全 文 ：第 21卷 第 3 期
1 9 8 5 年 8 月
林 业 科 学 V ol .
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S C I E N T IA S IL V A E S IN IC A E 9 8 5
杨树花培植株染色体自然加倍的研究
陆志华 刘玉喜 张培呆
(东北林学院)
L 摘 要
通过杂种杨 ( .P s犷。 0 0 11 x .P n :’g r a ; P . b e r o l￡。 e , 5 15 D i p p e l ) 花药的离体
培养 , 获得 了单倍体植株。 这些植株被移栽到试验 园地生长 , 8 年中进行 了四次
染 色体检查 , 发现它们 由单倍体细胞 占优势的嵌合体植株逐 渐 变 成 了二 倍体细
胞占优势的植株 。 通过了一 8年 的生长和发育 , 自然加倍 变成 了纯合二倍体 。
杂交是杨树育种的重要方法之一 。 为了提高杂种优势 , 研究出 获 得纯合二倍体的有
效方法是非常重要的 。 近十几年来 , 通过花药离体培养和孤雌生殖的办法 , 获得杨树单倍
体植株曾有过一些报道 , 但进一步深入的研究 , 如单倍体植株染色体数 量组 成和变化 , 以
及染色体加倍等方面的报道却较少 。
我们于 1 9 7 5一 1 9了了年间用花药培养的方法 , 获得了一定数量的杨树单倍体植株 . , 接
着对杨树小袍子发生卿 , 离体培养过程中小泡子发育帕 , 以及花粉植株染色体数量组成作
了细胞学观察帕 。 为 了对花培植株染色体数量变化规律作进一步了解 , 我们 对 生长发育
中的花培植株做了多年染色体检查 , 发现了花培植株染色体 自然加倍的现象 。
材 料 与 方 法
试验材料是 1 9 7 5 年以 来由杨树种间杂种中东杨 ( .P b e r o l i n e n : 15 D i p p e l ) 和不黑杨
( .P
: 俪。 爪 i x .P n匆ar )的花药通过离体培养从愈伤组织上诱导出来 的部分当代植株 。 对
照是诱导这些植株时采取花药的二倍体母株。 这些花培植株如今已长成大树 , 树龄 了一 9
年 。 1 9 8 3年小黑杨最高为 13 . 6 m , 最低 s m , 中东杨最高 9 . 7m , 最低 2 . 5 m 。
从小苗在培养瓶中生根起到圃地生长的 8一 9年中进行了四次细致地染色体检查 。 第
一次是当小苗在瓶内形成完整根系移栽入盆之际进行的 。 这次检查是抽查 , 共检查 10 多
株 。 以后的三次检查是植株移到圃地生长过程中进行的 , 于 1 9 7 9、 1 981 、 1 9 8 3 年分别以 5
株小黑杨 、 6 株中东杨以及对照作定株检查 , 每株每次观察不少于翎个分裂相 。
染色体检查全部采用根尖压片。 瓶内小苗采用原发根 , 大植株采用 一定 部位枝条的
水培根 。 根尖首先经过预处理 , 方法是在 O一 3 ℃低温下冷冻 24 小时或用对二氯代苯饱合
液处理 2 . 5一 4 . 0 小时 。 卡诺固定液固定后入 0T 拓酒精 保存 。 染色 前在 60 ℃恒温下用
I N H CI 解离 10 一 15 分钟 。 染色采用两种方法 , 一是石碳酸一品红配 方 I 伽礼一是铁矾 一苏
木精染色。 前者染色方法简便 , 用于一般观察计数 , 后者 要 经过 4 拓铁矾媒染 16 一 2 4 小
228 一 林 业 科 学 2 1卷
时 , 0 . 5拓苏木精染色 0 . 6一 1 . 5小时 , 45 书醋酸软化 1一 3小时 , 最后压片 , 用于显微照像 。
结 果 与 分 析
在对染色体检查过程中我们发现 , 几乎所有的花培植株 , 染色体组成都很复杂 。 无论
是 小黑杨还是中东杨都是混倍体 , 或者说是具有各类染色体数 目细胞 的 嵌 合 体 , 即在问
