全 文 ：
　 　 　 　 　 生 态 学 报
　 　 　 　 　 　 　 (SHENGTAI XUEBAO)
　 　 第 31 卷 第 5 期　 　 2011 年 3 月　 (半月刊)
目　 　 次
盐胁迫下 3 种滨海盐生植物的根系生长和分布 弋良朋,王祖伟 (1195)…………………………………………
蕙兰病株根部内生细菌种群变化 杨　 娜,杨　 波 (1203)…………………………………………………………
森林不同土壤层全氮空间变异特征 张振明,余新晓,王友生,等 (1213)…………………………………………
基于生态位模型的秦岭山系林麝生境预测 罗　 翀,徐卫华,周志翔,等 (1221)…………………………………
黑河胜山国家自然保护区红松和红皮云杉生长释放判定及解释 王晓春,赵玉芳 (1230)………………………
两种大型真菌菌丝体对重金属的耐受和富集特性 李维焕,于兰兰,程显好,等 (1240)…………………………
2005—2009 年浙江省不同土地类型上空对流层 NO2变化特征 程苗苗,江　 洪,陈　 健,等 (1249)…………
关帝山天然次生针叶林林隙径高比 符利勇,唐守正,刘应安 (1260)……………………………………………
鄱阳湖湿地水位变化的景观响应 谢冬明,郑　 鹏,邓红兵,等 (1269)……………………………………………
模拟氮沉降对华西雨屏区撑绿杂交竹凋落物分解的影响 涂利华,戴洪忠,胡庭兴,等 (1277)…………………
喷施芳香植物源营养液对梨树生长、果实品质及病害的影响 耿　 健,崔楠楠,张　 杰,等 (1285)……………
不同覆膜方式对旱砂田土壤水热效应及西瓜生长的影响 马忠明,杜少平,薛　 亮 (1295)……………………
干旱胁迫对玉米苗期叶片光合作用和保护酶的影响 张仁和,郑友军,马国胜,等 (1303)……………………
不同供水条件下冬小麦叶与非叶绿色器官光合日变化特征 张永平,张英华,王志敏 (1312)…………………
水分亏缺下紫花苜蓿和高粱根系水力学导度与水分利用效率的关系 李文娆 ,李小利,张岁岐,等 (1323)…
美洲森林群落 Beta多样性的纬度梯度性 陈圣宾,欧阳志云,郑　 华,等 (1334)………………………………
水体泥沙对菖蒲和石菖蒲生长发育的影响 李　 强,朱启红,丁武泉,等 (1341)…………………………………
蚯蚓在植物修复芘污染土壤中的作用 潘声旺,魏世强,袁　 馨,等 (1349)………………………………………
石榴园西花蓟马种群动态及其与气象因素的关系 刘　 凌,陈　 斌,李正跃,等 (1356)…………………………
黄山短尾猴食土行为 尹华宝,韩德民,谢继峰,等 (1364)…………………………………………………………
扎龙湿地昆虫群落结构及动态 马　 玲,顾　 伟,丁新华,等 (1371)………………………………………………
浙江双栉蝠蛾发生与土壤关系的层次递进判别分析 杜瑞卿,陈顺立,张征田,等 (1378)………………………
低温导致中华蜜蜂后翅翅脉的新变异 周冰峰,朱翔杰,李　 月 (1387)…………………………………………
双壳纲贝类 18S rRNA基因序列变异及系统发生 孟学平,申　 欣,程汉良,等 (1393)…………………………
基于物理模型实验的光倒刺鲃生态行为学研究 李卫明,陈求稳,黄应平 (1404)………………………………
中国铁路机车牵引能耗的生态足迹变化 何吉成 (1412)…………………………………………………………
城市承载力空间差异分析方法———以常州市为例 王　 丹,陈　 爽,高　 群,等 (1419)…………………………
水资源短缺的社会适应能力理论及实证———以黑河流域为例 程怀文,李玉文,徐中民 (1430)………………
寄主植物叶片物理性状对潜叶昆虫的影响 戴小华,朱朝东,徐家生,等 (1440)…………………………………
专论与综述
C4作物 FACE( free-air CO2 enrichment)研究进展 王云霞,杨连新,Remy Manderscheid,等 (1450)……………
研究简报
石灰石粉施用剂量对重庆酸雨区受害马尾松林细根生长的影响 李志勇,王彦辉,于澎涛,等 (1460)…………
女贞和珊瑚树叶片表面特征的 AFM观察 石　 辉,王会霞,李秧秧,刘　 肖 (1471)……………………………
期刊基本参数:CN 11-2031 / Q*1981*m*16*284*zh*P* ￥ 70． 00*1510*32*2011-03
生 态 学 报 2011,31(5):1203—1212
Acta Ecologica Sinica
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基金项目:中国科学院创新专项(KSCX2鄄YW鄄Z鄄0702鄄5)
收稿日期:2010鄄05鄄25; 摇 摇 修订日期:2011鄄01鄄17
*通讯作者 Corresponding author. E鄄mail: yangbo@ wbgcas. cn
蕙兰病株根部内生细菌种群变化
杨摇 娜1,2, 杨摇 波1,*
(1.中国科学院武汉植物园,中国科学院植物种质创新与特色农业重点实验室,武汉摇 430074;
2.中国科学院研究生院, 北京摇 100049)
摘要:为了研究褐斑病与蕙兰根部内生细菌群落结构和多样性的关联,从野生蕙兰健株和褐斑病株根部分离出内生细菌 112
株,采用核糖体 DNA扩增片段限制性酶切分析(ARDRA),研究了健株和病株内生细菌多样性与群落结构。 将内生细菌纯培养
物扩增近全长的 16S rDNA,并用 ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) 对所分离的菌株进行分型,根据酶切图
谱的差异,将健株中的内生细菌分成 8 个 ARDRA型,病株分成 13 个 ARDRA型。 并选取代表性菌株进行 16S rDNA序列测定。
结果表明,健株分离出内生细菌 6 个属,优势菌群为 Bacillus;病株分离出 11 个属,优势菌群为 Mitsuaria和 Flavobacterium。 通过
回接兰花植物和初步拮抗实验发现,从病株分离出的 H5 号菌株 (Flavobacterium resistens)使兰花产生病症,而健株中的 B02
(Bacillus cereus) 和 B22 号菌株 (Burkholderia stabilis) 对菌株 H5 有拮抗作用。
关键词:蕙兰;内生细菌;群落结构;ARDRA;16S rDNA
Population dynamics of endophytic bacteria isolated from the roots of infected
Cymbidium faberi
YANG Na1,2, YANG Bo1,*
1 Key Laboratory of Plant Germplasm Enhancement and Speciality Agriculture, Wuhan Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Wuhan
430074, China
2 Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
