全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2010, 45 (4): 411–418, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3969/j.issn.1674-3466.2010.04.003

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收稿日期: 2009-08-31; 接受日期: 2009-11-17
基金项目: 国家转基因植物研究与开发专项(No.JY-03-A-11-01)
* 通讯作者。E-mail: guoaiguang@yahoo.com.cn
黄瓜转新型抗菌蛋白基因GNK2-1及其抗枯萎病的研究
刘缙, 田花丽, 王亚红, 郭蔼光*
西北农林科技大学生命科学学院, 陕西省农业分子生物学重点实验室, 杨凌 712100
摘要 GNK2-1为一种来自银杏(Ginkgo biloba)种仁的新型抗真菌蛋白, 具有较强的真菌抗性且性质稳定。序列分析表明,
其结构与所有已知的抗真菌蛋白不同, 而与富含半胱氨酸的植物类受体激酶的胞外结构域相似。为探索GNK2-1基因在黄瓜
(Cucumis sativus)抗病反应中的作用, 利用基因重组技术构建了GNK2-1的高效组成型表达载体, 并利用根癌农杆菌
(Agrobacterium tumefaciens)介导转入黄瓜栽培品种农城3号(Cucumis sativus ‘Nongcheng No.3’)基因组中。通过对获得
的抗性植株进行PCR、RT-PCR和Western blot检测分析, 结果表明GNK2-1基因可在T0代转基因植株中转录表达, 并能在
T1代转基因黄瓜中稳定遗传。离体枯萎病抗性鉴定结果表明, 转GNK2-1基因的黄瓜对枯萎病的抗性增强, GNK2-1可以作
为黄瓜抗病性改良的潜在基因资源。
关键词 抗菌蛋白, 黄瓜, 枯萎病, 转基因
刘缙, 田花丽, 王亚红, 郭蔼光 (2010). 黄瓜转新型抗菌蛋白基因GNK2-1及其抗枯萎病的研究. 植物学报 45, 411–418.
近年来, 利用转基因技术选育抗病品种, 发掘更
多可用于抗病育种的基因资源变得日趋重要。目前,
多种抗菌蛋白基因已被成功应用于植物基因工程抗
病育种研究中(Epple et al.,1997; 梁成罡和何礼远,
2002; Schaefer et al., 2005; 李先碧等, 2007)。银杏
(Ginkgo biloba)起源古老, 被称为“活化石”, 是世
界上著名的孑遗植物。自然界中的银杏树几乎不会感
染疾病, 研究者们围绕这种特殊的植物进行了大量的
抗病研究(Huang et al., 2000; Shen et al., 2005)。本
实验室利用硫酸铵分级盐析、离子交换层析和凝胶过
滤层析的方法, 从银杏种仁中分离纯化到1种表观分
子量约为12 kDa的抗菌蛋白ginkbilobin2-1(GNK2-1)。
该蛋白质由108个氨基酸组成, 含有6个半胱氨酸残
基, 抗菌机制尚不明晰。前期研究表明, 该蛋白质相
对分子量较小且性质稳定, 对于黄瓜镰刀菌(Fusari-
um oxysporum)、瓜类炭疽病菌(Colletotrichum or-
biculare) 以 及 小 麦 全 蚀 病 菌 (Gaeumannomyces
graminis)等植物病原真菌具有广谱体外抑制活性(牛
卫宁和郭蔼光, 2003)。该蛋白结构与其它已知的病程
相 关 蛋 白 (defensin 、 cyclophilin- 、 miraculin- 和
thaumatin-like proteins)不具相似性, 且与被子植物
的胚丰富蛋白(embryo-abundant proteins, EAPs)也
没有相似性, 但与裸子植物白云杉(Picea glauca)胚
胎丰富蛋白有84%的相似性。现已证实, 被子植物
EAPs在胚胎形成和种子萌发过程中受到调控(Dong
and Dunstan, 1999), 因此推测抗菌蛋白GNK2-1可
能在种子成熟(或萌发)过程中, 在抵御病害侵袭方面
起重要作用。保守结构域分析表明, GNK2-1含有一种
富含半胱氨酸的植物类受体激酶的胞外受体结构域
C-X8-C-X2-C (DUF26)。植物类受体激酶是信号传递
途径早期的参与者, 是植物体内信号分子的重要受
体, 几乎参与了所有的细胞代谢过程, 包括生长发
育、表达调控和逆境反应等 (Shiu and Bleecker,
2001; Morris and Walker, 2003; Li et al., 2006)。富
含半胱氨酸的植物类受体激酶(cysteine-rich recep-
tor-like kinases, CRKs)是植物类受体激酶的一个亚
家族, 目前在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中已发现
40多个成员 , 它们在胞外受体结构域中均含有
C-X8-C-X2-C(DUF-26)基序。CRKs通常受病原菌侵
染诱导表达并且与植物防御反应密切相关(Czernic
et al., 1999; Acharya et al., 2007)。本研究将GNK2-1
的开放阅读框(ORF)与CaMV 35S组成型启动子融
·研究报告·
