全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2014, 49 (2): 183–189, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2014.00183
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收稿日期: 2013-01-26; 接受日期: 2013-05-02
基金项目: 国家现代农业产业技术体系专项(No.CARS-25)和农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室项目
* 通讯作者。E-mail: guxingfang@caas.cn

RNAi载体导入黄瓜的遗传转化体系
王烨, 顾兴芳*, 张圣平, 苗晗, 陈国华, 谢丙炎
中国农业科学院蔬菜花卉研究所, 北京 100081
摘要 以黄瓜(Cucumis sativus)子叶和子叶节为外植体, 利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法建立黄瓜遗传转
化体系并进行优化, 将南方根结线虫(Meloidogyme incognita)寄生相关基因的RNA干扰载体导入黄瓜, 通过潮霉素(Hyg)
浓度梯度筛选得到99株潮霉素抗性植株。经PCR和Southern-blot检测, 获得10株目的基因以单拷贝形式整合的转基因黄瓜,
子叶和子叶节的Southern-blot阳性率分别为13.9%和6.9%。该研究建立并优化了RNA干扰载体导入黄瓜的高效遗传转化体
系, 成功获得了转基因黄瓜植株。
关键词 黄瓜, RNAi载体, 子叶, 子叶节, 转基因
王烨, 顾兴芳, 张圣平, 苗晗, 陈国华, 谢丙炎 (2014). RNAi载体导入黄瓜的遗传转化体系. 植物学报 49, 183–189.
随着黄瓜(Cucumis sativus)保护地栽培面积不
断扩大, 加之连作重茬现象严重, 根结线虫对黄瓜生
产的危害日趋严峻。而现有资源中缺乏抗南方根结线
虫的种质资源, 且通过传统育种手段无法解决此问
题。因此需利用转基因技术引入新的外源遗传资源来
拓宽栽培黄瓜的遗传基础。黄瓜的遗传转化研究始于
1986年(Trulson et al., 1986), 但在抗线虫遗传转化
方面的研究较少。于玉梅(2008)构建根结线虫保守基
因16D10的植物表达载体, 通过花粉管通道法转导黄
瓜, PCR检测抗性苗有1株扩增出特异条带。然而利用
根癌农杆菌介导和花粉管通道法未能将16D10构建
的RNAi载体(朱妍妍, 2008)及植物表达载体pCAM-
BIA1301-16D和pCAMBIA1301-22-21(韩欣 , 2010)
转化黄瓜。魏爱民等(2006, 2008)分析多种因素对
EQKAM基因转化黄瓜的影响, 并利用花粉管通道法
经卡那霉素抗性筛选获得抗性苗, 但阳性率低, 仅为
0.14%。此外, 切割柱头、子房注射和子房涂抹等方
法在黄瓜上均有尝试, 实验证明只有切割柱头和子房
注射可将抗线虫基因EQKAM转入黄瓜(张文珠等 ,
2009)。可见, 黄瓜抗根结线虫的遗传转化研究至今
仍缺乏完善的遗传转化体系。
本研究旨在利用农杆菌介导法将南方根结线虫

