全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2010, 45 (4): 472–478, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3969/j.issn.1674-3466.2010.04.011

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收稿日期: 2009-03-09; 接受日期: 2009-09-07
基金项目: 哈尔滨市科技攻关计划(No.2003AA6CN088)
* 通讯作者。E-mail: shwkj@mail.neau.edu.cn
农杆菌介导南瓜遗传转化体系的建立
付洪冰1, 崔崇士1*, 赵曦2, 刘琦2
1东北农业大学园艺学院, 哈尔滨 150030; 2黑龙江省农业科学院生物技术研究所, 哈尔滨 150086
摘要 以南瓜金辉一号(Cucurbita moschata ‘Jinhui 1’)为实验材料, 利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转
化南瓜子叶节, 研究了预培养时间、侵染时间、乙酰丁香酮(AS)浓度和共培养时间, 抗生素羧苄青霉素(Carb)、头孢霉素
(Cef)以及筛选剂卡那霉素(Kan)等因素对离体不定芽的影响, 建立了南瓜最适遗传转化体系。结果表明: 外植体预培养0天,
侵染时间30分钟, AS浓度为100 mg·L–1, 共培养5天可获得最高遗传转化效率; 最适除菌剂为Cef, 其最适浓度为500
mg·L–1; 最适Kan筛选浓度为100 mg·L–1; 在MS培养基上培养抗性芽生根, 经PCR和Southern blot检测, 证明为转基因植
株。
关键词 根癌农杆菌, 南瓜, 遗传转化, PCR, Southern blot
付洪冰, 崔崇士, 赵曦, 刘琦 (2010). 农杆菌介导南瓜遗传转化体系的建立. 植物学报 45, 472–478.
南瓜(Cucurbita moschata)隶属于葫芦科(Cucu-
rbitaceae)南瓜属(Cucurbita), 为一年生蔓性草本植
物, 是人们喜爱的主要蔬菜之一, 营养价值高、适应
性广且耐贮运, 并具有较好的观赏价值。近年来, 因
其特殊的营养保健作用, 如降血糖、抗肿瘤和防治胃
肠疾病等功能(王萍和赵清岩, 1998)而备受青睐。但
大多数生产用南瓜品种抗真菌病害能力较弱, 而南瓜
疫病和南瓜白粉病危害较重(黄河勋等, 2006), 严重
影响了南瓜的产量和质量, 故对南瓜进行遗传改良具
有重要的现实意义。
目前, 国外对南瓜属遗传转化的研究主要集中在
美洲南瓜上(Katavic et al., 1991; Toppi et al., 1997;
Fuchs et al., 1998), 国内对南瓜的研究则主要集中
在南瓜再生体系的优化上(赵建萍, 1999; 李贞霞等,
2005; 余义和等, 2006; 张亚锋等, 2007)。李贞霞等
(2005)曾采用基因枪介导法进行了南瓜遗传转化的
研究, 而有关农杆菌介导的南瓜遗传转化的研究尚未
见报道。因此建立南瓜遗传转化体系, 为导入优良基
因提供良好平台已成为当务之急。
本实验以南瓜为对象, 系统研究了影响根癌农杆
菌转化南瓜的诸多因素, 找出了适合条件, 建立了稳
定、高效的南瓜遗传转化系统并获得了再生植株, 为
今后南瓜转入外源目的基因奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 植物材料
南瓜品种金辉一号(Cucurbita moschata Duch. ‘Jin-
hui 1’)由东北农业大学园艺学院南瓜研究室提供。
1.2 培养基成分
基本培养基: MS; 预培养培养基: MS+2.0 mg·L–1BA;
共培养培养基: MS+2.0 mg·L–1 BA+AS; 抑菌培养基:
MS+2.0 mg·L–1BA+Carb或MS+2.0 mg·L–1BA+Cef
(cefotaxime); 筛选培养基 : MS+2.0 mg·L–1 BA +
Kan (kanamycin); 生根培养基: MS。
1.3 载体及菌株
植物表达载体p35S-2300-RS由作者自行构建(图1),
其中无选择标记表达载体p35S-2300由上海交通大
学赵凌侠副教授惠赠 , RS基因为白藜芦醇合酶
(resveratrol synthase, RS)基因, 由作者从东北野生
葡萄中克隆得到, 该基因GenBank登录号为FJ455-
98723; 农杆菌LBA4404由黑龙江省农业科学院生物
·技术方法·
付洪冰等: 农杆菌介导南瓜遗传转化体系的建立 473