一植株 、 同一枝条 、 同一根尖甚至同一视野内都同时存在单倍 、 二倍 、 多倍以及非整倍体细
胞 , 见图版 I 。 此外 · 杨树染色体小、 数量多 ( Z n 一 3 8) , 分散常常不理想 , 数量统计精确度只
能达到士 4 , 因此为了便于统计和说明问题 , 我们把观察到的染 色体按数量分成如下几类 :
1 )单倍体细胞类 ( 2 2条以下 ) ; 2 )二倍体细胞类 ( 3 0一 4 2条 ) ; 3 )非整倍体细胞类 ( 2 3一 2 9 ) ,
4) 多倍体细胞类 ( 50 条以上 ) 。
现在把这四次染 色体检查结果作如下分析 :
(一 )瓶内小苗染色体检查
第一次染色体检查是当小苗形成完整根系 , 准备从培养瓶中移栽入盆之 际 进行的 。
一共检查 10 多株 (见表 1 ) 。
衰 ! 花培植株板内小苗根尖维色体检资
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从表 1 可见 , 1 株小苗中有 10 株显然是单倍体植株 , 其单倍体细胞平均约 占 87 . 98 万 ;
二倍体细胞和非整倍体细胞平均分别只 占 6 . 23 形和 6 . 9T 多 。 这些植株无疑是 由花粉培养
而来 , 从小苗分化到移栽出瓶这段时间 , 它们处于相对稳定的单倍体状态 。 但 1 株中也有
1 株为二倍体植株 , 其二倍体细胞数占80 万 , 非整倍体细胞占2 0拓 , 与对照相比 , 它的二倍
体细胞数偏低 , 非整倍体细胞数偏高 , 很可能也是由花粉而来 , 只是过早的 进 行了加倍而
巳 。
(二 )在圃地生长期间对花粉植株的染色体检查
在植株移栽到圃地生长之后 , 分别树种各抽出 5 株于 1 9 79 , 198 1 , 1 9 8 3 年作定株染色
体检查 (见表 2 、 表 3 ) 。 从表 2 和表 3的分析可得出如下 的规律 :
冬, 花培植株移栽入圃之后染色体数目开始调整 , 随年龄的增长单 倍 体细胞逐渐减
3 期
裹 2
陆志华等 : 杨树花培植株染色体自然加倍的研究 2 2 9
小黑杨花培搜株在圈地生长期间三次染色体检奋
株 检
查时间
(年)
观察细胞数
(个)
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中东杨花培植株在 . 地生长期间三次染色体检查
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23 0林 业 科 学 2 1卷
少 , 二 倍体细咆逐渐增多 , 明显地表现出自然加倍的趋势。 小黑杨和 中东杨各个检查过的
植株都如此 。 按树种平均也如此 。 例如 : 小黑杨二倍体细胞百分数平均随年代而增长的
情况是 : 1 9了5年是 5 . 2 3多 , 1 9了9年是 5 0 . 0 6多 , 1 9 8 1年是 8 5 . 3 4万 , 1叨 3年是 9 1 . 0 3拓 , 中东杨的
情况也相类似 。 而对照植株这 3年检查二倍 细 胞变 化不 大 , 一直在 90 . 4一 I 0D 多之间变
动 。 可从图 1 中直观地看出单倍细胞的逐年减少和二倍细胞的逐年增加 。
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图 1 花培值株在生长过程 中单倍细胞和二倍细胞百分数的变化
- -一单倍细胞 ; 一二倍细胞 ; A为中东杨 ; B 为小黑杨
2
. 自然 加倍的速度表现前期快后期放慢 , 在树龄了一 8年生时可完成加倍过程 , 达到
纯合二倍体水平 。
从图 1 可以看出二个树种二倍体细胞的百分数在 1 9 7 5一 1 9 8 1年间增加 很 快 , 小黑 杨
平均每年增加 16 拓 , 中东杨平均每年增加 13 . 2形 , 而 1 9 8 1一 1 9 8 3年 间 显著 减慢 , 小黑杨和
