全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2013, 48 (6): 643–650, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2013.00643
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收稿日期: 2012-11-01; 接受日期: 2013-02-04
基金项目: 国家自然科学基金(No.J1103516)、北京市科学技术研究院青年骨干计划(No.2012-017)和北京市自然科学基金(No.5133036)
* 通讯作者。E-mail: zliangcheng@aliyun.com
植物冰冻切片条件的优化及其与石蜡切片在
组织化学应用中的比较
李建霞1, 张出兰1, 夏晓飞2, 赵良成1*
1北京林业大学生物科学与技术学院, 北京 100083; 2北京自然博物馆, 北京 100050
摘要 冰冻切片是植物组织学研究中一项重要的实验技术, 冷冻温度和冷冻时间是决定切片质量的关键因素。通过比较15
种冰冻切片条件, 得出植物组织直接冰冻切片较适宜的冷箱温度、冷台温度和冷冻时间。同时, 通过对5种植物的不同组织
进行组织化学染色, 比较了新鲜材料直接冰冻切片与常规石蜡切片在不同化学成分鉴定上的异同及各自的适用范围。结果
表明, 对于多糖、蛋白质和角质, 两种切片方法的鉴定结果比较一致, 但对于脂肪只能采用冰冻切片技术。研究结果对植物
组织学实验和研究方法的改进具有一定的参考价值。
关键词 冰冻切片, 组织化学染色, 石蜡切片, 植物组织
李建霞, 张出兰, 夏晓飞, 赵良成 (2013). 植物冰冻切片条件的优化及其与石蜡切片在组织化学应用中的比较. 植物学报
48, 643–650.
冰冻切片(cryo-sectioning, frozen section)是将
生物组织置于低温下迅速冻结达到一定硬度后进行
切片的一种实验技术。与常规的石蜡切片相比, 它不
经脱水、透明、浸蜡等步骤, 因此组织不会收缩, 易
保持原有生活形态, 具有快速、简便、易操作等优点,
常用于组织化学、免疫定位及原位杂交等研究(李和
平, 2009)。冰冻切片目前在动物和人体组织的研究中
得到非常广泛的应用。植物细胞因具有液泡, 含水量
比相同体积的动物和人体细胞多, 使得在进行低温切
片时易形成冰晶, 造成植物组织的细胞结构受到伤
害。同时, 由于具有细胞壁也使得植物组织在冰冻后
硬度变大易破碎, 致使多数情况下难以切出结构完整
的切片, 因此该技术在植物组织切片上的应用较少。
近几年来, 有一些报道(林月惠等, 2001; 万怡震和贺
普超, 2001; 陈丹和赵洁, 2005; 刘剑锋等, 2006a,
2006b; 宁代锋等, 2008; 张新成等, 2008; 陆叶等,
2009; 谢佩松等, 2009; 李儒海和强胜, 2010)对冰冻
切片技术在植物不同器官和组织的应用及方法进行
了探讨, 但这些方法大多数是将实验材料经过FAA或
多聚甲醛等固定液固定、冰冻保护剂保护或液氮速冻
等处理后才能得到较好的切片效果, 不仅过程较为复
杂, 而且切片条件各异, 对于初学者较难掌握。
新鲜材料不经处理直接包埋冷冻切片的方法在
动物组织中经常被采用且效果良好。在植物组织中,
陈丹和赵洁(2005)、陆叶等(2009)报道未经固定的材
料直接切片效果差, 难以得到结构完整的切片; 而宁
代锋等(2008)则采用直接包埋和适当回温相结合的
方法, 取得了较好的切片效果。
根据资料和我们的实验观察, 新鲜材料能否获得
组织结构完整的高质量的冰冻切片, 主要取决于材料
冷冻时的温度(包括冷箱温度和冷台温度)以及冷冻时
间等因素。基于以上情况, 本研究以毛白杨(Populus
tomentosa)子房为实验材料, 尝试比较了15种冰冻
切片条件, 获得了适合新鲜材料直接包埋冷冻切片的
冷箱温度、冷台温度和冷冻时间。在此基础上, 将这
些条件应用于大叶黄杨(Euonymus japonicus)、旱柳
(Salix matsudana)、南蛇藤(Celastrus orbiculatus)、
油松(Pinus tabuliformis)4种植物新鲜材料的不同组
织上, 也获得了良好的切片效果。实验证明这一方法
是可行的, 并具有一定的普适性。该方法不仅简化了
切片过程, 节省了时间, 也避免了使用固定剂和保护
剂的弊端, 便于在植物学教学和研究中广泛应用。
·技术方法·
644 植物学报 48(6) 2013
本研究以毛白杨、旱柳、望春玉兰 (Magnolia
biondii)、国槐(Sophora japonica)、丝棉木(Euonymus
maackii)5种植物的不同组织为实验材料, 对新鲜材
料直接冰冻切片和固定后材料石蜡切片在植物组织
化学中的应用作了比较, 观察两种切片技术在鉴定多
糖、蛋白质、脂肪和角质等不同化学成分上的异同及
其各自的适用特点, 以期为人们在组织化学分析中对
两种切片技术的选择和应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 实验材料
毛白杨(Populus tomentosa Carr.)取自中国科学院半
导体研究所内的行道树, 选取生长良好的雌花进行实
验。大叶黄杨(Euonymus japonicus Thunb.)、旱柳
(Salix matsudana Koidz.)、南蛇藤 (Celastrus or-
biculatus Thunb.)、望春玉兰 (Magnolia biondii
Pampan.)、丝棉木(Euonymus maackii Rupr.)、国槐
(Sophora japonica L.)和油松 (Pinus tabuliformis
Carr.)均取自北京林业大学校园, 分别选择生长良好
的花、果实、种子和叶作为实验材料。
1.2 实验仪器
实验仪器包括Leica CM1950冰冻切片机、Leica
RM2126RT切片机、Olympus BX51光学显微镜及其
附带的Olympus DP75数码相机。
1.3 方法与步骤
1.3.1 冰冻切片法
为了对不同冰冻切片条件进行比较, 将实验材料分3
类情况进行处理, 具体实验步骤如下。
第1类为新鲜材料直接切片(表1, 序号1–6)。将材
料浸没在OCT包埋剂中20分钟, 之后移入样品台上
使样品深埋其中 , 将样品台放入不同冷箱温度
(chamber temperature) 和 冷 台 ( 样 品 头 ) 温 度
(specimen-head temperature)(操作温度见表1中序
号1–6)的机箱中冷冻20–40分钟后, 再将其固定后切
片, 切片厚度为10–15 μm。最后将切片按顺序依次粘


