄鄄proteobacteria 中的 Geobacter bremensis(NR_026076)、Myxobacterium(AB246770)、Geobacter
bemidjiensis(CP001124) 相似性在 95%以上。 着鄄 proteobacteria是本克隆文库中占 OUTs数最少的种群。
17 个克隆与放线菌门 ( Actinobacteria ) 系统发育关系密切,其中的 4 个克隆序列与 Arthrobacter
sulfonivorans的细菌序列相似性为 100% ,还有 10 个克隆序列与 Rhodococcus sp. (DQ337546)和 Actinobacterium
(GU167988)的序列相似性为 99% 。 1 个克隆序列与 Actinoplanes nipponensis(AB047498)的细菌的序列相似性
为 94% 。
21 个克隆与 Bacillus subtilis(GQ980239)聚在一起,其中有 29 个克隆序列与厚壁菌门的枯草芽孢杆菌属
5812摇 8 期 摇 摇 摇 张雪兵摇 等:醉马草免培养内生细菌的多样性 摇
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Bacillus subtilis(GQ980239)的序列相似性高达 98% ,是该克隆文库中第一大优势菌属。 29 个克隆分别属于拟
杆菌门(Bacteroidetes)的黄杆菌纲(Flavobacteria)和鞘脂杆菌纲(Sphingobacteria)。
3摇 讨论
本研究通过对醉马草内生细菌 16Sr RNA基因克隆文库酶切图谱分析,表明醉马草内生菌有丰富的多样
性。 克隆文库稀缺性曲线和 Coverage C值同样证明新疆内生细菌 16S rRNA基因克隆文库能较完整的反映醉
马草内生细菌的组成。 本课题前期采用可培养方法分离的醉马草内生细菌与 8 个已知属相似性高达 97%—
100% ,而本克隆文库中内生菌分别与变形菌门 ( Proteobacteria ),厚壁菌门 ( Firmicutes),放线菌门
(Actinobacteria),与拟杆菌门 (Bacteroidetes)四类细菌中的 31 个属相似性达 95%以上,由此可见醉马草内生
细菌多样性比较丰富。
构建的醉马草内生细菌克隆文库中优势类群为变形菌门(Proteobacteria),这与其他研究报道,水稻,玉
米,人参和野生芥末内生细菌[13鄄16]的优势类群相符;变形菌门(Proteobacteria)的各个亚类在不同植物内生细
菌种群中出现的几率是不同的,其中 琢鄄、茁鄄、酌鄄 Proteobacteria为群落中优势类群,然而 啄鄄、着鄄proteobacteria 亚类
报道却很少。 通过构建醉马草内生细菌克隆文库的方法证实醉马草内生细菌群落中同样存在 啄鄄和 着鄄
proteobacteria,只是在整个内生细菌群落中所占的比例很少。 与水稻和人参根部 16S rRNA 基因克隆文库的
优势菌属不同,本研究为芽孢杆菌(Bacillus)属,与醉马草内生细菌可培养研究结果[17]一致。 这可能与两者
所处环境不同有关,醉马草生长在年降水量少、温差大以及强光照等地带,Bacillus 属的细菌更加适应这种生
境[18]。 系统发育分析表明有 8%的克隆与不可培养细菌具有较高相似性,还有一些克隆与已知的可培养细
菌相似性较低,为 90%以下,这表明醉马草内生细菌种群中存在着丰富的未培养、或存活的但不可培养的细
菌,可能代表新的分类单元,所以研究结果表明构建细菌 16S rRNA克隆文库的方法在研究植物内生细菌群落
多样性是比较有效的。
本研究应用 16S rRNA基因克隆文库技术构建了新疆醉马草细菌 16S rRNA 克隆文库,进一步弄清了醉
马草体内微生态环境中内生细菌群落组成的基本情况。 但由于本研究只对醉马草细菌 16S rRNA克隆文库进
行了构建,而对醉马草内其他微生物类群缺乏全面认识,需要进一步研究。 因此要全面了解醉马草内生菌多
样性,还需要考虑醉马草的生态环境,综合分析醉马草内生菌构成,从而为醉马草内生菌的应用奠定基础。
利用免培养方法并不能完全、真实地反映环境微生物多样性,所以需要结合新的纯培养技术和分离方法
来更全面真实的认识植物微生态系统中微生物多样性及其功能。
致谢:野外采样工作得到孙健、胡蓉、朱莉、胡雯的帮助,在此一并致谢。
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7812摇 8 期 摇 摇 摇 张雪兵摇 等:醉马草免培养内生细菌的多样性 摇
ACTA ECOLOGICA SINICA Vol. 31,No. 8 April,2011(Semimonthly)
CONTENTS
The relationship between Populus euphratica忆s radial increment and groundwater level at the lower reach of Tarim River
AN Hongyan, XU Hailiang, YE Mao,et al (2053)
……………
…………………………………………………………………………………
Influence of elevation factor on soil profile texture configuration: a case study of the alluvial plain of Fengqiu County
TAN Manzhi, MI Shuxiao, LI Kaili, et al (2060)
………………
…………………………………………………………………………………
Effects of ozone on AsA鄄GSH cycle in soybean leaves WANG Junli, WANG Yan, ZHAO Tianhong, et al (2068)……………………
The effects of physical and chemical factors on the growth and lipid production of Chlorella
ZHANG Guiyan, WEN Xiaobin,LIANG Fang, et al (2076)
……………………………………………
………………………………………………………………………
Response of net productivity of masson pine plantation to climate change in North Subtropical Region
CHENG Ruimei, FENG Xiaohui, XIAO Wenfa, et al (2086)
…………………………………
………………………………………………………………………
Soil respiration of Zoysia matrella turfgrass in subtropics LI Xibo,YANG Yusheng,ZENG Hongda,et al (2096)………………………