Abstract: A study was conducted to investigate the community structure and the diversity of culturable endophytic bacteria
in the root tissues of healthy and diseased plants of Cumbidium faberi Rolfe collected from Hubei Province of China. The
endophytic bacteria were identified by characterization of cultural features, and some molecular features using methods of
amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA) and sequence homology comparisons. Results showed that a total of
112 bacterial isolates were obtained, 53 strains from healthy plants and 59 strains from diseased plants of C. faberi. The
amount of bacteria reached 1. 33伊105cfu / g in healthy plants, whereas was 1. 21伊104cfu / g in the plants infected with brown
spot disease. The number of endophytic bacteria decreased in the diseased plants. Comparison of the AluI鄄restriction
patterns of the 16S rDNA sequence showed that 112 bacterial isolates from diseased plants could be grouped into 13
operational taxonomic units (OTUs). The OTU10 and OTU11 were the major groups accounting for 13 and15 isolates,
respectively. The bacterial isolates from healthy plants could be grouped into 8 OTUs and OTU1 was the major group
accounting for 24 isolates. The representative strains for these OUTs were selected for characterization of the 16S rDNA
sequences. Phylogenetic analysis on the basis of the 16S rDNA sequences from this study and from related bacterial species
in the GenBank database showed that the representative bacterial isolates from the healthy plants of C. faberi belonged to six
genera, Bacillus, Rhizobium, Burkholderia, Paenibacillus, Pseudomonas and Microbacterium. The genus Bacillus was the
dominant bacteria, followed by Paenibacillus and Burkholderia. The bacterial isolates from diseased plants of C. faberi
belonged to eleven genera, Mitsuaria, Flavobacterium, Bacillus, Enterobacter, Brevundimonas, Pedobacter, Burkholderia,
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Sphingomonas, Mucilaginibacter, Pseudomonas and Microbacterium. The dominant genera were Mitsuaria and
Flavobacterium, followed by Burkholderia. The phylogenetic diversity of endophytic bacteria in diseased plants of C. faberi
were different from that in healthy plants of C. faberi. Results also showed that the diversity of the endophytic bacterial
community from diseased plants of C. faberi was higher than that in healthy plants of C. faberi. The dominant OTUs from
diseased plants were suspected to be pathogens of C. faberi. Thus, representative bacterial isolates were selected to
inoculate healthy plants of C. faberi, Ascocentrum ampullaceum and Cymbidium goeringii. Results showed that isolate H5 of
Flavobacterium resistens from a diseased plant of C. faberi was pathogenic on leaves of C. faberi, Ascocentrum ampullaceum
and Cymbidium goeringii. The endophytic bacterial isolates B02 of Bacillus cereus and B22 of Burkholderia stabilis from
healthy plants were found to be antagonistic to the isolate H5 of F. resistens. These results indicate that the endophytic
bacterial community in healthy plants and diseased plants of C. faberi differs greatly and the difference may be the cause
responsible for brown spot disease in C. faberi.