表1 以毛白杨子房为材料的15种冰冻切片条件比较
Table 1 Comparison of 15 frozen sectioning conditions for the ovary of Populus tomentosa
Number Process step Chamber
temperature (°C)
Specimen-head
temperature (°C)
Freezing
time (min)
Sectioning
effect
1 OCT, 20 min –25 –22 30 – –
2 OCT, 20 min –25 –22 20 +
3 OCT, 20 min –18 –15 30 +++
4 OCT, 20 min –18 –15 20 –
5 OCT, 20 min –18 –15 40 –
6 OCT, 20 min –15 –13 30 – –
7 10% glycerin, 3 h; OCT, 20 min –20 –18 30 +
8 15% glycerin, 3 h; OCT, 20 min –20 –18 30 –
9 70% alcohol fixed 3 h; 10% glycerin, 3 h; OCT, 20 min –20 –18 30 – –
10 70% alcohol fixed 3 h; 15% glycerin, 3 h; OCT, 20 min –20 –18 30 – –
11 FAA fixed 3 h; 10% glycerin, 3 h; OCT, 20 min –23 –21 30 ++
12 FAA fixed more than 12 h; OCT, 20 min –23 –21 30 –
13 4% polyformaldehyde fixed; 10% glycerin, 3 h; OCT,
20 min
–20 –18 30 ++
14 4% polyformaldehyde fixed; 10% glycerin, 3 h; OCT
embedding in liquid nitrogen 8–10 s; –25°C tempera-
ture back 1 h
–23 –21 5 +
15 4% polyformaldehyde fixed; 10% glycerin, 3 h; Liquid
nitrogen 8–10 s; –25°C temperature back 1 h
–23 –21 5 –
+: 切片效果好; –: 切片效果差。+: Good sectioning effect; –: Bad sectioning effect