Effect of UV鄄B radiation on the leaf litter decomposition and nutrient release of Pinus massoniana
SONG Xinzhang, ZHANG Huiling, JIANG Hong, et al (2106)
……………………………………
……………………………………………………………………
Physiological ecological effect of endophyte infection on Achnatherum sibiricum under drought stress
HAN Rong, LI Xia, REN Anzhi, et al (2115)
…………………………………
……………………………………………………………………………………
Zinc Tolerance and Accumulation Characteristics of Armillara mellea ZHU Lin,CHENG Xianhao,LI Weihuan,et al (2124)…………
Expansion strategies of Caragana stenophylla in the arid desert region
ZHANG Jianhua, MA Chengcang, LIU Zhihong, et al (2132)
…………………………………………………………………
……………………………………………………………………
Effects of mixed plant residues from the Loess Plateau on microbial biomass carbon and nitrogen in soil
WANG Chunyang, ZHOU Jianbin, XIA Zhimin,et al (2139)
………………………………
………………………………………………………………………
Survival strategy of Stipa krylovii and Agropyron cristatum in typical steppe of Inner Mongolia
SUN Jian, LIU Miao, LI Shenggong, et al (2148)
…………………………………………
…………………………………………………………………………………
Spatial distribution of arbuscular mycorrhizal fungi in Salix psammophila root鄄zone soil in Inner Mongolia desert
HE Xueli, YANG Jing, ZHAO Lili (2159)
……………………
…………………………………………………………………………………………
An experimental study on the the effects of different diurnal warming regimes on single cropping rice with Free Air Temperature
Increased (FATI) facility DONG Wenjun, DENG Aixing, ZHANG Bin, et al (2169)…………………………………………
Endophytic bacterial diversity in Achnatherum inebrians by culture鄄independent approach
ZHANG Xuebing, SHI Yingwu,ZENG Jun, et al (2178)
………………………………………………
…………………………………………………………………………
Hierarchical Partial Least Squares (Hi_PLS) model analysis of the driving factors of Henan忆s Ecological Footprint (EF) and its
development strategy JIA Junsong (2188)…………………………………………………………………………………………
Evaluation on spatial distribution of soil salinity and soil organic matter by indicator Kriging in Yucheng City
YANG Qiyong,YANG Jinsong,YU Shipeng (2196)
…………………………
…………………………………………………………………………………
The toxicity of lupeol of Inula britanica on Tetranychus cinnabarinus and its effects on mite enzyme activity
DUAN Dandan,WANG Younian,CHENG Jun,et al (2203)
…………………………
…………………………………………………………………………
Abundance and biodiversity of ammonia鄄oxidizing archaea and bacteria in littoral wetland of Baiyangdian Lake, North China
YE Lei, ZHU Guibing, WANG Yu, et al (2209)
………
…………………………………………………………………………………
Changes of leaf water potential and water absorption potential capacities of six kinds of seedlings in Karst mount area under
different drought stress intensities: Taking six forestation seedlings in karst Mountainous region for example
WANG Ding,YAO Jian,YANG Xue,et al (2216)
……………………
…………………………………………………………………………………
Comparison of structure and species diversity of Eucalyptus community LIU Ping, QIN Jing, LIU Jianchang, et al (2227)…………
Ecosystem services valuation of the Haihe River basin wetlands JIANG Bo,OUYANG Zhiyun,MIAO Hong,et al (2236)……………