寄生相关基因的RNA干扰载体pRNAi-m1转化黄瓜,
通过Hyg浓度梯度筛选获得转基因植株, 以此建立黄
瓜遗传转化体系, 为黄瓜抗线虫的转基因研究奠定
基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
本研究所用的实验材料是从新泰密刺黄瓜(Cucumis
sativus L.)中筛选出的纯合自交系。根癌农杆菌
(Agrobacterium tumefaciens)菌株为EHA105, 质粒
载体为pRNAi-m1, 含有潮霉素抗性基因和线虫寄生
相关基因, 由中国农业科学院蔬菜花卉研究所病害组
构建。
MS基本培养基(M5519)、硫辛酸(LA)和乙酰丁香
酮(AS)购自Sigma(上海)生物技术公司。6-BA、ABA、
IAA、AgNO3、头孢霉素(Cef)、卡那霉素(Kan)、利
福平(Rif)、潮霉素(Hyg)、NaCl、酵母粉、蛋白胨均
购自北京拜尔迪生物技术公司。所配制的MS固体(液
体)培养基和LB固体(液体)培养基经高压灭菌后于常
温保存备用。实验所需试剂配制为母液后用一次性过
滤器(0.22 μm)过滤除菌, 于–20°C冰箱中保存备用。
·技术方法·
184 植物学报 49(2) 2014
1.2 转化受体和菌液准备
取饱满的黄瓜种子预浸泡2–3小时, 剥除种皮后用
75%乙醇消毒约30秒, 再用6.5%次氯酸钠消毒15分
钟, 用灭菌的去离子水反复冲洗5次后接种在MS培
养基上, 于黑暗中培养。种子在28°C条件下生长1–2
天, 将子叶部分横切成4块, 以获得子叶外植体。以子
叶节作外植体时要待种子萌发后转入光下培养, 约
4–5天后子叶呈直立状态时切取, 去除1/2子叶仅留2
mm的下胚轴, 并在预培养基PM(表1)上培养2天。
选取含有目的基因载体的农杆菌单菌落, 接种于
50 mg·L–1Kan和50 mg·L–1Rif的LB液体培养基中进
行摇菌, 每分钟250转, 28°C过夜。当OD=0.6–0.8时
收集菌液, 10 000 ×g离心8–10分钟, 弃上清液, 用等
体积MS液体培养基重悬菌体。菌液侵染前添加0.725
mg·L–1AS(张若纬, 2010)。
1.3 遗传转化和再生植株驯化
取切好的新鲜黄瓜子叶外植体于农杆菌悬浊液中侵
染15–20分钟, 取出后用无菌滤纸吸干外植体表面的
菌液, 接种在共培养基C1上, 在25°C黑暗条件下培
养2–3天。采用Hyg浓度为10 mg·L–1的S1培养基对子
叶进行初步筛选, 经过3周的初步选择后将Hyg浓度
提高到25 mg·L–1进行高浓度筛选。在高浓度Hyg的选
择培养基S3中再培养1周, 依旧保持绿色的再生植株
可转到BPM伸长培养基中进行伸长、生根培养。子叶
转化实验均为3次重复。以相同培养条件下未使用
Hyg筛选的黄瓜再生植株作为对照。
预培养基PM上培养2天的子叶节外植体在农杆
菌悬浊液中侵染15–20分钟, 取出后用无菌滤纸吸干
外植体表面的菌液, 接种于共培养基C2上, 于25°C
黑暗条件下培养2–3天。共培养后先采用Hyg浓度为7
mg·L–1的S2培养基进行初步筛选, 经过2周的选择,
再用Hyg浓度为15 mg·L–1的S4培养基对子叶节进行
高浓度筛选。高浓度选择1周后, 将保持绿色的再生
植株转入BPM伸长培养基进行伸长、生根培养。子叶
节的转化实验均为3次重复。以相同培养条件下未经
Hyg筛选的黄瓜再生植株作为对照。本实验的相关技
术已申请专利。
此外, 对在预培养基PM上培养2天的黄瓜子叶
节外植体持续用15 mg·L–1Hyg进行高浓度筛选。所用
的共培养基为C2, 选择培养基为S4。实验设3次重
复。以相同培养条件下未使用Hyg筛选的黄瓜再生植
株作为对照。
发育正常的黄瓜再生植株首先在三角瓶中开始驯
化, 3–5天后将培养瓶的封口膜逐步去掉, 以降低瓶中
的湿度。然后将根系清洗干净移植到花盆中, 保湿1周
后, 黄瓜再生植株便可在温室条件下正常生长。
1.4 转化植株的检测
首先进行PCR检测。以黄瓜转化植株和阴性对照植株
的总DNA为模板, 根据载体和目的基因设计PCR扩
增引物, 预扩增片段大小为525 bp。PCR反应程序为:

表1 黄瓜遗传转化所用培养基成分
Table 1 Composition of media for transformation of cucumber
Media Composition Usage
PM MS+0.5 mg·L–1BA+2.0 mg·L–1AgNO3 Pre-cultivation medium for cotyledon node
C1 MS+2.0 mg·L–1BA+1.0 mg·L–1ABA+1.45 mg·L–1AS Co-cultivation medium for cotyledon
C2 MS+0.5 mg·L–1BA+2.0 mg·L–1AgNO3+1.45 mg·L–1AS Co-cultivation medium for cotyledon node
S1 MS+2.0 mg·L–1BA+1.0 mg·L–1ABA+10 mg·L–1Hyg+400 mg·L–1Cef First select-cultivation medium for cotyledon
S2 MS+0.5 mg·L–1BA+2.0 mg·L–1AgNO3+7 mg·L–1Hyg+400 mg·L–1Cef First select-cultivation medium for cotyledon
node
S3 MS+2.0 mg·L–1BA+1.0 mg·L–1ABA+25 mg·L–1Hyg+400 mg·L–1Cef Second select-cultivation medium for cotyledon
S4 MS+0.5 mg·L–1BA+2.0 mg·L–1AgNO3+15 mg·L–1Hyg +400 mg·L–1Cef Second select-cultivation medium for cotyledon
node
BPM MS+1 mg·L–1GA+400 mg·L–1Cef Medium for regeneration plant
MS Liquid MS, pH5.4 Agrobacterium tumefaciens suspension and
transformation
LB 5 g·L–1 yeast extract+10 g·L–1 tryptone+10 g·L–1NaCl, pH7.0 Agrobacterium tumefaciens cultivation and
preservation

王烨等: RNAi 载体导入黄瓜的遗传转化体系 185
94°C4分钟; 94°C30秒, 53°C30秒, 72°C2分钟, 32个
循环; 72°C10分钟。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电
泳检测。用凝胶成像仪观察扩增目的条带并拍照。
Southern-blot检测按照Sambroook等 (1989)的
方法。用EcoRI酶切约15–20 μg的黄瓜基因组DNA,
37°C温浴过夜。在1%琼脂糖凝胶中进行电泳分离,
用20×SSC转膜, 于120°C固定20分钟, 杂交过夜。利
用Roche地高辛标记试剂盒标记含目的片段的质粒
DNA的PCR产物作为探针进行杂交, 最后进行洗膜、
显色和定影。
1.5 数据分析
相关参数的计算公式如下:
再生频率(%)=分化外植体数/接种外植体总数×100%;
每外植体抗性芽数(个/外植体)=抗性芽数/外植
体总数;
转化效率(%)=PCR或Southern-blot阳性植株数/
再生植株总数×100%。

实验数据采用Duncan’s新复极差法进行差异显著性
检测。
2 结果与讨论
2.1 黄瓜子叶和子叶节外植体基因转化后的植株
再生过程
子叶外植体在初步选择培养基中经过3周的培养可发
育出再生芽。将抗性芽转入高浓度选择培养基后, 一
些假阳性再生芽变黄并停止生长。经过1个月先低后
高浓度的Hyg梯度选择, 将始终保持绿色的抗性芽转
到伸长培养基中培养, 2–3周后可发育为完整植株并
继续进行驯化。
子叶节在低浓度抗生素培养基上筛选2周后可见
发育出的小芽点, 再经高浓度筛选培养基培养1周可
发育为再生芽。对保持绿色的再生抗性芽进行伸长培
养, 1–2周后可获得完整植株, 然后转入MS培养基进
行驯化(图1)。