中东杨平均每年分别只增加 2 . 8多和 8 . 5形 。 这说明 1 981 年之后二倍体细胞 已积累很多 , 逐
渐接近或已达到正常二倍体水平 , 加倍过程接近完成 。 从小苗分化起计 算时 间这过程大
约需要 7一 8年 , 即树龄 7一 8年生 。 非常巧合的是杨树此时正好接近花期 , 这样就保证 了正
常开花结实 , 为不误时机地进行杂交育种提供了方便 。
衰 4 中东杨原花培植株与其相应的扦播搜株染色体数 t 比较
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3期 陆志华等 : 杨树花培植株染色体自然加倍的研究
(三 ) 花粉植株经扦插繁殖可加速 自然加倍的过程
1 9 80年我们为田间比较试验对部分原花培植株进行了扦插繁殖 , 1 9 8 2 年对中东 杨的
6 个植株及其相对应的扦插植株作了染色体检查 (见表 4 ) 。
从表 4 可明显看出 : 每号扦插株比相应原株二倍体细胞百分数普遍提高。 扦插株二
倍体细胞百分数变动在 78 . 4一 84 . 1拓之间 , 平均占 80 . 5万 , 而相 应 的原株 变 动在 68 . 6一
78
.
8多之 间 , 平均占 72 . 8形 。 显然通过扦插繁殖加速了自然加倍的过程 。 这给我们 以 启
示 , 为尽快获得纯合二倍体 , 可通过多次扦插繁殖来实现 。
讨 论
随着植物细胞和组织培养的迅速发展 , 不少研究者发现不同植物 种类或 同一植物的
不同组织和器官 , 经离体培养后都可能发生染色体变异 。 商效民如在 其综述性 文章 中指
出 , 据报道至小有近 6D 种植物发生了这种变异 。 其中由花药培养所得愈伤 组织 和植株更
是如此 , 如烟草、 水稻 “ 〕、 小麦卿、 橡胶中等都曾获得不 同倍性的愈伤组织和植株 , 并指出混
倍现象的普遍性 。
杨树花培植株染色体变异有其自己的特点 , 它不仅表现为生长初期的高度混倍现象 ,
而且进一步趋向是植株的自然加倍 。 这一发现无疑具有一定的遗传理论和育种实践 _卜的
重要意义 。 这里我们试就有关问题讨论于下。
(一 ) 混倍现象与植株的来源问题
我们的研究表明 , 杨树花培植株在移栽出瓶之前绝大部分是以单倍体细 胞为主 的嵌
合体 , 当移入圃地生长一年之后 , 嵌合现象越加严重 , 不仅出现越来越多的二倍体细胞 , 还
出现一些非整倍体细胞和多倍体细胞 。 T a 6 a 双 K a矛哪在研究中指出 , 香脂杨花药愈伤 组织
是 由单倍 、 二倍和非整倍体细胞组成的 , 其中非整倍体细胞占64 形 , 并认为它们是 由单倍
体细胞分裂被破坏而产生的 。 tS e t lt e (lr 。 在美国黑杨孤雌生殖诱导单倍体时曾获得一倍
和二倍体细胞的混倍体 , 认为这一现象“ 很容易被它们来源于单倍体但通过部 分 组 织 的
染色体加倍来解释 ” 。 W i nt o n 和 E i n s p a h lr( . )也说明了这一现象 , 并认为 “ 这一混倍现象
无疑地证明产生了单倍体 , 但在幼苗检查之前染色体巳经加倍 ” 。 岑明、 陈 正 华等在鉴定
花药培养所得植株是否来源于花粉时说 “ 如果早期胚状体全部或绝大多数是 单倍体或以
单倍为主 的混倍体 , 则可以基本上肯定它们绝大部分来源于花粉 ” 叻 。
我们执相似看法 , 杨树花培植株的混倍现象是 由于单倍细胞自然加倍过 程 中所表现
出来的过渡状态 , 而对照植株每次检查都是二倍体细胞占9D 拓以上的绝对优势 , 这种混倍
现象是见不到的 。 因而我们认为所得花培植株是来源于花粉的 。
(二 ) 混倍现象产生的原因
许多学者认为在离体培养下容易引起细胞的核内有丝分裂 、 核内复 制 、 核融合 、 多极
有丝分裂和染色单体不分离等现象 , 这些有丝分裂的异常过程是产生混倍体、 染色体加倍