李建霞等: 植物冰冻切片条件的优化及其与石蜡切片在组织化学应用中的比较 645
在经多聚赖氨酸处理过的载玻片上。
第2类为冷冻保护剂处理(表1, 序号7–8)及固定
剂固定后(表1, 序号9–13)切片。(1) 冷冻保护剂处理:
将新鲜材料分别放入10%和15%甘油中, 真空抽气
20分钟, 使材料空腔完全被甘油所填充, 然后取出置
于20°C培养箱中放置3小时, 再经OCT包埋20分钟,
移入冷箱温度–20°C、冷台温度–18°C的机箱中冷冻30
分钟后, 进行切片。(2) 70%乙醇固定: 将新鲜材料在
70%乙醇中固定3小时, 然后分别将其移入10%和15%
的甘油中, 真空抽气20分钟后置于20°C培养箱中放置
3小时, 最后将其浸在OCT包埋剂中20分钟, 移入冷箱
温度–20°C、冷台温度–18°C的机箱中冷冻30分钟后,
进行切片。(3) FAA固定: 将新鲜材料分别在FAA(福尔
马林:冰醋酸:70%乙醇=5:5:90, v/v)中固定3小时和12
小时以上。前者再放入10%甘油20分钟, 之后在培养箱
中放置3小时, 最后浸于OCT包埋剂中20分钟, 移入冷
箱温度–23°C、冷台温度–21°C的机箱中冷冻30分钟后,
进行切片; 后者直接置于OCT包埋剂中20分钟, 移入
机箱中冷冻30分钟后, 进行切片。(4) 多聚甲醛固定:
将新鲜材料投入含4%多聚甲醛、100 mmol·L–1磷酸缓
冲液(PBS, pH7.2)的固定液中, 经1小时真空处理后,
于4°C下继续固定过夜, 固定的样品经磷酸缓冲液浸洗
2–3次后, 浸入10%甘油中3小时, 然后再浸入OCT包
埋剂中20分钟 , 移入冷箱温度–20°C、冷台温度
–18°C的机箱中冷冻30分钟后, 进行切片。
第3类为液氮处理后切片(表1, 序号14–15)。将
新鲜材料经4%多聚甲醛固定和100 mmol·L–1磷酸缓
冲液浸洗后, 再浸入10%甘油中3小时, 然后用OCT
包埋剂包裹在适当大小的盒内 , 用液氮迅速冷冻
8–10秒; 或不用包埋剂包裹直接用液氮冷冻8–10秒,
随后尽快将样品移至冰冻切片机内, 样品经1小时回
温后再用包埋剂粘在样品台上进行切片。

1.3.2 石蜡切片法
先将实验材料浸入FAA固定液固定24小时以上, 经
梯度乙醇(50%、70%、85%、95%、100%, 每级2
小时)脱水、二甲苯透明(1/2二甲苯+1/2乙醇、纯二甲
苯2次, 每级2小时)、浸蜡和包埋后, 进行连续切片,
切片厚度为8 μm, 然后进行展片、粘片、凉片。之后
进行观察并照相。