Key Words: Cymbidium faberi; endophytic bacterial; community structure; ARDRA; 16S rDNA
植物内生细菌(Endophytic bacteria)是指能在健康植物组织内栖居而对植物不造成实质性危害,并与植物
建立了和谐联合关系的微生物[1鄄2],是植物微生态系统中的重要组成成分。 研究表明,植物内生细菌具有防
病[3]、固氮[4]、促生[5]、促进植物合成多种生长激素[6]、增强宿主植物的抗逆性[7]等生物学作用。 因此,内生
细菌在促生和生防方面具有重要作用。
蕙兰(Cymbidium faberi Rolfe)为兰科兰属多年生地生植物,在迁地保育过程中,由于微生态环境的变化,
造成保育率极低,而内生菌又是微生态系统中的重要组成成分,所以我们要对兰花内生菌进行研究。 目前,对
兰科植物微生态系统中的微生物研究主要集中在与兰花根共生的菌根真菌,而对内生细菌的研究较少,有关
蕙兰内生细菌种群及其动态的研究,国内外未见报道。 本文对蕙兰病株内生细菌的种群变化进行了研究,试
图揭示健株与病株内生细菌群落结构的差异,对进一步了解蕙兰抗病性具有重要意义。
1摇 材料与方法
1. 1摇 样品的采集
2009 年 9 月于湖北省随州大洪山(31毅49忆 37义N,113毅02忆60义E)采集蕙兰健株和褐斑病株,当天带回实验室
进行内生细菌的分离。
1. 2摇 培养基、主要试剂与仪器
R2A培养基:酵母粉 0. 5g,胰蛋白胨 1g,蔗糖 0. 5g,淀粉 0. 5g,磷酸氢二钾 0. 3g,硫酸镁 0. 024g,丙酮酸钠
0. 3g,琼脂 15g,水 1000mL,pH 7. 2。
PCR 试剂、限制性内切酶等购自 TaKaRa公司。 PCR仪(Bio鄄Rad公司,S1000TMThermal Cycler),凝胶成像
分析仪(Bio鄄Rad公司,Gel鄄DOCTM XR)。
1. 3摇 内生细菌的分离与纯化
将采回的样品用水冲洗干净,分别称取健株与病株 2 年生根 1g,用 1%的次氯酸钠消毒 3min,然后用无菌
水冲洗 3 次,再将表面杀菌后的兰根置于灭菌的研钵中充分研磨,加入 10 mL 无菌水,静止 15min,再将上清
液按梯度稀释到 10-4,取 0. 1 mL各个梯度的碾磨液涂布于 R2A平板上,每个处理重复 3 次,28益暗培养。 取
最后一次冲洗液 0. 1 mL涂布平板进行培养,作为表面消毒的对照。
选择菌落数在 30—100 范围的平板,将所有单菌落分别转接划线在 R2A 平板上,纯化后接斜面于 4益
保存。
1. 4摇 内生细菌的生理生化性状测定
观察菌落的颜色、大小、光泽度、边缘、透明度、凸起的形状等。 生理生化实验测试了内生细菌碳源利用和
酶活反应,方法参照 API 20NE及其操作程序。
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1. 5摇 PCR扩增
1. 5. 1摇 PCR反应简易模板的制备
用热裂解法快速提取细菌总 DNA[8]。 菌株在 R2A平板上 28益活化培养 12—24h,用接种环挑取单菌落
少许至 20滋L无菌 ddH2O中,95益水浴 10min,立即置于冰上 2min,10 000伊g 瞬时高速离心,取上清液 2滋L作
为 PCR反应模板。
1. 5. 2摇 16S rDNA扩增
采用细菌通用引物(27f, 5忆鄄GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG鄄 3忆和 1495r,5忆鄄CTACGGCTACCTTGTTACGA鄄
3忆),由 Invitrogen公司合成,用于分离物的 16S rDNA扩增。 扩增体系为 20 滋L:ddH2O 11. 9 滋L,DNA模板 2郾 0
滋L,引 物 (150 ng / 滋L) 各 1. 0 滋L, dNTPs (10 mmol / L) 0. 4 滋L,10伊buffer 2. 0 滋L,MgCl2(25 mmol / L) 1郾 2
滋L,Taq酶(1U / 滋L) 0. 5 滋L。 PCR扩增条件:95益预变性 90 s,94益变 30 s,60益退火 30 s, 72益延伸 2 min,5
次循环,95 益 30 s,55 益 30 s,72 益 2 min,5 次循环;95 益 30 s,50 益 30 s,72 益 2min,25 次循环;72 益 10
min,1. 2%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR扩增产物。
1. 6摇 核糖体 DNA扩增片段限制性酶切分析 (ARDRA)
酶切反应体系为:PCR产物 5 滋L,限制性内切酶 Alu I (10 U / 滋L) 0. 3 滋L,10伊buffer 2 滋L,ddH2O补充体