412 植物学报 45(4) 2010
合, 构建植物表达载体pARSGK2-1, 根癌农杆菌介
导转化黄瓜栽培品种, 获得转基因再生植株, 并进一
步研究GNK2-1基因对黄瓜枯萎病抗性的影响, 以期
为进一步探讨GNK2-1基因在植物抗病反应中的作用
机制以及在黄瓜抗病育种中的应用潜力提供参考。
1 材料与方法
1.1 实验材料
黄瓜品种农城3号(Cucumis sativus L. ‘Nongcheng
No.3’)由西北农林科技大学园艺学院蔬菜花卉研究所
提供; 黄瓜尖孢镰刀孢菌(Fusarium oxysporum)菌
株、大肠杆菌(Escherichia coli)感受态菌株DH5α、根
癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101菌株
以及表达载体pART27和中间载体pKANNIBAL均为
本实验室保存。NC膜购自Bio-Rad公司(美国)。RNA-
iso总RNA抽提试剂盒、反转录试剂盒、限制性内切
酶、T4 DNA连接酶以及DNA聚合酶均购自大连
TaKaRa生物有限公司。质粒抽提试剂盒与DNA纯化
试剂盒为OMEGA公司(美国)产品。DAB和辣根过氧
化物酶标记羊抗兔IgG购自Sigma公司。引物合成和
测序均由上海英骏生物技术有限公司完成。其它常规
试剂均为国产或进口分装。
1.2 GNK2-1基因的克隆和植物表达载体的构建
根据GenBank抗菌蛋白ginkbilobin 2基因序列(登录
号: No.DQ496113)设计同源引物: 引物1(粗体为起
始密码子)和引物2(粗体为双终止密码子)。分别在上、
下游引物引入Xho I和BamH I酶切位点; 翻译起始位
点序列按照kozak原则进行优化, 但不改变目的蛋白
的氨基酸序列。
引物1: 5′-CCGCTCGAGACCATGAAGACTAT-
GAGAATGAAT-3′;
引物2: 5′-CGCGGATCCTCATTAGAAGCTCC-
TCTGCTCG-3′。
采用RNAiso试剂提取银杏种仁总RNA。利用
TaKaRa公司的反转录试剂盒将总RNA反转录合成第
1链cDNA, 并且以此为模板, 利用引物1和引物2扩
增抗菌蛋白基因。PCR反应程序为: 94°C预变性5分钟;
94°C 30秒, 50°C 30秒, 72°C 1分钟, 30个循环; 72°C
充分延伸7分钟。PCR产物与中间载体pKANNIBAL均
使用BamH I和Xho I双酶切, 酶切产物切胶纯化后, 用
T4 DNA连接酶16°C连接过夜 , 即将pKANNIBAL中
Loop环内含子序列替换为银杏抗菌蛋白基因GNK2-1
的全长ORF序列, 连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态
细胞, 氨苄青霉素筛选阳性克隆。随机各挑取5个克隆
摇菌, 抽提质粒进行酶切鉴定。酶切鉴定正确的克隆送
上海英骏生物技术有限公司进行DNA测序, 测序正确
的重组质粒命名为pKANGK2-1。使用Not I酶切pKAN-
GK2-1和pART27, 然后用T4 DNA连接酶将GNK2-1的
表达盒连接到酶切后的pART27载体上 , 构建成
GNK2-1转基因载体pARSGK2-1, 对其进行Sal I单酶
切, 鉴定正确性。载体结构如图1B所示。
1.3 根癌农杆菌介导转化黄瓜植株
从平板上挑取含pARSGK2-1质粒的根癌农杆菌
GV3101单菌落, 接种于含有100 mg·L–1壮观霉素、
50 mg·L–1利福平和50 mg·L–1庆大霉素的YEB液体培
养基中 , 28°C每分钟200转 (摇床 )振荡 , 培养至
OD600=0.8时, 吸取10 mL菌液, 4°C下3 600 × g离心
10分钟。收集菌体, 去上清, 用20 mL MS液体培养基
重悬菌液, 用前加入终浓度为200 μmol·L–1的乙酰丁
香酮(AS)即成侵染液。将预培养1–2天的农城3号黄瓜
子叶节浸入侵染液中, 28°C每分钟180转(摇床)振荡,
侵染30分钟后取出, 用灭菌滤纸吸干, 转入共培养
基: MS+0.005 mg·L–1TDZ + 0.1 mg·L–1IAA + 200
μmol·L–1AS, 于 25°C 暗培养 4–5 天。用附加 200
mg·L–1头孢霉素的无菌水轻摇浸泡20分钟, 吸干液
体后转移至筛选培养基: MS + 0.005 mg·L–1TDZ +
0.1 mg·L–1IAA + 100 mg·L–1Kan + 500 mg·L–1 Carb,
25°C培养, 光照强度为21 μmol·m–2·s–1, 每天16小时
光照。10天继代1次, 除去褐化死亡的材料。经数次
继代, 抗性芽长至2–3 cm时, 从基部切下, 转至生根
培养基: 1/2MS + 0.1 mg·L–1IAA + 100 mg·L–1Kan,
进行生根培养。待植株根系发达后, 驯化移栽。
1.4 转基因植株的分子检测
1.4.1 转基因植株的DNA检测
使用改良的CTAB法(Murray and Thompson, 1980)
提取黄瓜叶片基因组DNA。如图1B所示, 根据35S启
动子序列设计上游引物 , JCSGKF: 5-AGTTCGA-
AGGTGAAGGTGAC-3; 根据目的基因GNK2-1序列
刘缙等: 黄瓜转新型抗菌蛋白基因 GNK2-1 及其抗枯萎病的研究 413