1.3.3 染色
(1) 冰冻切片甲苯胺蓝O染色。将切片置于0.05%甲
苯胺蓝O染色30–40秒 , 经蒸馏水清洗、梯度乙醇
(50%、70%、85%、95%、100%)脱水、二甲苯透明
和中性树胶封片后, 进行显微观察和照相。(2) 冰冻
切片组织化学染色。鉴定多糖: 将切片先放入0.5%高
碘酸钾10分钟 , 经蒸馏水洗后 , 放到Schiff试剂中
10–20分钟, 再经蒸馏水洗、叔丁醇脱水, 最后经二
甲苯透明后中性树胶封片。鉴定蛋白质: 将切片先置
于蒸馏水中2分钟, 再放入萘酚黄S中10–20分钟, 经
蒸馏水洗、叔丁醇脱水, 最后经二甲苯透明后中性树
胶封片。鉴定脂类: 切片置于苏丹III试剂中0.5–1小
时, 经蒸馏水洗3次, 50%甘油封片。
石蜡切片组织化学染色与冰冻切片的染色步骤
相似, 但要先经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水。
2 结果与讨论
2.1 不同冰冻切片条件的比较
以毛白杨幼嫩子房为材料, 反复比较15种冰冻切片
条件, 得出以下结果(表1)。对于新鲜材料直接包埋冰
冻切片(序号1–6), 经反复比较, 序号3, 即冷箱温度
–18°C、冷台温度–15°C、冷冻时间30分钟为最适合
的切片条件, 在此条件下所得的切片组织结构清晰,
细胞完整, 内含物清晰可见(图1A, B)。序号2, 冷箱温
度–25°C、冷台温度–22°C、冷冻时间20分钟, 切片
的结构也较清晰, 但完整度上不如序号3。序号1、4、
5、6得到的切片有较多的冰晶, 效果差, 材料破损严
重(图1C)。对于经冷冻保护剂和固定剂处理的材料(序
号7–13), 序号7以10%甘油作为保护剂, 序号11经
FAA固定、10%甘油处理, 序号13经4%多聚甲醛固
定、10%甘油处理, 切片效果也较好, 能切出完整的
子房结构, 但有时细胞被破坏或细胞间有较大裂隙
(图1E), 其它则很难获得完整性好、细胞结构受破坏
较少的子房切片(图1D)。对于多聚甲醛固定、10%甘
油处理后再经液氮快速冷冻的材料(序号14–15), 序
号14先用OCT包埋, 虽能得到较完整的子房形态, 但
细胞结构被严重破坏(图1F)。序号15不经OCT包埋而
难以得到结构完整的切片。
将以上由毛白杨子房为材料得到的最佳冰冻切
646 植物学报 48(6) 2013



图1 以毛白杨子房为材料的15种冰冻切片条件下切片效果的比较
(A) 序号3条件下组织结构完整的切片(Bar=50 μm); (B) 序号3条件下组织结构放大, 细胞形态清晰(Bar=20 μm); (C) 序号1条件下
组织破损严重的切片(Bar=50 μm); (D) 序号15条件下组织结构不完整且破损严重的切片(Bar=50 μm); (E) 序号11条件下组织较完
整, 但细胞间隙较大(Bar=100 μm); (F) 序号14条件下经液氮处理细胞结构被破坏的切片(Bar=50 μm)

Figure 1 Comparison of 15 different frozen sectioning conditions on the ovary of Populus tomentosa
(A) The tissue complete in No.3 condition (Bar=50 μm); (B) The amplification in No.3 condition, showing clear cell morphology
(Bar=20 μm); (C) The tissue structure damaged seriously in No.1 condition (Bar=50 μm); (D) The tissue incomplete and structure
damaged seriously in No.15 condition (Bar=50 μm); (E) The tissue more complete but having larger gaps between cells in No.11
condition (Bar=100 μm); (F) The cell structure damaged seriously by liquid nitrogen treatment in No.14 condition (Bar=50 μm)