图1 黄瓜子叶节的遗传转化过程
(A) 预培养; (B) 子叶节再生; (C) 抗性植株; (D) 抗性植株驯化

Figure 1 Regeneration of cucumber cotyledon nodes
(A) Pre-culture cultivation; (B) Cotyledon node regeneration; (C) Regenerated plants; (D) Domestication
186 植物学报 49(2) 2014
2.2 Hyg浓度梯度选择对子叶和子叶节再生频率
的影响
黄瓜子叶和子叶节经Hyg浓度梯度筛选的再生频率见
表2。子叶外植体在10 mg·L–1(低浓度)Hyg条件下经3
周的初步筛选再生频率为76.5%, 但多为伸长困难的
丛生芽。后经25 mg·L–1(高浓度)Hyg选择, 仍保持绿
色的抗性植株率降低到8.8%, 与未进行Hyg筛选的
子叶对照(再生频率为82.7%)之间存在极显著差异。
子叶节外植体在7 mg·L–1Hyg低选择压力下经过2周
的初步筛选, 再生频率为51.8%, 又经15 mg·L–1Hyg
高浓度选择后, 抗性植株率降低到29.6%, 同样与未
经Hyg筛选的子叶节对照之间呈极显著差异。表2数
据证明采用逐步提高的Hyg浓度梯度筛选可极显著降
低黄瓜外植体抗性芽频率, 有效减少假阳性植株。
2.3 PCR验证Hyg浓度梯度选择对黄瓜子叶和子
叶节外植体再生植株阳性率的影响
提取通过诱导子叶和子叶节获得的黄瓜再生植株的
DNA, 对基因组DNA进行目的条带扩增, 将PCR产
物进行琼脂糖凝胶电泳检测, 阳性对照为质粒DNA,
阴性对照为未经农杆菌侵染的黄瓜植株(图2)。
通过10和25 mg·L–1Hyg浓度梯度对子叶再生植
株进行筛选后共获得37株抗性植株 , 其中有12株
PCR产物扩增出目的条带, 平均阳性率为27.8%。而
子叶节外植体经7和15 mg·L–1Hyg浓度梯度筛选后获
得62株再生植株, 其中13株扩增出目的条带, 平均阳
性率为19.3%。表3数据显示, 通过黄瓜子叶途径诱导
获得的再生植株PCR阳性率高于子叶节途径, 初步
证明以黄瓜子叶外植体为介质进行农杆菌遗传转化
的效率更高。
利用SAS软件对数据进行分析。结果表明, 子叶
外植体通过7和15 mg·L–1Hyg梯度选择获得的抗性植
株的PCR平均阳性率为27.8%, 较未使用Hyg选择的
对照平均阳性率(22.4%)有显著升高。但在子叶节实
验中, 通过Hyg梯度筛选获得抗性植株的PCR阳性率
与未经Hyg选择的对照之间无显著差异。PCR检测证
明子叶经过Hyg梯度筛选可显著提高抗性植株的阳性


表2 不同选择压对黄瓜再生频率的影响
Table 2 Effect of different Hyg concentrations on regeneration frequency of cucumber
Type of explants Index
Cotyledon Cotyledon node
Regeneration frequency under low concentration of Hyg (%) 76.5±4.3 51.8±5.4
Regeneration frequency under high concentration of Hyg (%) 8.8±2.5 b 29.6±3.8 b
Regeneration frequency of CK (%) 82.7±5.2 a 87.0±5.0 a
不同小写字母表示差异显著。Low concentration表示对子叶和子叶节采用低浓度Hyg筛选, Hyg浓度分别为7和10 mg·L–1; High
concentration表示对子叶和子叶节采用高浓度Hyg筛选, Hyg浓度分别为15和25 mg·L–1
Different letters indicate significant difference. Low concentration indicates first selection for cotyledon and cotyledon node with 7
and 10 mg·L–1; High concentration indicates second selection for cotyledon and cotyledon node with 15 and 25 mg·L–1



图2 黄瓜再生芽的PCR检测
1–10: 黄瓜抗性再生植株; 11–13: 阳性对照(质粒DNA); 14: 阴性对照

Figure 2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified DNA from leaf tissue of the cucumber regenerated shoot
1–10: Different independently regenerated shoots; 11–13: Positive control (plasmid); 14: Negative control

王烨等: RNAi 载体导入黄瓜的遗传转化体系 187
表3 不同选择压对黄瓜转基因植株PCR阳性率的影响
Table 3 Effect of different Hyg concentrations on PCR positive frequency of transgenic cucumber plants
Type of explant Index
Cotyledon control Cotyledon Cotyledon node control Cotyledon node
Number of plant 84 37 91 62
Number of PCR positive plant 20 12 14 13
PCR positive frequency (%) 22.4±2.1 b 27.8±0.6 a 14.1±3.1 19.3±2.0
不同小写字母表示差异显著。Different letters indicate significant difference.