及其他染 色体变异的重要原因讯 ,l 。 。 胡含等卿 指出多极有丝分裂可能是产生非整倍体细
胞的原因之一 。 我们在染色体观察中也曾见到多极有丝分裂现象。 图版 I 一 6是三级 有 丝
分裂现象。 这种细胞在胞质分裂后必然产生染 色体减数的非整倍体 细 胞 。 由此可知 , 很
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可能花粉愈伤组织或小植株体细胞增殖过程中 , 由于多极有丝分裂和核内有丝分 裂 等方
式产生出各种数目染色体的细胞 从而形成混倍体 。 其形成的机理可 能 很 复 杂 . 有待更
多的研究 , 作出深入的解释 。
这类混倍体如能分离出具有各类染色体数 目的单细胞或细胞团进一步培养成具各种
染色体变异的细胞株 , 将是遗传育种研究的好材料 。
(三 ) 关于自然加倍问题
S t e t le r叻 在总结实验时指出 “ 在一些森林树种中天然存在单倍体 , 也可诱导产生单
倍体 , 但有一种倾 向 那就是染 色体受到加倍 ” 。 他和W i nt o n 都通过孤雌生殖诱导出单倍
和二倍体细胞的嵌合体植株 并把嵌合体的产生归因于染色休的 自然加倍 。 吴克贤等卿
报道了三年生小黑杨花培植株染色体的加倍情况 、 指出二倍体细胞由四个月时的 3 拓增
加到 64 拓 。 由此看来林木单倍体的 自然加倍现象是普遍存在的 。 我们通过对小黑杨和中
东杨花培植株染色体观察多年的资料积累 , 不但证实了自然加倍的存在 , 而且进一步证实
了这一加倍过程可在 7一 8年内完成 , 由单倍体变为纯合二倍体 。
花培植株在生长过程 中能自行加倍 , 这是染色体变异之后的一 种 演化趋向“ 〕。 可以
想象各种染色体数量的细胞随树龄增长而变化 但不会有相同的机 会 生存 。 一些单倍体
细胞由于核内复制或核内有丝分裂变为二倍体细胞之后 , 由于二倍体细胞的选择优势强 ,
比邻近的其他细胞具有更快的增殖速度 , 逐渐 占据优势 , 最终导至植株染色体自然加倍变
为纯合二倍体。 由于林木生长期长 , 这种现象比一年生植物更容易 发 生 。 这种自然加倍
安全可靠 , 较少产生核畸变` l4) 。 对杨树来讲加倍可在开花结实之前完成 , 为纯系间杂交解
决了一个关键性问题 。 这说明林木单倍体育种在这方面有它 自己的优越性 。
参 考 文 献
( 1 ) 东北林学院树木育种组 . IO7T . 杨树单倍体花粉植株的诱导 .遗传学报 , 4 ( 1 ) : 49 一 64 。
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( 3 ) 张数方等 , 10T9 . 杨树花药培养中小抱子发育的细胞学观察 . 东北林学院学报 , ( 2 ) : 5一 ls 。
( 4 ) 陆志华等 . 1盯 : 杨树花粉植株体细胞染色体观察 . ( 2 ) : 14一 21 。
( 6 ) 胡含等 , 19了8 . 小麦花粉愈伤组织植株体细胞染色体的变异 . 遗传学报 . 6 ( 1 ) : 2 3一2 .9
( 6 ) 陈英等 . 1974 , 水稻花粉植株的诱导条件及其遗传学表现的研究 . 中国科学 , ( 1 ) : 40 一6 1 。
( 7 ) 岑明 . 陈正华等 . 19 81 . 三叶橡胶花药培养过程中的染色体倍数性研究 , 遗传学报 . 8 ( 2 ) : 1B 叨一1 7.4
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(1 1〕 M e c o m b 工 A 一 19 7 8 . I n “ P r o e e e d宝n g o f s y m p o s里u m o n p l a n t t呈s s u e e u lt u r e ” . S e主e n e o P r e e 一 1 6T一
18 0
.