片条件分别应用于其它4种植物的不同组织, 进行直
接包埋冷冻切片。结果显示, 在旱柳子房以及大叶黄
杨花上也得到了结构完整、细节清晰的切片 (图
2A–C)。对于南蛇藤果实以及油松的成熟针叶, 切片
时硬度较大, 容易破碎, 但将冰冻时间由30分钟缩短
为15–20分钟, 也得到了效果良好的切片(图2D–F)。
2.2 冰冻切片和石蜡切片在植物组织化学应用上
的比较
2.2.1 多糖
经Schiff试剂染色, 对毛白杨子房壁上的多糖进行鉴
定。结果显示, 在冰冻切片中, 多糖被染成红色, 在
整个子房壁上均有分布, 其中内表皮细胞含量最多,
中间的薄壁组织次之, 外表皮细胞最少(图3A)。相同
材料和染色方法的石蜡切片与之相比, 多糖颗粒的颜
色、大小及分布部位等基本一致, 但数量略少, 密度
较小(图3B)。在组织结构方面, 石蜡切片比冰冻切
片更加清晰。

2.2.2 蛋白质
采用萘酚黄S染色法, 对望春玉兰种子胚乳和国槐种子
子叶中的蛋白质进行鉴定。结果显示, 在冰冻切片(图
3C, D)和石蜡切片(图3E, F)中, 大量的蛋白质经染色
后均呈一致的黄色, 并呈团状聚集分布。冰冻切片中的
蛋白质颗粒密度更大一些, 但清晰度较石蜡切片差。

2.2.3 脂肪
采用苏丹III染色法, 对望春玉兰肉质外种皮中贮藏的
营养物质脂肪进行鉴定。结果显示, 两种切片方法对
脂肪的鉴定存在显著差异。在冰冻切片中(图3G), 外
种皮中的大量脂肪被染成鲜红色, 以大小不等的油滴
形式聚集分布; 而在石蜡切片中(图3H), 经苏丹III染
色后, 肉质种皮内无显色反应, 脂肪聚集的区域被很
多大小不等的空泡所替代。

2.2.4 角质
采用苏丹III染色法, 对旱柳子房壁和丝棉木成熟假种
李建霞等: 植物冰冻切片条件的优化及其与石蜡切片在组织化学应用中的比较 647


图2 不同植物组织在最适冰冻切片条件下的切片
(A) 大叶黄杨花(Bar=200 μm); (B) 图A的局部放大(Bar=50 μm); (C) 旱柳胚珠(Bar=10 μm); (D) 南蛇藤幼果(Bar=200 μm); (E) 图
D的局部放大(Bar=50 μm); (F) 油松成熟针叶(Bar=100 μm)

Figure 2 Different plant tissue sections in optimum frozen section condition
(A) The flower of Euonymus japonicus (Bar=200 μm); (B) The local amplification of Figure A (Bar=50 μm); (C) The young ovule
of Salix matsudana (Bar=10 μm); (D) The young fruit of Celastrus orbiculatus (Bar=200 μm); (E) The local amplification of Figure
D (Bar=50 μm); (F) The mature needle of Pinus tabuliformis (Bar=100 μm)