系至 20 滋L,37 益酶切 4 h。 酶切产物用 2. 5%琼脂糖凝胶电泳检测后进行酶切带型的分析[9]。
1. 7摇 16S rDNA扩增产物的测序及系统发育树的构建
根据 ARDRA酶切图谱的差异进行分析聚类,划分为不同的操作分类单元(Operational Taxonomic Unit,
OTU)。 选取每个 OTU中的代表性菌株进行 16S rDNA扩增, PCR产物由北京六合华大基因科技股份有限公
司完成纯化和测序工作。
根据测序结果,从 GenBank数据库中,选取同源性较高的相似序列,用 MEGA4. 1 软件分析和构建系统发
育树[10]。
1. 8摇 回接植物实验
将分离出来的代表性菌株在 R2A平板上活化 12—24h,选取无菌的兰花组培苗,置于事先灭菌的培养皿
中。 采用针刺法接种,用接种针分别挑取代表性菌株回接到兰花叶片上,每个叶片接种 3 个点,25益 恒温保
湿培养,以无菌水接种健康叶片作为对照。 观察对兰花的影响情况。
1. 9摇 拮抗实验
把通过回接试验使兰花产生病症的菌株接种到液体 R2A 培养基中,30益、140r / min 恒温摇床培养 12—
24h。 取 100滋L菌悬液涂布在灭过菌的 R2A固体平板上,点上待测菌株,用无菌水做对照,放在 28 益温箱中
培养,观察抑菌圈的有无,记录实验结果。
2摇 结果
2. 1摇 蕙兰内生细菌的分离
分别对蕙兰健株和病株进行内生细菌的分离,结果表明,健株根部可培养内生细菌数量为 1. 3伊105cfu / g,
而病株数量仅为 1. 2伊104cfu / g。 选择菌落数在 30—100 范围的稀释度平板,将同一平板上的所有单菌落分别
进行分离纯化,共得到 112 株纯培养物,其中健株分离出 59 株,病株分离出 53 株。
2. 2摇 内生细菌的 ARDRA分析
将 112 株纯培养物分别制备 PCR简易模板,扩增近全长的 16S rDNA,共获得约 1400bp 的目的片段。 用
限制性内切酶 Alu玉对 PCR扩增产物进行酶切,根据酶切图谱的差异聚类,每一个特有的 ARDRA类型代表一
个操作分类单元(OTU)。 将健株内生细菌划分为 8 个不同的 OTU,即 OTU1—OTU8(图 1),属于 OTU1 的有
24 个菌株,占总细菌数的 40. 67% ,为优势菌群;OTU3 和 OTU7 各含 11、9 个菌株,分别占总细菌数的
18郾 64% 、15. 25% ,为次优势种群。 病株划分为 13 个不同的 OTU,即 OTU9—OTU21(图 2),属于 OTU11 和
OTU10 的各含 15、13 个菌株,分别占总细菌数的 28. 30% 、24. 53% ,为优势种群,OTU16 有 5 个菌株,占总细
5021摇 5 期 摇 摇 摇 杨娜摇 等:蕙兰病株根部内生细菌种群变化 摇
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菌数的 9. 43% ,为次优势种群。
图 1摇 蕙兰健株内生细菌 ARDRA类型
摇 Fig. 1 摇 Agarose gel electrophoresis of amplified 16S rDNA
digested with endonuclease Alu I from 59 strains isolated from
healthy plant
图 2摇 蕙兰病株内生细菌 ARDRA类型
摇 Fig. 2 摇 Agarose gel electrophoresis of amplified 16S rDNA
digested with endonuclease Alu I from 53 strains isolated from
infected plant
2. 3摇 16S rDNA 序列相似性比较及系统发育分析
根据 ARDRA结果,选取每个 OTU 中的代表性菌株,测定其 16S rDNA 序列,将分离菌株的 16S rDNA 序
列在 GenBank数据库中进行相似性比较,选取同源性较高的菌株并与之构建系统发育树(表 1,图 3)。 结果
表明:健株中的 8 个 OTU分别属于芽孢杆菌属(Bacillus)、根瘤菌属(Rhizobium)、
表 1摇 蕙兰内生细菌 OTUs代表性菌株序列相似性比较
Table 1 摇 16S rDNA sequence similarity between representative strains from each OTU and reference taxa (B represent the endophytic bacteria
isolated from healthy plant; H represent the endophytic bacteria isolated from infected plant)
操作分类单元
OTUs
代表性菌株登录号
Representative strain
GenBank Acc. No.