图1 GNK2-1基因的编码蛋白序列及植物表达载体的构建
(A) 推导的GNK2-1蛋白序列与GNK2蛋白序列同源性比较 突变氨基酸用不同颜色表示, 黑框表示DUF26结构域, 黑点表示结构
域内保守半胱氨酸残基C-X8-C-X2-C; (B) 植物表达载体pARSGK2-1的T-DNA区结构图 黑色箭头表示的区域为PCR扩增区域, 分
别是基因和启动子区(1.3 kb)及磷酸转移酶基因(0.7 kb); Not I和Sal I表示酶切位点; (C) 植物表达载体pARSGK2-1的酶切鉴定。 M:
DNA分子量标准; 1: Sal I 酶切pARSGK2-1重组质粒

Figure 1 Sequence of GNK2-1 protein and construction of plant expression vector
(A) Alignment of deduced GNK2-1 protein sequence and GNK2 protein sequence The black box showed DUF26 motif and the
different color indicated the residues of ginkbilobin2-1 different from ginkbilobin 2, conserved cys residues in CRKs are indicated
by dots below the sequences, respectively; (B) Diagram of plant expression vector pARSGK2-1 Bold arrowes showed
PCR-amplification regions for confirming GNK2-1 gene and 35S promoter sequence region (1.3 kb) and phosphotransferase
gene (0.7 kb). Sal I and Not I indicated restriction enzyme recognition sites; (C) Enzyme analysis of plasmid pARSGK2-1. M:
DNA marker; 1: pARSGK2-1 digested with Sal I


设计下游引物 , JCSGKR: 5-TTAGAAGCTCCTC-
TGCTCG-3; 预期扩增产物片段大小为1 292 bp。扩
增程序为: 94°C预变性5分钟; 94°C30秒, 55°C退火
40秒, 72°C2分钟, 35个循环; 72°C延伸10分钟。根据
表达载体携带的标记基因NPTII序列设计特异引物,
NPTF: 5-CTGGGCACAACAGACAATC-3, NPTR:
5-TACCGTAAAGCACGAGGAA-3, 预期扩增片段
大小为733 bp。PCR扩增程序为: 94°C预变性5分钟;
94°C变性30秒, 52°C退火40秒, 72°C延伸1分钟, 35
个循环; 72°C延伸10分钟。扩增产物经1%琼脂糖凝
胶电泳鉴定。