皮上的角质进行鉴定。结果显示, 旱柳子房壁表皮细
胞上的角质层在冰冻切片(图3I)和石蜡切片(图3J)中
均被染成了橘红色; 丝棉木假种皮表面的角质层在冰
冻切片(图3K)和石蜡切片(图3L)中均被染成了橘黄
色。这表明两种切片技术对同一材料角质的染色鉴定
结果基本一致。
2.3 讨论
2.3.1 不同冰冻切片条件的比较
第1种情况, 新鲜材料直接包埋冷冻切片的关键是既
有适合切片的冷冻温度, 又有最大程度减少冰晶形成
的冷冻时间。为了得到适宜的冷冻温度和冷冻时间,
分别在冷箱温度–15°C、–18°C、–25°C和冷台温度
–13°C、–15°C、–22°C的条件下 , 冷冻不同时间
(20–40分钟), 观察切片效果。通过反复比较, 我们发
现, 冷箱温度–18°C、冷台温度–15°C、冷冻时间30
分钟切片效果最好。具体来说, 一方面, 在这一冷冻
温度下, 若冷冻时间太短(20分钟), 因为组织本身较
软, 会因包埋剂和材料的硬度不一致, 在切片时易产
生空洞而影响成片; 若时间太长(40分钟)则会导致冰
晶太多, 细胞破损, 故30分钟较为适宜。另一方面,
在30分钟的冷冻时间下, 若冷冻温度过低(<–20°C)
或过高(>–15°C), 会造成材料硬度太大或不够, 在切
片时不易成片, 确定–18 – –15°C比较适宜。另外, 最
好使冷台温度比冷箱温度高2–3°C, 否则可能会因为
冷箱温度较高而卷片, 致使无法贴片。陆叶等(2009)
在冷箱温度和冷台温度为–24 – –22°C对材料直接包
埋切片, 成片效果不理想, 推测可能是由于冷冻温度
较低所致, 但由于没有说明冷冻时间, 因而无法作进
一步比较。
将以上毛白杨子房的最佳冰冻切片条件用于旱
柳子房及大叶黄杨花2种未经处理的新鲜材料, 也得
到了良好的切片效果。说明这一条件对于这类较柔软
的植物组织具有一定的普适性。但对于本身较硬的组
织, 如南蛇藤果实和油松成熟针叶, 若直接用以上条
件, 则会使材料硬度太大, 不易切片。通过对比实验,
我们发现, 在冷冻温度不变的条件下, 将冷冻时间缩
短为15–20分钟, 即可取得良好的效果。宁代锋等
(2008)在冷箱温度和冷台温度均为–20°C的条件下,
对杨树茎采用直接包埋和适当回温相结合的方法, 也
获得了较好的切片效果。因此, 对这类硬度较大的组
织, 可通过适当回温或者缩短冷冻时间等手段来降低
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图3 冰冻切片和石蜡切片在植物组织化学染色中的比较
(A), (C), (E), (G), (I), (K) 冰冻切片; (B), (D), (F), (H), (J), (L) 石蜡切片
(A), (B) 毛白杨子房壁, 箭头示内表皮细胞多糖(Bar=10 μm); (C), (D) 望春玉兰胚, 箭头示蛋白质颗粒(Bar=20 μm); (E), (F) 国槐
种子子叶, 箭头示蛋白质颗粒(Bar=20 μm); (G), (H) 望春玉兰肉质种皮, 图G箭头示脂肪油滴(Bar=50 μm), 图H箭头示空泡
(Bar=50 μm); (I), (J) 旱柳子房壁, 箭头示角质层(Bar=20 μm); (K), (L) 丝棉木成熟假种皮, 箭头示角质层(Bar=100 μm)

Figure 3 Comparison of frozen section and paraffin section in plant histochemistry staining
(A), (C), (E), (G), (I), (K) Frozen section; (B), (D), (F), (H), (J), (L) Paraffin section
(A), (B) Ovary wall of Populus tomentosa, showing the polysaccharide in intraepidermal cells (arrow)(Bar=10 μm); (C), (D) Em-
bryo of Magnolia biondii, showing the protein (arrow)(Bar=20 μm); (E), (F) Cotyledon of Sophora japonica, showing the protein
(arrow)(Bar=20 μm); (G), (H) Sarcotesta of Magnolia biondii, showing the drop of fatty oil in Figure G (arrow) and the fatless
vacuole in Figure H (arrow)(Bar=50 μm); (I), (J) Ovary of Salix matsudana, showing the cuticle (arrow)(Bar=20 μm); (K), (L)
Mature aril of Euonymus maackii, showing the cuticle (arrow)(Bar=100 μm)