最相似菌株
The closest NCBI match
相似性
Similarity / %
菌株数 /个
No. of strains
比例
/ %
OTU1 B02 Bacillus cereus(GQ199591) 100 24 40. 67
OTU2 B09 Rhizobium tibeticum(EU256404) 99. 4 2 3. 39
OUT3 B22 Burkholderia stabilis(AF148554) 99. 4 11 18. 46
OTU4 B13 Bacillus megaterium(D16273) 99. 2 4 6. 78
OTU5 B05 Microbacterium flavescens(AB004716) 99. 3 1 1. 69
OTU6 B50 Pseudomonas frederiksbergensis(AJ249382) 99. 6 5 8. 47
OTU7 B48 Paenibacillus phyllosphaerae (AY598818) 95. 1 9 15. 25
OTU8 B15 Paenibacillus pabuli (AB073191) 99. 4 3 5. 08
OTU9 H1 Bacillus aryabhattai (EF114313) 100 4 7. 55
OTU10 H5 Flavobacterium resistens (EF575563) 97. 4 13 24. 53
OTU11 H3 Mitsuaria chitosanitabida (AB006851) 99. 2 15 28. 30
OTU12 H6 Pedobacter sp. A48 (EU194884) 97. 0 1 1. 87
OTU13 H20 Bacillus stratosphericus (AJ831841) 99. 9 1 1. 87
OTU14 H12 Enterobacter hormaechei (AJ508302) 98. 5 2 3. 77
OTU15 H10 Brevundimonas bullata (D12785) 99. 4 1 1. 87
OTU16 H31 Burkholderia sediminicola (EU035613) 99. 7 5 9. 43
OTU17 H38 Sphingobium amiense (AB047364) 98. 1 1 1. 87
OTU18 H40 Microbacterium esteraromaticum (Y17231) 99. 7 2 3. 77
OTU19 H43 Flavobacterium chungangense(EU924275) 98. 4 3 5. 66
OTU20 H45 Mucilaginibacter kameinonensis(AB330392) 98. 8 4 7. 55
OTU21 H48 Pseudomonas nitroreducens(AM088474) 99. 5 2 3. 77
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伯克氏属 ( Burkholderia )、 类芽孢杆菌属 ( Paenibacillus )、 假单胞菌属 ( Pseudomonas ) 和微杆菌属
(Microbacterium),共 6 个属。 其中优势菌群为 Bacillus,次优势菌群为 Paenibacillus 和 Burkholderia。 病株中的
13 个 OTU分别属于 Mitsuaria、黄杆菌属(Flavobacterium)、Bacillus、肠杆菌属(Enterobacter)、Brevundimonas、
Pedobacter、Burkholderia、Sphingomonas、Mucilaginibacter、Pseudomonas、Microbacterium,共 11 个属。 其中优势菌
群为 Flavobacterium和 Mitsuaria,次优势菌群为 Burkholderia。 各 OTU类群中代表性菌株的主要生理生化特征
与其所归属的属也基本吻合(表 2,表 3)。
图 3摇 基于 16S rDNA序列同源性的蕙兰内生细菌系统发育树
Fig. 3摇 Phylogenetic tree of endophytic bacteria from Cymbidium faberi based on 16S rDNA sequences
Numbers in parentheses are the GenBank accession numbers; Bar indicates 1% sequence divergence. Bootstrap supporting values are shown at
branch nodes
2. 4摇 蕙兰病株与健株根部内生细菌差异
蕙兰健株中分离出来的内生细菌种类比病株的少,健株中优势种群为 Bacillus,而病株为 Flavobacterium
和 Mitsuaria(图 4)。
7021摇 5 期 摇 摇 摇 杨娜摇 等:蕙兰病株根部内生细菌种群变化 摇
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表 2摇 代表菌株碳源利用
Table 2摇 Carbon source utilization among representative strains
碳源 Carbon source B02 B09 B22 B13 B05 B50 B48 B15 H1 H5 H3 H6 H20 H12 H10 H31 H40 H43 H45
D鄄葡萄糖 D鄄glucose + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
L鄄阿拉伯糖 L鄄arabinose - + + + + + + + + + + + + + - + - + +
D鄄甘露糖 D鄄mannose - + + - + + - - - + + - + + - - + + -
D鄄甘露醇 D鄄mannitol - + + + + + + + + + + + + + - + + - +
N 鄄乙酰氨基葡萄糖
N鄄acetyl鄄glucosamine + - + + + + + + + + + + + + + + + + +
D鄄麦芽糖 D鄄maltose + - - + + + + + + + + + - + + + + + +
葡萄糖酸钾 Potassium gluconate + + + + + + + + + - + + + + - + + - +
癸酸 Capric acid - - + - - + - - - - - - + - + - - - -
己二酸 Adipic acid - - + - - - + - - - - - - - - - - - -
苹果酸 Malic acid + + + + + + + - + - + + + + + + - - +
柠檬酸钠 Trisodium citrate + + + + + + + - + - + + + + - + - - +
苯乙酸 Phenylacetic acid - - + - - - + - - - - - - + - - - - -
摇 摇 +: 阳性 positive;-: 阴性 negative
表 3摇 代表菌株酶活反应
Table 3摇 The result of enzyme activity test among representative strains
活性成分 Active ingredients B02 B09 B22 B13 B05 B50 B48 B15 H1 H5 H3 H6 H20 H12 H10 H31 H40 H43 H45
硝酸钾 Potassium nitrate + + - + - - - + + + + + + + + + + - -
色氨酸 Tryptophane - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
D鄄葡萄糖 D鄄glucose - - - - - - - - - - - - - + - - - - -