1.4.2 转基因植株的半定量RT-PCR分析
使用RNAiso试剂提取黄瓜植株叶片的总RNA。提取
的总RNA样品用不含RNA酶的DNA酶70°C处理10分
钟, 以去除DNA污染。利用TaKaRa公司的反转录试
剂盒将各植株的总RNA反转录 , 合成第1链cDNA,
并以此为模板, 首先以18S rRNA基因序列为特异引
物 (18SF: 5-TGTCTCAAAGACTAAGCCATGCAT-
G-3; 18SR: 5-ACCATTCAATCGGTAGGAGCG-3)
对各样本进行扩增, 使模板cDNA均一化。然后用特
异引物(GkF: 5-GCCAATACAGCCTTCG-3; GkR:
5-TTAGAAGCTCCTCTGCTCG-3) 进 行 半 定 量
RT-PCR表达分析。预期扩增片段大小为327 bp。扩
增程序为: 94°C预变性5分钟; 94°C30秒, 52°C退火
40秒, 72°C30秒, 35个循环; 72°C延伸10分钟。以未
转化植株的cDNA为阴性对照, 重组质粒pARSGK2-1
为阳性对照进行检测。每次设3个重复。扩增产物经
414 植物学报 45(4) 2010
1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.4.3 转基因植株的Western blot杂交分析
取0.2 g生长4–5周的转基因黄瓜植株叶片, 以磷酸缓
冲液抽提叶片中的蛋白质 , 使用北京天根公司的
Bradford Protein Assay Kit测定总蛋白质浓度。吸取
150 μg总蛋白与等体积的上样缓冲液混合, 沸水变
性5分钟, 进行12.5%的SDS-PAGE电泳分离, 然后
用电转仪转印至硝酸纤维素膜上。以兔抗GNK2-1的
抗血清为一抗, 稀释浓度为1﹕1 000; 辣根过氧化物
酶标记羊抗兔IgG为二抗, 稀释浓度为1﹕2 000, 反
应底物为3,3二氨基联苯胺(3,3-diaminobenzidine,
DAB)。同时以未转化黄瓜总蛋白为阴性对照, 以纯化
的银杏抗菌蛋白为阳性对照。
1.5 转基因植株的抗病性鉴定
对分子检测表明GNK2-1成功表达的黄瓜T0代植株
TGK-3、TGK-4、TGK-6和TGK-7分别进行抗病性测
定。挑取尖孢镰刀菌菌丝在马铃薯葡萄糖琼脂培养基
(potato dextrose agar medium, PDA)中振荡培养,
孢子浓度调至1×106个·mL–1。分别从非转基因和转基
因株系上摘取9–10(天)叶龄的同一部位带柄叶片, 叶
背向下置于含有MS培养基的培养皿中, 用注射器在
叶片中央靠近基部的叶脉处注射接种孢子悬浮液, 接
种叶片在26°C下暗培养36小时后, 转移至光照条件
下继续培养。3天后观察发病情况。每株重复3次, 共
检测6枚叶片。使用SAS软件统计分析转基因黄瓜及
空载体转基因和未转基因(对照)植株的病情指数。病
情指数(DI)=∑[各级病叶数×相对级数值]/(调查总叶数
×发病最高级数值) ×100。免疫(I), DI=0; 高抗(HR),
0.01＜DI≤10; 抗病(R), 10＜DI≤30; 中抗(MR), 30
＜DI≤50; 感病(S), 50＜DI≤75; 高感(HS), DI＞
75。
2 结果与讨论
2.1 GNK2-1基因的合成与表达载体的构建
从银杏种仁的cDNA中克隆GNK2-1基因的全长ORF
序列(GenBank登录号: FJ865399)。GNK2-1基因推
导产物由 108个氨基酸残基组成 , 与Sawano等
(2007)分离纯化的GNK2相比只有2个氨基酸发生突
变, 相似性达99%。NCBI保守结构域分析表明, 该蛋
白含有典型的C-X8-C-X2-C(DUF26)结构域。因此推
测该基因编码蛋白与GNK2具有相似的结构功能和理
化性质。而且CRKs类受体蛋白激酶胞外结构域(图
1A)可能与该蛋白的抗菌活性有关。高效组成型植物
表达载体的构建如图1B所示: 载体和目的基因上共
含有3个Sal I酶切位点, 使用Sal I酶切重组质粒时,
应有3条带, 可以鉴定目的片段是否连接以及连接方
向的正确性。图1C所示的酶切条带大小与图1B所示
的预期大小一致 , 将连接正确的重组质粒命名为
pARSGK2-1。
2.2 转基因植株的获得与定植
将携带pARSGK2-1质粒的农杆菌浸染180枚农城3号
的子叶节外植体后, 在分化培养基上形成丛生芽, 转
入生根培养基上诱导生根。经过Kan抗性筛选, 共获
得24株T0代再生抗性植株。经农杆菌浸染的外植体能
够生成正常的愈伤组织(图2A), 形成丛生芽(图2B),
并能诱导生根(图2C); 最后得到的黄瓜植株不仅健壮
而且颜色鲜绿(图2D)。
2.3 转基因植株的分子生物学鉴定
以转基因黄瓜植株的基因组DNA为模板, 分别使用
NPTII基因序列和35S启动子序列引物进行PCR检测,
两次PCR检测结果均为阳性(图3A, B)的转基因植株
共7株, 转化率为3.89%。以转基因黄瓜植株叶片的
cDNA为模板, 以GNK2-1的特异引物GkF/GkR进行
RT-PCR检测。在7株DNA检测为阳性的转基因黄瓜
中, 有4株可扩增出327 bp的基因特异性片段(图3D),
其余则无扩增产物。3次重复的检测结果一致, 表明
GNK2-1基因片段已整合到4株转基因黄瓜的基因组
中, 未检测到扩增产物的转基因黄瓜基因组中则没有
GNK2-1基因或其同源基因。RT-PCR检测结果表明,
外源GNK2-1基因在4株转基因黄瓜中能够进行表达。
Western blot杂交检测发现, 抗体与纯化的GNK2-1
蛋白在12 kDa的位置具有特异的杂交带, 而且在4株
转基因黄瓜株系中能够检测到相同的杂交信号(图
3E), 表明GNK2-1基因在转基因黄瓜中能够转录并
正确翻译。另外, 对转基因T1代7个株系的83个单株
也进行了NPTII基因的PCR分析, 检测到阳性植株62
株(图3C), 证明GNK2-1基因已经从T0代传递到T1代,
刘缙等: 黄瓜转新型抗菌蛋白基因 GNK2-1 及其抗枯萎病的研究 415