材料切片时的硬度。
第2种情况, 对实验材料分别用FAA、多聚甲醛、
乙醇等固定剂进行固定以及不同浓度的甘油处理。其
中, 甘油作为一种冷冻保护剂, 可使组织内的自由水
减少, 降低细胞液冰点, 较少产生冰晶, 因而在冷冻
切片材料处理中经常被用到。但选择适宜的浓度十分
重要, 因材料硬度不同而甘油浓度也不同。李儒海和
强胜(2010)的实验结果表明, 15%的甘油比较适合于
杂草果实等质地较硬的材料。本研究使用10%和15%
两种浓度甘油进行切片对比, 结果显示10%甘油处理
的效果较好, 可得到组织结构完整的切片。需要指出
的是, 根据曾继吾等(2005)报道, 冰冻保护剂在脱水
过程中会使细胞发生质壁分离, 细胞膜发生不可逆变
化, 从而给细胞带来损伤。因此, 如果要观察细胞的
超微结构, 在冰冻切片时最好避免使用甘油。另外,
用FAA和4%多聚甲醛固定, 再加以10%甘油作为保
护剂, 所得的切片也较好, 切片质量接近不经固定的
新鲜材料, 只是过程较为繁琐。但用70%乙醇固定的
材料 , 无论加甘油与否 , 切片效果都很差 , 组织易
碎、不完整, 这可能与乙醇本身容易使材料变硬、变
脆有关。
第3种情况, 对材料先用4%多聚甲醛固定和10%
甘油处理, 再经液氮速冻。液氮超低温速冻对植物细
胞损伤较大, 因此使用这一处理方法必须把握精确的
冷冻时间。陈丹和赵洁(2005)曾提出适合植物花器官
的蔗糖保护——液氮速冻的冰冻切片方法。本文参考
李建霞等: 植物冰冻切片条件的优化及其与石蜡切片在组织化学应用中的比较 649
了该方法, 但将其中的保护剂改为10%甘油, 直接液
氮速冻8–10秒, 所得切片效果不佳, 组织结构被严重
破坏且细胞间有较大的裂痕。在液氮处理前将材料用
OTC包埋剂包埋, 以减少液氮超低温对组织的损伤,
虽有一定的效果, 但切片后细胞间仍有较大的裂痕。
宁代锋等(2008)的实验也证实经液氮冷冻处理的植
物细胞内膜系统损伤严重。因此, 如果要观察细胞的
超微结构, 在冰冻切片时建议避免使用液氮处理。
综上所述, 在以上3种情况下, 第1种情况根据材
料自身硬度的特点, 选取合适的冷冻温度和冷冻时
间, 直接包埋进行冷冻切片, 既能保持完整的组织结
构、清晰的细胞形态, 也能避免固定液、保护剂的处
理和液氮对细胞结构的伤害, 较好地保持组织细胞生
活的原有形态, 最为简捷且效果较好。但材料需即采
即做, 以保证组织内的物质不会被分解。