率, 有效剔除假阳性植株。
2.4 Southern-blot验证Hyg浓度梯度选择对黄瓜
子叶和子叶节外植体再生植株阳性率的影响
将PCR阳性的子叶再生植株提取基因组总DNA, 用
Roche地高辛试剂盒标记探针 , 经Southern-blot检
测 , 有5株出现了杂交信号 (图3), 平均阳性率为
13.9%。同时通过杂交条带数可看出目的基因均以单
拷贝形式插入基因组中。将PCR阳性的子叶节再生植
株提取基因组DNA进行Southern-blot检测, 结果也
有 5株出现了杂交信号 , 平均阳性率为 6.9%。
Southern-blot检测结果证明诱导子叶获得的阳性植
株率比子叶节途径高, 这与PCR实验结果一致。
黄瓜抗性植株的Southern-blot验证结果见表4。
利用SAS软件分析表明, 子叶外植体通过Hyg梯度(7
和15 mg·L–1)选择获得的抗性植株的Southern-blot平
均阳性率为13.9%, 比未使用Hyg梯度选择的对照阳
性率(4.1%)呈极显著升高。在子叶节途径中也获得了
相同的结论, 即Hyg梯度(10和25 mg·L–1)筛选获得抗
性植株的Southern-blot阳性率比未经Hyg梯度选择的
对照有极显著水平的提高。检测结果证明Hyg梯度筛
选可显著提高子叶和子叶节再生抗性植株的阳性率,
有效剔除非转化植株。
2.5 Hyg梯度选择对黄瓜子叶节抗性芽再生率的
影响
采用不同浓度的Hyg对黄瓜子叶节进行筛选的实验结
果见图4。与未经Hyg筛选的对照相比, 持续高浓度
Hyg筛选和先低后高的Hyg浓度梯度选择都会极显著
降低外植体的再生频率。而PCR阳性率在CK、15
mg·L–1Hyg和Hyg梯度筛选这3种处理间均无显著差
异。但Southern-blot检测结果显示, 通过Hyg梯度筛


图3 黄瓜抗性植株的Southern-blot检测
1–5: 黄瓜抗性再生植株; 6: 阳性对照(质粒DNA); 7: 阴性对照

Figure 3 Southern-blot analysis of MiMPK1 digested DNA
isolated from transgenic cucumber plants
1–5: Regenerated shoots; 6: Positive control (plasmid); 7:
Negative control


选的抗性植株的阳性率极显著高于对照和持续用15
mg·L–1Hyg高浓度筛选, 再次证明对黄瓜子叶节进行
7和15 mg·L–1Hyg梯度筛选的有效性。
2.6 讨论
2.6.1 Hyg筛选策略对黄瓜遗传转化的影响
在农杆菌介导的遗传转化方法中, 绝大多数体系从开
始就采用高浓度抗生素进行筛选, 但鉴于黄瓜植株对
抗生素类选择剂极其敏感, 因此转化效率普遍不高。
究其原因是在诱导分化初期采用高浓度的抗生素会
抑制部分代谢尚未完全正常的转化细胞的生长(张守
杰, 2011), 在这些转化细胞分化出新细胞或组织前
就已将其杀死。因此传统的持续高浓度筛选过程使黄
瓜转化效率普遍较低。本实验通过采用逐步提高的
Hyg浓度对子叶节进行筛选, 比始终采用高浓度Hyg
筛选获得的抗性植株更多, 且PCR和Southern-blot
检测结果显示阳性率也更高, 为黄瓜遗传转化提供了
更高效的方法。在细胞分化之初仅采用低浓度抗生素
筛选, 使转化细胞得到更多生长发育的机会, 从而在
最大程度上保证转化细胞的生长。待芽原基发育完成
后, 进一步提高抗生素浓度来剔除其中的假阳性植

188 植物学报 49(2) 2014
表4 不同选择压对黄瓜转基因植株Southern-blot阳性率的影响
Table 4 Effect of different Hyg concentration on Southern-blot positive frequency of transgenic cucumber plants
Type of explant Index
Cotyledon control Cotyledon Cotyledon node control Cotyledon node
Number of plant 84 37 91 62
Number of Southern-blot positive plant 4 5 3 5
Southern-blot positive frequency (%) 4.1±1.1 b 13.9±1.0 a 3.1±0.5 b 6.9±1.0 a
不同小写字母表示差异显著。Different letters indicate significant difference.