图1 p35S-2300-RS质粒图谱

Figure 1 The plasmid profile of p35S-2300-RS


技术研究所提供。
1.4 PCR检测所用引物
RS基因特异引物由上海生物工程有限公司合成。引
物序列如下: F, 5′-CCGGATCCGCATCAATGGCTTC-
AGTT-3′; R, 5′-CCGAGCTCAGTTTCGGAGATAAA-
CC-3′。
1.5 方法
1.5.1 遗传转化因子对抗性芽的影响
采用L9(34)正交实验设计, 实验因素和水平见表1。共
9个处理 , 每个处理30个 , 3次重复。浓度单位为
mg·L–1, 侵染时间单位为分钟, 预培养和共培养时间
单位为天。

1.5.2 外植体对抗生素Carb和Cef的敏感性实验
为确定抗生素Carb和Cef对南瓜子叶下胚轴再生的影
响, 本实验对2种抗生素分别设计了8个浓度梯度, 即
100、200、300、400、500、600、700和800 mg·L–1。
用打孔器把南瓜子叶下胚轴打成小块, 在不同种
类和浓度的抗生素中浸泡后, 接种至MS平板上, 培
养4周后, 观察外植体的生长情况。

1.5.3 筛选剂Kan选择压的确定
比较不同浓度抗生素Kan对南瓜子叶下胚轴再生的影
表1 抗性芽影响因素的正交实验设计
Table 1 The orthogonal designs of influencing factors of
cultivation resistant shoots
Factor Level
A
(d)
B
(min)
C
(mg·L–1)
D
(d)
1 0(A1) 20(B1) 50(C1) 3 (D1)
2 1(A2) 30(B2) 100(C2) 5 (D2)
3 2(A3) 40(B3) 200(C3) 7 (D3)
A: 预培养时间; B: 侵染时间; C: AS浓度; D: 共培养时间
A: Pre-culture time; B: Infection time; C: AS concentration; D:
Co-culture time


表2 抗性芽影响因素的正交实验分析
Table 2 The orthogonal test analysis of influencing factors
of cultivation resistant shoots
No. of
experiment
A B C D
Rate of re-
sistant shoots
(%)
1 1 1 1 1 1.40
2 1 2 2 2 4.60
3 1 3 3 3 1.19
4 2 1 2 3 3.86
5 2 2 3 1 1.83
6 2 3 1 2 2.95
7 3 1 3 2 1.51
8 3 2 1 3 3.22
9 3 3 2 1 2.62
抗性芽率(%)=(产生抗性芽的外植体数 /接种外植体总数)×
100%。A、B、C和D同表1。
The ratio of cultivation resistant shoots(%)=(the number of
explants generating the cultivation resistant shoots/ the total
number of inoculation)×100%. A, B, C and D see Table 1.


响, 将南瓜子叶下胚轴接种于9种不同浓度(0、20、
40、60、80、100、120、140和160 mg·L–1)的Kan
培养基上, 每20天转瓶1次, 40天后统计外植体的存
活率。

1.5.4 转基因植株的PCR检测
选取经Kan抗性筛选的转基因植株, 反应设以质粒为模
板的阳性对照和以未转化的植株叶片DNA为模板的阴性
对照, 同时设空白对照。采用常规PCR反应体系及程序。

1.5.5 转基因植株的Southern blot检测
提取抗性植株的总DNA, 并以其为模板, 以RS基因
474 植物学报 45(4) 2010
的PCR胶回收产物为探针标记, 膜杂交和显色处理
均按照Boehringer Mannheim公司DIG High Prime
Labeling and Detection Starter Kit I的标准程序进
行。