图2 转基因黄瓜叶片再生及抗性植株筛选
(A) 抗性愈伤; (B) 抗性芽; (C) 抗性苗; (D) 抗性苗定植; (E) 转基因黄瓜(左), 未转基因黄瓜(右); (F) 开花结实的转基因黄瓜

Figure 2 Regeneration of transgenic cucumber leaves and resistant plantlet selection
(A) Resistant callus; (B) Resistant shoots; (C) The rooting of resistant seedling; (D) The transplantation of the resistant seedling;
(E) Transgenic cucumber(left), untransformed cucumber(right); (F) Efflorescence of transgenic cucumber


并且在T1代中转基因植株的分离比例与孟德尔单基
因独立遗传规律3:1(x C2=0.004 0果表明, 外源基因已整合到转基因黄瓜株系的基因组
内, 并主要以单拷贝的形式存在, 这种方式有利于基
因稳定遗传, 也有利于外源基因的功能分析。
2.4 转基因植株离体叶片的抗病性鉴定
离体叶片的抗病性鉴定结果(表1)表明: 未转化植株
的平均病情指数为100%; 而转基因植株的病情指数
则介于16.67%–54.17%之间 , 平均病情指数为
32.29%。离体叶片发病情况如图4所示: 接种病原菌
的非转化植株叶片(图4A)呈现出水浸状且大部分已
经变黄枯萎, 靠近接种位置的叶柄和叶脉变为褐色。
未接种病原菌的非转化植株叶片(图4B)生长正常; 转
基因植株叶片(图4C–E)则表现出不同程度的发病延
迟, 病情指数降低。上述结果表明, 转基因植株对黄
瓜枯萎病菌抗性显著。RT-PCR和Western blot杂交
分析结果表明, 转基因植株中转录表达量高的植株
TGK-3表现出较强的枯萎病抗性, 而转录表达较弱的
植株TGK-4与TGK-7也能不同程度地表现出对枯萎
病的抗性。说明转GNK2-1基因的黄瓜植株抗枯萎病
表1 转基因黄瓜T0代对枯萎病的抗性分析
Table 1 The resistance analysis to Fusarium oxysporum for
T0 transgenic plants
Type of plants Number
of leaves
inoculated
Disease
index (%)
Classification
TGK-3 6 16.67** R
TGK-4 6 25.00** R
TGK-7 6 33.33** MR
TGK-6 6 54.17* S
Empty plasmid
control
7 88.57 HS
Wild-type plant 8 100.00 HS
* P<0.05; **P<0.01(与野生型相比). R: 抗病; MR: 中抗; S: 感病;
HS: 高感
* P<0.05; **P<0.01 (compared with the wild type). R: Resistance;
MR: Moderate resistance; S: Susceptible; HS: Highly susceptible