2.3.2 植物组织化学成分鉴定比较及适用性
组织化学分析是研究细胞和组织中物质的化学组成、
分布和含量的一种重要手段。长期以来, 在植物组织
化学研究中通常采用常规的石蜡切片, 用特定的化学
试剂对其中的多糖、蛋白质和脂类等物质进行鉴定。
但石蜡切片操作较为繁琐, 且要使用多种化学试剂,
可能会影响组织中一些化学成分的鉴定。近年来, 随
着冰冻切片技术的应用和发展, 在植物组织化学研究
中越来越受到重视。关于新鲜材料直接冰冻切片和材
料固定后石蜡切片在植物组织化学成分鉴定上的比
较及各自的适用特点, 尚未见报道。
本研究发现, 对于多糖和蛋白质这两种植物细胞
中最常见的化学成分, 分别通过Schiff试剂和萘酚黄
S染色, 冰冻切片和石蜡切片均能很好地通过显色反
应显示出其含量多少及分布状况, 在鉴定结果上差别
不大, 实验显示石蜡制片过程中的化学试剂对这两种
成分没有或影响很小, 所以两种技术均可以采用。在
实际操作中, 应根据材料自身的特点来选择。若材料
特别小、较柔软或木质化较严重时可以采用冰冻切片
技术; 其它材料可以用石蜡切片。但在鉴定植物细胞
中的脂肪时, 只能用冰冻切片。其原因是石蜡制片要
经过乙醇、二甲苯等一系列有机溶剂的处理, 以油滴
状态存在于细胞中的脂肪会被二甲苯溶解, 没有显色
反应, 而冰冻切片不经二甲苯等处理, 能很好地将脂
肪保存下来。除以上3类植物细胞主要化学成分外,
我们也比较了两种切片技术对角质的染色鉴定。角质
是植物各器官表面普遍存在的一种物质, 主要由超长
链脂肪族化合物、环状化合物及甾醇类化合物等组成
(Jetter et al., 2006), 它存在于表皮细胞外壁, 构成
结构和厚度各不相同的角质层。染色结果显示, 角质
层中的主要成分脂类可能具有特殊的结构或成分, 在
石蜡制片中并不会被二甲苯溶解, 仍有明显的显色反
应, 与冰冻切片的鉴定效果基本一致, 因此采用两种
技术都可以鉴定角质。
值得一提的是, 尽管这两种切片技术对于多糖、
蛋白质、角质的染色和分布状况的鉴定结果比较一致,
但有两点略有不同。一是各物质的数量有一定差异,
冰冻切片显示数量均较多或密度较大, 而石蜡切片显
示数量均略少或密度较稀疏; 二是石蜡切片显示的组
织和细胞结构清晰度普遍要比冰冻切片更好。这主要
是由于各自的特点所致, 石蜡切片可以连续切片且较
薄(4–8 μm), 而冰冻切片不易连续切片, 一般较厚
(10–20 μm)。因切片厚度不一, 致使利用组织化学染
色鉴定以上物质时, 冰冻切片要比石蜡切片在结果上
出现略多且密的现象。同时, 冰冻切片的新鲜材料在
与染色剂发生反应时, 反应强度也比石蜡切片的材料
更充分。因此, 选择时应根据实验需要和两种切片
技术各自的特点来决定。
总之, 不论是进行组织结构观察, 还是组织化学
分析, 植物冰冻切片都是一种简便有效的技术方法。
本文通过比较实验得出的植物新鲜材料直接包埋冰
冻切片条件, 取得了很好的切片效果。它可以避开固
定液的选择、冰冻保护剂种类和浓度的确定以及液氮
处理时间的摸索等复杂过程以及由此可能产生的对
植物组织和细胞的破坏, 进一步简化了冰冻切片在植
物组织应用中的环节, 是一种简单、快捷、易操作的
方法, 建议推广应用。在进行组织化学成分分析鉴定
时, 应根据实验目的和切片自身的特点来选择使用冰
冻切片或石蜡切片技术, 以便得到更好的实验结果。
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Cryo-sectioning Conditions and Histochemistry Comparison with
Paraffin Sectioning
Jianxia Li1, Chulan Zhang1, Xiaofei Xia2, Liangcheng Zhao1*
1College of Biological Sciences and Biotechnology, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China
2Beijing Museum of Nature History, Beijing 100050, China
Abstract Cryo-sectioning is an important experimental method in plant histology. The freezing temperature and time are
the key factors for section quality. In this paper, we compared 15 different conditions and found the optimal freezing
temperature and time for direct cryo-sectioning of fresh plant tissues. Also, by observing histochemical staining in 5 dif-
ferent tissues, we compared the similarities and differences between cryo-sectioning and paraffin sectioning in identifying
plant chemical substances, and their own application characteristics in plant histochemistry. The 2 methods did not differ
in the identification of polysaccharide, protein and cutin, but only cryo-sectioning could be used for fat identification. This
study is of value for improving experimental methods in plant histology.
Key words cryo-sectioning, histochemistry staining, paraffin sectioning, plant tissues
Li JX, Zhang CL, Xia XF, Zhao LC (2013). Cryo-sectioning conditions and histochemistry comparison with paraffin sec-
tioning. Chin Bull Bot 48, 643–650.
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* Author for correspondence. E-mail: zliangcheng@aliyun.com
(责任编辑: 白羽红)