1.5.6 统计分析
利用方差分析软件DPS对数据进行显著性分析。
2 结果与讨论
2.1 遗传转化因子对抗性芽的影响
2.1.1 极差分析
从表3可以看出, AS浓度的极差(R=2.18)最大, 共培
养时间的极差次之, 预培养时间的极差(R=0.48)最
小。因此, 抗性芽出芽率受AS浓度的影响最大, 与共
培养时间和侵染时间相比, 预培养时间的影响最小。

2.1.2 单因素新复极差测验
表4显示了预培养时间、侵染时间、AS浓度和共培养
时间对转化效率的影响。子叶不经预培养时, 抗性芽
出芽率为2.40%, 预培养1天, 抗性芽出芽率增加到
2.88%, 当预培养时间延长至2天时, 抗性芽出芽率
下降到2.45%。方差分析结果表明, A2与A3和A1之间
差异显著, 即预培养1天与预培养2天和不经预培养
相比差异显著, 因此, 确定南瓜遗传转化过程中, 最
适预培养时间为1天。
此外, 表4显示子叶侵染20分钟时, 抗性芽出芽
率为2.25%, 侵染30分钟 , 抗性芽出芽率增加到
3.22%, 当侵染时间延长至40分钟时, 抗性芽出芽率
下降到2.26%。方差分析结果表明, B2与B3和B1之间
差异显著, 即侵染30分钟与侵染40分钟和20分钟相
比差异显著, 因此, 确定南瓜遗传转化过程中, 最适
侵染时间为30分钟。
AS浓度也是影响转化效率的一个重要因素。当
AS浓度为50 mg·L–1时, 抗性芽出芽率为2.52%, 当
AS浓度为 100 mg·L–1时 , 抗性芽出芽率增加到
3.69%, 当AS浓度升高至200 mg·L–1时, 抗性芽出芽
率下降到1.51%(表4)。方差分析结果表明, C2与C1
和C3之间差异极显著, 即AS浓度为100 mg·L–1与AS
浓度为50和200 mg·L–1相比, 差异极显著, 因此, 确
定南瓜遗传转化过程中, 最适AS浓度为100 mg·L–1。
表3 抗性芽影响因子的极差分析
Table 3 The range analysis result of influencing factors of
cultivation resistant shoots
Factor Minimum Maximum Range R
A 2.40 2.88 0.48
B 2.25 3.22 0.96
C 1.51 3.69 2.18
D 1.95 3.02 1.07
A、B、C和D同表1。A, B, C and D see Table 1.


表4 单因素新复极差测验
Table 4 The new multiple range test of single factor

Rate of
resistant
shoots(%)
5% level
of sig-
nificance
1% level
of sig-
nificance
Pre-culturation time
A2 2.88 a A
A3 2.45 b B
A1 2.40 b B
Infection time
B2 3.22 a A
B3 2.26 b B
B1 2.25 b B
AS concentration
C2 3.69 a A
C1 2.52 b B
C3 1.51 c C
Co-culture time
D2 3.02 a A
D3 2.76 b B
D1 1.95 c C
A1–A3、B1–B3、C1–C3、D1–D3见表1。
A1–A3, B1–B3, C1–C3, D1–D3 see Table 1.


另外, 从表4还可以看出, 子叶共培养3天时, 抗
性芽出芽率为1.95%, 共培养5天时, 抗性芽出芽率
增加到3.02%, 当共培养时间延长至7天时, 抗性芽
出芽率下降到2.76%。方差分析结果表明, D2与D3和
D1之间差异极显著, 即共培养5天与共培养7天和3天
相比, 差异极显著, 因此, 确定南瓜遗传转化过程中,
最适共培养时间为5天。