Effects of Phragmites australis on methane emission from a brackish estuarine wetland MA Anna, LU Jianjian (2245)………………
Genetic differentiation and the characteristics of uptake and accumulation of lead among Camellia sinensis populations under
different background lead concentrations of soils in Yunnan,China
LIU Shengchuan, DUAN Changqun, LI Zhenhua, et al (2253)
………………………………………………………………
……………………………………………………………………
Comparison of zooplankton lists between Coilia mystus food contents and collections from the Yangtze River Estuary & Hangzhou
Bay LIU Shouhai,XU Zhaoli (2263)………………………………………………………………………………………………
Reconstruction and analysis of July鄄September precipitation in Mt. Dagangshan, China
QIAO Lei, WANG Bing, GUO Hao, et al (2272)
…………………………………………………
…………………………………………………………………………………
Analysis on economic and ecological benefits of no鄄tillage management of Carya cathayensis
WANG Zhengjia, HUANG Xingzhao, TANG Xiaohua, et al (2281)
…………………………………………
………………………………………………………………
GIS鄄based analysis of the accessibility of urban forests in the central city of Guangzhou, China
ZHU Yaojun,WANG Cheng,JIA Baoquan,et al (2290)
………………………………………
……………………………………………………………………………
Review and Monograph
Impact factors and uncertainties of the temperature sensitivity of soil respiration
YANG Qingpeng, XU Ming,LIU Hongsheng,et al (2301)
………………………………………………………
…………………………………………………………………………
The advance of allometric studies on plant metabolic rates and biomass
CHENG Dongliang,ZHONG Quanlin, LIN Maozi, et al (2312)
…………………………………………………………………
……………………………………………………………………
Practice and the research progress on eco鄄compensation for cultivated land MA Aihui,CAI Yinying,ZHANG Anlu (2321)…………
Discussion
Soil water holding capacities and infiltration characteristics of three vegetation restoration models in dry鄄hot valley of Yuanmou
LIU Jie, LI Xianwei, JI Zhonghua, et al (2331)
………
……………………………………………………………………………………
Scientific Note
Effects of secondary, micro鄄 and beneficial elements on rice growth and cadmium uptake
HU Kun, YU Hua, FENG Wenqiang, et al (2341)
……………………………………………
…………………………………………………………………………………
2009 年度生物学科总被引频次和影响因子前 10 名期刊绎
(源于 2010 年版 CSTPCD数据库)
排序
Order
期刊 Journal
总被引频次
Total citation
排序
Order
期刊 Journal
影响因子
Impact factor
1 生态学报 11764
2 应用生态学报 9430
3 植物生态学报 4384
4 西北植物学报 4177
5 生态学杂志 4048
6 植物生理学通讯 3362
7
JOURNAL OF INTEGRATIVE
PLANT BIOLOGY
3327
8 MOLECULAR PLANT 1788
9 水生生物学报 1773
10 遗传学报 1667
1 生态学报 1. 812
2 植物生态学报 1. 771
3 应用生态学报 1. 733
4 生物多样性 1. 553
5 生态学杂志 1. 396
6 西北植物学报 0. 986
7 兽类学报 0. 894
8 CELL RESEARCH 0. 873
9 植物学报 0. 841
10 植物研究 0. 809
摇 绎《生态学报》 2009 年在核心版的 1964 种科技期刊排序中总被引频次 11764 次,全国排名第 1; 影响因
子 1郾 812,全国排名第 14;第 1 ~ 9 届连续 9 年入围中国百种杰出学术期刊; 中国精品科技期刊
摇 摇 编辑部主任: 孔红梅摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 执行编辑: 刘天星摇 段摇 靖
生摇 态摇 学摇 报
(SHENGTAI摇 XUEBAO)
(半月刊摇 1981 年 3 月创刊)
第 31 卷摇 第 8 期摇 (2011 年 4 月)
ACTA ECOLOGICA SINICA
摇
(Semimonthly,Started in 1981)
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Vol郾 31摇 No郾 8摇 2011
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