精氨酸二水解酶
Arginine Dihydrolase - - - - - - - - - - - - - + - - - - -
尿素酶 UREase - + - - - - + - - - - - - + - - - - -
半乳糖苷酶 茁鄄glucosidase + + + + + + - + + + + + + + + + + + +
蛋白酶 Protease + - + + - + + - + - + + + + - + + + +
半乳糖苷酶 茁鄄galactosidase - + + + + + - + + + + + + + + + + + +
细胞色素氧化酶
Cytochrome oxidase + + + - - + - + - + + - + - + - - + -
摇 摇 +: 阳性 positive;-: 阴性 negative
图 4摇 蕙兰根部内生细菌数量及种类的变化
Fig. 4摇 Shifts in the endophytic bacteria diversity in response to pathogen infection in the root tissues of Cymbidium faberi
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2. 5摇 回接植物与拮抗实验
将分离出的代表性菌株回接兰花,结果显示从病株中分离出的 H5 号菌株接种 2d 后叶片开始出现斑点
状,并逐渐扩展为深褐色,部分兰花周围有水渍状晕圈(图 5—图 7)。 对照叶片未见症状(图 8—图 10)。
图 5摇 菌株 H5 回接蕙兰
Fig. 5摇 Strain H5 inoculate Cymbidium faberi
图 6摇 H5 菌株回接鸟舌兰
Fig. 6摇 Strain H5 inoculate Ascocentrum ampullaceum
图 7摇 菌株 H5 回接金边春兰
Fig. 7摇 Strain H5 innoculate Cymbidium goeringii
图 8摇 回接金边春兰实验对照
摇 Fig. 8 摇 Symptom produced on Cymbidium goeringii plant by
inoculation of distilled water
把分离出来的菌株与 H5 菌株做拮抗实验,结果发现,从健株分离出来的 B22 和 B02 菌株对 H5 菌株有抑
制作用(图 11,图 12)。
9021摇 5 期 摇 摇 摇 杨娜摇 等:蕙兰病株根部内生细菌种群变化 摇
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图 9摇 回接蕙兰实验对照
摇 Fig. 9 摇 Symptom produced on Cymbidium faberi plant by
inoculation of distilled water
图 10摇 回接鸟舌兰实验对照
摇 Fig. 10摇 Symptom produced on Ascocentrum ampullaceum plant
by inoculation of distilled water
图 11摇 B22 对 H5 的拮抗效果图
Fig. 11摇 The hadantagonistic action of bacteria B22 to strain H5
图 12摇 B02 对 H5 的拮抗效果图
Fig. 12摇 The hadantagonistic action of bacteria B02 to strain H5
0121 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 31 卷摇
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3摇 讨论与结论
3. 1摇 讨论
本文采用 ARDRA方法对从蕙兰病株和健株中分离培养的 112 株内生细菌进行分析,比较其种群结构与
多样性。 结果表明,两者种群结构存在明显差异,无论是数量还是种类上都有所不同,这为下一步了解蕙兰抗
病性打下了基础。
研究中发现,健株内生细菌的种类比病株的少,健株中的内生细菌分为 8 个 OTUs,共 6 个属,而病株分为
13 个 OTUs,共 11 个属。 植物内生菌的种群结构不仅与植物的种类、基因型有关,还与环境条件、生长状态有
关,存在复杂的多样性。 一般来讲,生物多样性是衡量生态系统稳定和健康的一个重要指标[11]。 Reiter 等的
研究表明,马铃薯内生细菌的群落结构与病原菌的存在和消失有密切关系,受 Erwinia carotovora subsp.
atroseptica侵染的马铃薯病株内生细菌的群落多样性要高于健康植株[12]。 而本研究的结果与之相同,这可能
是因为在相同的环境中,感病植株自身抵抗病害的能力减弱,易受其他病原菌的侵染;也可能是更加丰富的内
生细菌类群参与了该植株的病害防御系统[12]。
蕙兰病株和健株分离出来的细菌类群也有所不同。 Paenibacillus和 Rhizobium仅在健株中分离出来,据报
道,分离自大豆的内生 Paenibacillus 对大豆的病原真菌有拮抗作用[13],而且能帮助宿主植物固氮[14],
Rhizobium对扁豆的镰刀霉枯萎病(Fusarium wilt)有防治作用,还能促进扁豆的生长[15],而这两个属在病株中
并没有被发现,所以推测,可能是这两个属的细菌对蕙兰的抗病性起到了一定的作用。 Mitsuaria、 Flavobacterium、
Enterobacter、 Mucilaginibacter、Sphingomonas、Brevundimonas、Pedobacter 仅在病株中分离到。 其中 Mitsuaria 是
新发现的菌株,国内外对其的研究较少,它在植物体内的功能还不是很清楚,它们有可能对蕙兰植株有害也可
能参与了该植株的病害防御系统,这需要进一步研究证明。 在健株和病株中都分离到 Burkholderia[16]、
Microbacterium[1]和 Pseudomonas[17]这 3 个属,这些属已经广泛的从各种植物中分离到,其中包含了很多作为
生防因子开发的菌株。
从蕙兰病株和健株中分离出来的内生细菌,在优势种群上也有很大差别。 健株中 Bacillus 为优势菌群,
占分离物的 47. 45% ,而在病株中仅占 9. 42% ,数量大大减少,据报道,Bacillus 对外界有害因子抵抗力强,菌
体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病
菌有明显的抑制作用。 Silva 等[18]已经证明内生 Bacillus 对番茄病原菌(Pseudomonas syringae)有拮抗活性。
而病株中的优势菌群为 Mitsuaria、 Flavobacterium,分别占分离物的 28. 30% 、30. 19% 。 其中 H5 菌株
(Flavobacterium resistens)回接到兰花植物后,植株表现出明显的病症,Flavobacterium 细菌是一类以在生长过
程中产生黄色素为特征的革兰氏阴性杆菌,很多都是人或动物的条件致病菌,但它与植物之间的关系还有待
进一步研究。 本文通过拮抗实验发现,从健株中分离出的 B02 菌株 ( Bacillus cereus) 和 B22 菌株
(Burkholderia stabilis) 对病株中的 H5 菌株(Flavobacterium resistens)有拮抗作用,而在健株中没有分离出
Flavobacterium,因此作者推测,可能是健株中的一些细菌对 H5 这类潜在的有害细菌能产生抑制作用。 蕙兰
病株与健株内生细菌的群落结构差异变化明显,这种变化打破了蕙兰体内的微生态平衡,这对植物的生存是
不利的,而通过人为控制逆转这种变化,则可能为植物病害防治提供新的思路。
3. 2摇 结论
通过对野生蕙兰病株和健株根部内生细菌的比较分析得到如下结论:
(1)蕙兰病株与健株根部内生细菌种群结构存在明显差异。 通过 ARDRA 分型、理化测定和分子生物学