2.1.3 组合间新复极差测验
由表5可知, 在9个处理组合中第2个处理, 即A1B2-
C2D2最理想, 其抗性芽出芽率最高(4.60%), 与其余
几个组合相比差异极显著。A1B2C2D2代表的各因素
付洪冰等: 农杆菌介导南瓜遗传转化体系的建立 475
水平为: 预培养0天, 侵染时间30分钟, AS浓度100
mg·L–1, 共培养时间5天。而单因素分析时, 其各个因
素代表的最佳水平则是: 预培养1天, 侵染时间30分
钟, AS浓度100 mg·L–1, 共培养时间5天。造成这种差
异的原因可能是由于各因素间存在互作, 并且处理组
合的最高抗性芽出芽率(4.60%)高于每个单因素的最
高抗性芽出芽率, 由此可知这种互作是一种正效应互
作, 这也是本研究采用正交实验设计的原因所在。综
上所述, 我们认为A1B2C2D2所代表的各因素水平为
南瓜遗传转化过程中的最适水平。
2.2 外植体对抗生素Carb和Cef的敏感性
从图2可以看出, 随着2种除菌剂浓度的增大, 南瓜子
叶下胚轴逐渐失绿并枯萎。当Carb浓度为600 mg·L–1
时(图2A), Cef浓度为700 mg·L–1时(图2B), 南瓜子叶
下胚轴失绿枯萎较严重。因此得出: 外植体对Carb的
最适耐受浓度为500 mg·L–1, 对Cef的最适耐受浓度
为600 mg·L–1。综合外植体的最高耐受除菌剂浓度和
前人确定的除菌剂的最低抑菌浓度, 可以得出: 用
Carb作为除菌剂的最适浓度为500 mg·L–1, 用Cef作
为除菌剂的浓度范围为400–600 mg·L–1(最适浓度为
500 mg·L–1)。鉴于Cef与Carb相比具有广谱抗性, 根
据本实验结论认为, 南瓜子叶下胚轴的最适除菌剂为
Cef, 最适浓度为500 mg·L–1。
2.3 筛选剂Kan选择压的确定
观察发现南瓜外植体在含Kan的MS培养基上培养40
天后, 60 mg·L–1的Kan可抑制外植体的增殖和分化,

表5 组合间新复极差测验
Table 5 The new multiple range test among factors com-
bination
1–9见表2。 1–9 see Table 2.


图2 南瓜外植体对抗生素的敏感性实验
(A) 南瓜外植体对Carb的敏感性实验。1–8: Carb浓度分别为
100、 200、300、400、500、600、700和800 mg·L–1; (B) 南
瓜外植体对Cef的敏感性实验。1–8: Cef浓度分别为100、200、
300、400、500、600、700和800 mg·L–1

Figure 2 The sensitivity test of explants of Cucurbita mo-
schata ‘Jinhui 1’ to antibiotics
(A) The sensitivity test of explants of Cucurbita moschata
‘Jinhui 1’ to Carb. 1–8: Carb concentration of 100, 200, 300,
400, 500, 600, 700 and 800 mg·L–1; (B) The sensitivity test of
explants of Cucurbita moschata ‘Jinhui 1’ to Cef. 1–8: Cef
concentration of 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 and 800
mg·L–1



图3 卡那霉素(Kan)对南瓜外植体的选择效果

Figure 3 The selection effect of kanamycin (Kan) to ex-
plants of Cucurbita moschata ‘Jinhui 1’
Treatment Rate of resistant
shoots (%)
5% level of
significance
1% level of
significance
2 4.60 a A
4 3.87 b B
8 3.22 c C
6 2.95 d D
9 2.62 e E
5 1.83 f F
7 1.51 g G
1 1.40 g GH
3 1.19 h H
476 植物学报 45(4) 2010




图4 南瓜抗性植株的PCR检测(A)和Southern blot杂交结果
(B)
(A) M: DNA分子量标准; 1: 水; 2: 未转化植株; 3: p35S-
2300-RS质粒; 4–6: 转化植株
(B) 1: RS基因; 2: 未转化植株; 3–5: PCR阳性转化植株