的能力增强。
2.5 讨论
Ginkbilobin是从裸子植物银杏种仁中分离得到的一
类新型抗真菌蛋白, 具有性质稳定和广谱抗菌的特点
(Wang and Ng, 2000; Sawano et al., 2007)。相对于
目前研究较多的微生物来源的抗菌肽和葡萄糖氧化
416 植物学报 45(4) 2010


图3 转化黄瓜植株的分子生物学鉴定
(A)–(C) 转化植株的PCR检测 M: DNA分子量标准(DL2000); CK: 未转基因植株(阴性对照); P: 重组质粒pARSGK2-1 (A), (B)
1–7: T0代转基因植株; (C) 1–14: T1代转基因植株; (D) 转化植株的RT-PCR鉴定 对照(Control): 未转基因植株; P: 重组质粒
pARSGK2-1(阳性对照); TGK-3、TGK-4、TGK-6和TGK-7: 转基因植株; (E) 转基因植株的Western blot杂交分析 对照(Control):
未转基因植株(阴性对照); TGK-7、TGK-6、TGK-4和TGK-3: 不同转基因植株; GNK2-1: 银杏种仁中纯化的GNK2-1蛋白(阳性对照)
Figure 3 Molecular biological analysis of transgenic cucumber
(A)–(C) PCR analysis of transgenic cucumber M: DL2000 DNA marker; CK: Non-transformed control plant (negative control);
P: Plasmid pARSGK2-1 (A), (B) 1–7: T0 transgenic cucumber; (C) 1–14: T1 individuals of transgenic plant; (D) RT-PCR analy-
sis of transgenic cucumber Control: Untransformed cucumber; P: Plasmid pARSGK2-1(positive control); TGK-3, TGK-4, TGK-6
and TGK-7: Transgenic plantlets; (E) Western blot analysis of transgenic cucumber plants Control: Untransformed cucumber
(negative control); TGK-7, TGK-6, TGK-4 and TGK-3: Different transgenic cucumber lines; GNK2-1: Purified GNK2-1 protein
from Ginkgo biloba (positive control)




图4 转基因黄瓜植株T0代叶片离体接种枯萎病菌
(A) 未转基因植株(对照); (B) 非转化未接种病原菌植株; (C)–(E) 接种病原菌的转基因黄瓜植株TGK-3、TGK-4和TGK-7

Figure 4 The resistance of T0 transgenic cucumber plants to Fusarium oxysporum
(A) Untransformed cucumber (control); (B) Untransformed cucumber without inoculating pathogenic fungi; (C)–(E) Transformed
cucumber lines TGK-3, TGK-4 and TGK-7 inoculated by F. oxysporum