鉴定,健株划分为 8 个 OTU,共 6 个属,主要菌群为 Bacillus;病株划分为 13 个 OTU,共 11 个属,主要菌群为
Mitsuaria、Flavobacterium。 病株内生细菌多样性比较丰富。
(2)从病株中分离出的 H5 菌株使兰花产生病症,而从健株中分离出的 B02 菌株和 B22 菌株对其有拮抗
作用。
1121摇 5 期 摇 摇 摇 杨娜摇 等:蕙兰病株根部内生细菌种群变化 摇
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2121 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 31 卷摇
ACTA ECOLOGICA SINICA Vol. 31,No. 5 March,2011(Semimonthly)
CONTENTS
Root system characters in growth and distribution among three littoral halophytes YI Liangpeng, WANG Zuwei (1195)………………
Population dynamics of endophytic bacteria isolated from the roots of infected Cymbidium faberi YANG Na, YANG Bo (1203)………
Spatial variability of forest soil total nitrogen of different soil layers
ZHANG Zhenming, YU Xinxiao, WANG Yousheng, et al (1213)
……………………………………………………………………
…………………………………………………………………
Habitat prediction for forest musk deer (Moschus berezovskii) in Qinling mountain range based on niche model
LUO Chong,XU Weihua, ZHOU Zhixiang, et al (1221)
………………………
……………………………………………………………………………
Growth release determination and interpretation of Korean pine and Koyama spruce in Shengshan National Nature Reserve, Hei-
longjiang Province, China WANG Xiaochun, ZHAO Yufang (1230)………………………………………………………………
Growth tolerance and accumulation characteristics of the mycelia of two macrofungi species to heavy metals
LI Weihuan, YU Lanlan, CHENG Xianhao, et al (1240)
…………………………
…………………………………………………………………………
Characters of the OMI NO2 column densities over different ecosystems in Zhejiang Province during 2005—2009
CHENG Miaomiao, JIANG Hong, CHEN Jian, et al (1249)
……………………
………………………………………………………………………
The forest gap diameter height ratio in a secondary coniferous forest of Guan Di Mountain
FU Liyong,TANG Shouzheng, LIU Yingan (1260)
……………………………………………
…………………………………………………………………………………
Landscape responses to changes in water levels at Poyang Lake wetlands
XIE Dongming, ZHENG Peng, DENG Hongbing, et al (1269)
………………………………………………………………
……………………………………………………………………
Effect of simulated nitrogen deposition on litter decomposition in a Bambusa pervariabilis × Dendrocala mopsi plantation, Rainy
Area of West China TU Lihua, DAI Hongzhong, HU Tingxing, et al (1277)……………………………………………………
Effect of aromatic plant-derived nutrient solution on the growth, fruit quality and disease prevention of pear trees
GENG Jian, CUI Nannan, ZHANG Jie, et al (1285)
……………………
………………………………………………………………………………
Influences of different plastic film mulches on temperature and moisture of soil and growth of watermelon in gravel-mulched land
MA Zhongming, DU Shaoping, XUE Liang (1295)
……
…………………………………………………………………………………
Effects of drought stress on photosynthetic traits and protective enzyme activity in maize seeding
ZHANG Renhe, ZHENG Youjun, MA Guosheng, et al (1303)
………………………………………
……………………………………………………………………
Photosynthetic diurnal variation characteristics of leaf and non-leaf organs in winter wheat under different irrigation regimes
ZHANG Yongping, ZHANG Yinghua, WANG Zhimin (1312)
…………
………………………………………………………………………
The root system hydraulic conductivity and water use efficiency of alfalfa and sorghum under water deficit
LI Wenrao,LI Xiaoli,ZHANG Suiqi,et al (1323)
……………………………
……………………………………………………………………………………
Latitudinal gradient in beta diversity of forest communities in America
CHEN Shengbin, OUYANG Zhiyun,ZHENG Hua, et al (1334)
…………………………………………………………………
……………………………………………………………………
Influence of silts on growth and development of Acorus calamus and Acorus tatarinowii in turbid water