Figure 4 The PCR result (A) and the Southern blot analysis
(B) of Cucurbita moschata ‘Jinhui 1’ resistant plants
(A) M: DL2000 marker; 1: Water; 2: DNA from
non-transformed control plants; 3: RS gene as positive con-
trol; 4–6: Transformants resistant to kan
(B) 1: RS gene as positive control; 2: DNA from non-trans-
formed control plants; 3–5: DNA from PCR-positive trans-
formants


此时外植体的存活率仅为20%, 大部分外植体表现黄
化, 不能继续生长; 当Kan的浓度增加到100 mg·L–1
以至更高时, 外植体则全部死亡(图3)。由此确定, 100
mg·L–1的Kan可作为区分转化与未转化南瓜的有效选
择压。
2.4 转基因植株的PCR分析
使用CTAB法提取 23株抗性植株的总DNA, 以
p35S-2300-RS质粒DNA为阳性对照, 未转化南瓜植
株DNA为阴性对照, 进行PCR检测。在23株抗性植株
中, 共获得3株PCR阳性植株, 阳性率为13.04%。3
株阳性植株的PCR检测结果如图4A所示, 用RS基因
的特异引物扩增, 阳性对照和阳性样品均扩增出长度
为1 282 bp的目的条带, 阴性对照则没有扩增出相应
条带, 初步证明RS基因已经导入南瓜中。
2.5 转基因植株的Southern blot检测
以3株PCR检测阳性植株作为Southern blot杂交材
料, 采用EcoRI酶切转化南瓜基因组DNA, 以RS基因
PCR胶回收产物为标记探针, 杂交结果如图4B所示。
其中PCR阳性植株样品均有较明显的杂交条带, 说
明RS基因已整合进入南瓜基因组中。
2.6 转基因植株的遗传转化率
本实验共侵染了540个南瓜子叶下胚轴外植体, 产生
了23株卡那霉素抗性植株。通过对3株PCR阳性植株
进行Southern blot检测验证, 证明外源基因转移至植
物的基因组中, 最终转化率仅为0.56%。
2.7 讨论
南瓜的遗传转化比较困难, 迄今成功的报道较少, 多
集中在南瓜属的另一种作物西葫芦(Cucurbita pepo)
上(Toppi et al.,1997; Fuchs et al.,1998; Pang et al.,
2000)。建立高效的遗传转化体系是进行南瓜基因工
程育种的基础。目前有关南瓜转化方面的研究在国内
尚未见报道, 国际上的报道也屈指可数(Fuchs et al.,
1998)。本文对影响农杆菌转化南瓜的因素进行了研
究, 其中侵染时间、共培养时间和乙酰丁香酮浓度对
南瓜遗传转化的影响较大。
农杆菌对外植体的侵染时间长短直接影响到转
化频率以及外植体的坏死程度, 所以合适的侵染时间
和共培养时间是一个良好的转化系统所必需的。
外植体的侵染时间与抗性芽的转化率有明显关
系, 不同瓜类作物的侵染时间稍有差异, 每种外植体
均有其最佳菌液侵染时间。黄瓜(Cucumis sativus)子
叶节最佳侵染时间为7分钟(苏绍坤等, 2006); 甜瓜
(Cucumis melo)子叶最适侵染时间为15分钟(肖守华
等, 2008)。本实验采用南瓜子叶下胚轴为外植体, 侵
染时间为30分钟时, 其转化率最高, 实验中还发现当
侵染时间超过30分钟后, 容易导致外植体中毒并发
生软腐现象, 且筛选培养中除菌较难, 对其生长及丛
生芽的诱导极为不利。
物种和基因型不同, 外植体部位和苗龄不同, 外
植体与农杆菌的最佳共培养时间差异也很大。Toppi
等(1997)分别以西葫芦完整植株和子叶为外植体, 得
付洪冰等: 农杆菌介导南瓜遗传转化体系的建立 477
出共培养时间2天时可以获得最高的转化效率, 接种
时间延长, 转化效率显著下降, 甚至不能成功转化;
肖守华等(2008)以甜瓜的子叶为外植体研究遗传转
化, 得出共培养2–3天抗性芽数最多, 转化效率最高。
本实验以南瓜子叶下胚轴为外植体研究遗传转化, 发
现共培养5天时, 转化效率最高, 与中国农业科学院
生物技术研究中心报道的瓜类共培养时间为4–6天相
一致(贾士荣和王志兴, 1998)。
乙酰丁香酮是植物创伤反应的一种成分, 植物细
胞须在创伤和活跃的代谢状态下才能产生。农杆菌对
植物酚类化合物具有趋化性, 只有当植物产生酚类化
合物时, 才能诱导vir基因的活化。vir基因的活化是启
动T-DNA转移的关键(魏开发等, 2008)。共培养过程
是T-DNA转移与整合的时期, 很多研究证明, 在农杆
菌与外植体共培养的培养基中加入AS, 可提高转化
效率, 但也有在侵染液中加入AS取得很好的转化效
果的报道, 不同研究结果并不一致。苏绍坤等(2006)
在研究黄瓜遗传转化时 , 在侵染菌液中加入了AS,
结果对转化有显著的促进作用; 黄永红等(2007)在研
究甜瓜遗传转化时, 在侵染菌液中也加入了AS, 结
果对转化并无显著影响。本实验结果表明, AS可以更
好地使农杆菌携带的外源基因向外植体转移, 并可提
高T-DNA向外植体的转移效率, 而且当AS浓度达到