图4 不同选择压对黄瓜子叶节遗传转化的影响

Figure 4 Effect of different Hyg concentration on cucumber
cotyledon node transformation


株。这是利用Hyg浓度梯度筛选获得较其它黄瓜遗传
转化方法更高转化效率的重要原因。随着遗传转化技
术的发展, 改用其它非抗性标记基因如GFP(Selvaraj
et al., 2010)可能会使黄瓜在遗传转化过程中对抗生
素敏感问题有所改善。

2.6.2 子叶和子叶节2种外植体在黄瓜遗传转化体
系中的差异
本研究结果表明, 子叶和子叶节在再生频率和抗性植
株阳性率上均存在较大差异, 子叶节的优势在于生长
周期短, 茎的伸长和生根过程不存在较大困难, 但假
阳性率较高, 达到93.1%; 而子叶外植体虽然诱导分
化困难, 成苗率低, 但再生芽可以耐受高浓度的抗生
素筛选, 假阳性率为86.1%。筛选过程中还发现, 子
叶外植体上的转化细胞在筛选初期便能在 10
mg·L–1Hyg下保持分化能力 , 当Hyg浓度提高到25
mg·L–1时还可以保持绿色, 经过约5周的梯度选择到
成苗阶段时甚至可以耐受30 mg·L–1Hyg。而从子叶节
外植体上获得的再生植株在Hyg浓度提高到 12
mg·L–1就开始白化, Hyg浓度提高到20 mg·L–1时则基
本全部白化。子叶外植体上获得的抗性植株对Hyg耐
受能力更强的原因在于进行子叶侵染的时期比子叶
节要提前3–4天, 即2种外植体所处的发育期不同, 诱
导分化期开始越早的分化组织似乎分生能力越强
(Vasudevan et al., 2007; Szwacka et al., 2007), 且
转化细胞对抗生素的耐受力也越高, 但其原因尚待进
一步探究。由此可见, 对于通过高浓度抗生素筛选来
降低阳性率而言, 子叶比子叶节更适合作为黄瓜遗传
转化的外植体。
农杆菌遗传转化法自成功应用于原生质以来, 就
被研究者广泛用于多种植物, 同时也被不断地改进,
以期达到更简便、高效的目的。本方法基于前人探索
的抗生素梯度筛选的农杆菌转化法, 实验结果为研究
转基因黄瓜对根结线虫的抗性奠定了基础。同时利用
本方法将目的基因超表达载体成功转化黄瓜, 可为黄
瓜及其它植物遗传转化体系的建立和优化提供参考。
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Transformation of RNAi Vector in Cucumber (Cucumis sativus) In
Vitro by Agrobacterium tumefaciens-mediated Transfection
Ye Wang, Xingfang Gu*, Shengping Zhang, Han Miao, Guohua Chen, Bingyan Xie
Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
Abstract The RNAi vector of the target gene was transfected into cucumber (Cucumis sativus) cotyledons and cotyle-
don nodes by Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection. A total of 99 regeneration plants were hygromy-
cin-resistant. PCR and Southern-blot analysis revealed that target gene was integrated into the genome of 10 regenerated
plants. The transformation efficiency in the cucumber cotyledon and cotyledon node was significantly increased from
4.1% to 13.9% and 3.1% to 6.9%, respectively, when using different hygromycin concentrations in the selection cultiva-
tion. We have optimized the genetic transformation system with an RNA interference vector in cucumber and successfully
obtained transgenic cucumber plants.
Key words cucumber, RNAi vector, cotyledon, cotyledon node, transformation
Wang Y, Gu XF, Zhang SP, Miao H, Chen GH, Xie BY (2014). Transformation of RNAi vector in cucumber (Cucumis
sativus) in vitro by Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection. Chin Bull Bot 49, 183–189.
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* Author for correspondence. E-mail: guxingfang@caas.cn
(责任编辑: 白羽红)