LI Qiang, ZHU Qihong, DING Wuquan, et al (1341)
………………………………
……………………………………………………………………………
Roles of earthworm in phytoremediation of pyrene contaminated soil PAN Shengwang, WEI Shiqiang,YUAN Xin,et al (1349)………
Population dynamics of Frankliniella occidentalis (Thysanoptera:Thripidae) along with analysis on the meteorological factors
influencing the population in pomegranate orchards LIU Ling, CHEN Bin, LI Zhengyue, et al (1356)…………………………
Geophagy of Macaca Thibetana at Mt. Huangshan, China YIN Huabao,HAN Demin,XIE Jifeng,et al (1364)………………………
The structure and dynamic of insect community in Zhalong Wetland MA Ling, GU Wei, DING Xinhua,et al (1371)………………
Analysis of layer progressive discriminant relationsbetween the occurrence of Bipectilus zhejiangensis and soil
DU Ruiqing,CHEN Shunli, ZHANG Zhengtian,et al (1378)
…………………………
………………………………………………………………………
New mutations in hind wing vein of Apis cerana cerana (Hymenoptera: Apidae) induced by lower developmental temperature
ZHOU Bingfeng, ZHU Xiangjie, LI Yue (1387)
………
……………………………………………………………………………………
18S rRNA gene variation and phylogenetic analysis among 6 orders of Bivalvia class
MENG Xueping, SHEN Xin, CHENG Hanliang,et al (1393)
…………………………………………………
………………………………………………………………………
Laboratory study on ethology of Spinibarbus hollandi LI Weiming, CHEN Qiuwen,HUANG Yingping (1404)…………………………
Dynamic change in ecological footprint of energy consumption for traction of locomotives in China HE Jicheng (1412)………………
Approach to spatial differences analysis of urban carrying capacity:a case study of Changzhou City
WANG Dan, CHEN Shuang, GAO Qun, et al (1419)
……………………………………
……………………………………………………………………………
Social adaptive capacity for water resource scarcity in human systems and case study on its measuring
CHENG Huaiwen, LI Yuwen, XU Zhongmin (1430)
………………………………
………………………………………………………………………………
Effects of physical leaf features of host plants on leaf-mining insects DAI Xiaohua,ZHU Chaodong, XU Jiasheng, et al (1440)……
Review and Monograph
Progresses of free-air CO2 enrichment (FACE) researches on C4 crops: a review
WANG Yunxia, YANG Lianxin, Remy Manderscheid,et al (1450)
………………………………………………………
………………………………………………………………
Scientific Note
Influence of limestone powder doses on fine root growth of seriously damaged forests of Pinus massoniana in the acid rain
region of Chongqing, China LI Zhiyong, WANG Yanhui, YU Pengtao, et al (1460)……………………………………………
Leaf surface microstructure of Ligustrum lucidum and Viburnum odoratissimum observed by Atomic force microscopy (AFM)
SHI Hui, WANG Huixia, LI Yangyang, LIU Xiao (1471)
…………
…………………………………………………………………………
2009 年度生物学科总被引频次和影响因子前 10 名期刊★
(源于 2010 年版 CSTPCD数据库)
排序
Order
期刊 Journal
总被引频次
Total citation
排序
Order
期刊 Journal
影响因子
Impact factor
1 生态学报 11764
2 应用生态学报 9430
3 植物生态学报 4384
4 西北植物学报 4177
5 生态学杂志 4048
6 植物生理学通讯 3362
7
JOURNAL OF INTEGRATIVE
PLANT BIOLOGY
3327
8 MOLECULAR PLANT 1788
9 水生生物学报 1773
10 遗传学报 1667
1 生态学报 1. 812
2 植物生态学报 1. 771
3 应用生态学报 1. 733
4 生物多样性 1. 553
5 生态学杂志 1. 396
6 西北植物学报 0. 986
7 兽类学报 0. 894
8 CELL RESEARCH 0. 873
9 植物学报 0. 841
10 植物研究 0. 809
　 ★《生态学报》 2009 年在核心版的 1964 种科技期刊排序中总被引频次 11764 次,全国排名第 1; 影响因
子 1． 812,全国排名第 14;第 1—9 届连续 9 年入围中国百种杰出学术期刊; 中国精品科技期刊
　 　 编辑部主任: 孔红梅　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 执行编辑: 刘天星　 段　 靖
生　 态　 学　 报
(SHENGTAI　 XUEBAO)
(半月刊　 1981 年 3 月创刊)
第 31 卷　 第 5 期　 (2011 年 3 月)
ACTA ECOLOGICA SINICA
　
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Vol． 31　 No． 5　 2011
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