100 mg·L–1时可以达到最佳效果, 抗性芽出芽率和转
化效率最高。
除菌剂浓度也是植物转化系统中一个很关键的
因素, 浓度过大会导致外植体不能正常生长, 甚至坏
死, 浓度过小不仅不能抑制细菌的生长而且还会影响
外植体的正常发育。因此本实验进行了Carb和Cef 2
种除菌剂的最适浓度筛选, 同时筛选了外植体的耐受
除菌剂浓度和抑菌的除菌剂浓度, 并比较了这2种除
菌剂的除菌效果, 得出南瓜的最适除菌剂为Cef, 最
适浓度为500 mg·L–1。
综上所述, 本实验的结论可以为今后南瓜基因工
程提供一种高效的遗传转化方法。
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478 植物学报 45(4) 2010
Establishment of Cucurbita moschata Genetic Transformation
System by Agrobacterium tumefaciens Transfection
Hongbing Fu1, Chongshi Cui1*, Xi Zhao2, Qi Liu2
1Horticulture College, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 2Biotechnology Research Institute, Heilong-
jiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150086, China
Abstract Establishing a transformation system is fundamental to transgenic study. We developed an efficient Agro-
bacterium tumefaciens-mediated transformation and screening system for Cucurbita moschata ‘Jinhui 1’. The leaves from
tissue culture were excellent explants for transformation. To construct a genetic transformation system, factors affecting
the transformation frequency included pre-culture time of explants, infection time, and concentration of acetosyringone
(AS). Additionally, co-culture time and the concentration of antibiotics (Carb, Cefotaxime and Kanamycin), which inhibit
the growth of Agrobacterium, were also examined in the adventitious bud. The data were analyzed by DPS software, and
a suitable genetic transformation system was established. Pre-culturation for 0 days, infection for 30 min, AS at 100
mg·L–1 and co-culture for 5 days produced the highest transformation efficiency. The medium with Cefotaxime (500
mg·L–1) and Kanamycin (100 mg·L–1) was optimal for selecting transgenic plant cultivation-resistant shoots on MS for
eventual root induction. PCR and Southern blot results showed the Kanamycin-resistant exogenous gene had been inte-
grated into the genome of Cucurbita moschata.
Key words Agrobacterium tumefaciens, Cucurbita moschata, genetic transformation, PCR, Southern blot analysis
Fu HB, Cui CS, Zhao X, Liu Q (2010). Establishment of Cucurbita moschata genetic transformation system by Agro-
bacterium tumefaciens transfection. Chin Bull Bot 45, 472–478.
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* Author for correspondence. E-mail: shwkj@mail.neau.edu.cn
(责任编辑: 孙冬花)