( 12〕 L e st e r D · T · a n d J · G 一 B e r b e e 1 9了了. W三t h i n 一 e l o n e v a r呈at 里o n a m o n g b l a e k p o p l a r t r e e s d e r呈v e d
台。口 c a l l u s e u lt u r e , F o r . S c宝. , 2 3 ( l ) : 12 2一 5 2.〔13〕 W i址 o n L . L . a n d D . W . , E i n s P a h r 1068 . T h e u s e o f h e a d t r e a te d p o l l e n f o r a s p e n h a p lo i d
fP o d
u d 劣o n , F o r . S c i . , 14 : 40 6一4 0 7 .
( t 4〕 S t et l er R . F . a n d K . S二 B a , a 10了1, E x p e r呈m e nt a l 呈n d u c t三o n o f h a p l o 呈d p a rt 卜e n o , 皿 e s星s 三皿 b l a e k
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S里1. G e n 二 2 0 , H e ft l一 2 : 1 5一2 5 .
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3少g〕 陆志华等 : 杨树花培植株染色体自然加倍的研究 2 33
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in t h e e x p e r i m e n t a l p l o t
.
T h
e a n t h e r s w e r e e o l l e e t ed f r o m a h yb r id
b e t w e e n l 〕 oP u l u s s`m o , f`, .P n f夕r a a n d .P b e r o l i n e n s i s D i p p e l . A f t e r p l a n t i n g
t h e n u m b e r o f e h r o m o s o m e o f t h e h a p l o i d p la n t w a s e x a m i n e d u n d e r
m i e r o s e o p e f o r f o u r t i m e s w i t h i n 8 y e a r s
.
I t w a s r e v e a l
e d t h a t t h e p l a n t s
h a d g r a d u a l l y e h a n g e d t h e i r t i s s u e s i n t o t h o s e d o m i n a t e d q u a n t i t a t i v e l y
b y d i p l o i d e e l l s f r o rn e h i m e r a d
o m i n a t e d b y h a p l o i d e e l l s
.
T h e n u m b e r o f e h r o m o s o m e w a s d o u b l e d a t t h e a g e o f 7一 8 y e a r s
a n d t h e P l a n t s 卜e e a m e e o m P l e t e l y d i p l o id o n e s .
陆志华等 : 杨树花培植株染色体自然加倍的研究 图版 I
杨树花粉植株体细胞染色体数最变异 (,0 0 x ) : ! . 单倍体细 胞 (2。 = 1 .) ; 2 . 二 借体细 胞 ( 2n “ 38) :
,
. 非整倍体细胞 (Zn 二 ZD ; ` . 三倍体细胞 (2 . = 盯 ) ; 乐 四倍体细胞 ( 2。 = 了. ) ; ` 三级有丝分 裂未 期 ;
T
.
8年生小黑杨花粉植株 ( 1. 53年高 aT . 6m ) ; : 了一年生杨树花粉植株林 .