酶等, 其具有转基因遗传稳定和生物环境安全的优
点。本实验室克隆的该蛋白基因序列与Sawano等
(2007)纯化的GNK2蛋白基因序列的相似性达99%,
仅有个别碱基突变。此外, NCBI保守结构域搜索结果
表明, 该蛋白含有富含半胱氨酸的植物类受体激酶的
胞外受体结构域C-X8-C-X2-C (DUF26); 此结构域可
能与该蛋白的抗菌活性有关。
为研究GNK2-1基因是否可以提高植物的抗病能
刘缙等: 黄瓜转新型抗菌蛋白基因 GNK2-1 及其抗枯萎病的研究 417
力, 本实验室构建了高效表达载体并用以转化黄瓜栽
培品种农城3号。PCR和RT-PCR检测结果表明, 目的
基因已经整合到黄瓜基因组中, 并且能够正常转录;
同时也表明不同转基因植株具有不同的转录表达水
平。Western blot杂交分析结果进一步证明, 目的基
因可以正常转录表达并能够正确翻译。由于缺少针对
GNK2-1的单抗, 对转基因黄瓜中目的蛋白的表达没
能准确定量; 但以银杏种仁中纯化的GNK2-1蛋白为
参照, 粗略评估转基因黄瓜粗提液中蛋白的表达水平
与抗性呈正相关。PCR检测T1代植株中目的基因的分
离比例证明, 该基因主要以单拷贝形式整合在黄瓜基
因组中, 并且能够稳定遗传。以上实验结果表明, 本
研究成功获得了携带抗菌蛋白基因的转化黄瓜; 离体
叶片抗性分析也表明, 所有转基因植株对黄瓜枯萎病
均表现出不同程度的抗性, 并且抗性与该基因在不同
转基因株系中的转录和翻译水平具有相关性。说明该
基因的编码蛋白对土传病害————枯萎病具有一定的
抗性。已经发现有些植物种子能够产生多种富含半胱
氨酸的抗菌蛋白, 保护萌发的种子免受病原微生物的
侵袭(Ye et al., 1999; Ye and Ng, 2000; Shen et al.,
2005; Tsukuda et al., 2006)。因此, 推测银杏种子萌
发过程不易感病可能与种仁抗菌蛋白的保护作用有
关。之前 , 我们分析该基因启动子表达时也发现 ,
GNK2-1启动子序列中含有多个逆境(高/低温)诱导、
伤诱导和真菌侵染诱导以及脱落酸反应元件 , 如
W-BOX、ABRE、SA和JA等, 提示该蛋白可能在种
子成熟或者萌发过程中受到WRKY、SA或JA防卫反
应的信号调控, 其作用机制有待进一步研究。对转基
因黄瓜T0代和T1代植株生长的观察表明 , 表达
GNK2-1的转基因黄瓜植株相对野生型生长稍有滞
后 , 但并不影响正常开花结实 (图2E, F)。因此 ,
GNK2-1基因既能够有效提高植物对真菌病害的抗
性, 又基本不影响植株的正常生长和发育, 说明来自
银杏种子的抗菌蛋白基因GNK2-1可以作为植物抗病
基因工程的候选基因。但该基因应用于作物抗病育种
实践还需要利用诱导型启动子及结合多价抗病基因
共转化。而且Osusky等(2000)的研究表明, 植物中表
达抗菌肽能够增强植物的广谱抗性, 因此期望通过此
方法进一步揭示GNK2-1基因对于其它瓜类重要疾病
的抗性。本研究为培育和开发新型抗真菌蛋白转基因
黄瓜种质探索了一条新的途径, 为揭示新型抗菌蛋白
基因的作用机制提供了研究材料, 且为该类抗菌蛋
白基因在其它作物抗性基因工程上的应用奠定了
基础。
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Overexpression of a Novel Antifungal Protein Gene GNK2-1 Re-
sults in Elevated Resistance of Transgenic Cucumber to
Fusarium oxysporum
Jin Liu, Huali Tian, Yahong Wang, Aiguang Guo*
Shaanxi Key Laboratory of Molecular Biology for Agriculture, College of Life Science, Northwest Agriculture and Forestry
University, Yangling 712100, China
Abstract A novel antifungal protein, ginkbilobin2-1 (GNK2-1), from Ginkgo biloba seed kernels, was proved to have a
stable and significant inhibition effect on fungus growth. The protein showed no similarity to other pathogenesis-related
proteins but did show homology to the extracellular domain of plant cysteine-rich receptor-like kinases. In order to improve
resistance of transgenic plants to fungal infection, we used RT-PCR to amplify GNK2-1 from G. biloba seeds and trans-
formed the gene into cucumber (Cucumis sativus) cultivar Nongcheng 3 via Agrobacterium-mediated method. Transgenic
plants were obtained and the expression of the transgene was confirmed by PCR, RT-PCR and western blot analysis.
Resistance tests against Fusarium oxysporum showed that expression of the GNK2-1 in transgenic cucumber plants
conferred antifungal activity against this disease. The GNK2-1 gene may be a good candidate for breeding new cucumber
varieties with resistance to fungal blight disease.
Key words antifungal protein, cucumber, blight, transgene
Liu J, Tian HL, Wang YH, Guo AG (2010). Overexpression of a novel antifungal protein gene GNK2-1 results in elevated
resistance of transgenic cucumber to Fusarium oxysporum. Chin Bull Bot 45, 411–418.
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* Author for correspondence. E-mail: guoaiguang@yahoo.com.cn
(责任编辑: 孙冬花)