全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2015, 50 (6): 739–745, www.chinbullbotany.com
doi: 10.11983/CBB14186
——————————————————
收稿日期: 2014-10-27; 接受日期: 2015-01-27
基金项目: 农业部现代农业产业技术体系建设专项(No.CARS-28)、国家科技支撑计划(No.2013BAD02B01)和国家自然科学基金(No.
30900968, No.31201602)
* 通讯作者。E-mail: congph@163.com
苹果属植物树皮组织总蛋白提取及分离方法的建立
张彩霞1, 2, 田义1, 2, 张利义1, 2, 肖龙1, 2, 丛佩华1, 2*
1中国农业科学院果树研究所, 农业部园艺作物种质资源利用重点实验室, 兴城 125100
2中国农业科学院果树研究所, 兴城 125100
摘要 为了建立适于苹果属植物树皮组织总蛋白提取的技术方法, 以8年生华月苹果(Malus domestica)树枝条为试材, 通
过比较不同提取方法(TCA-丙酮沉淀法(A)、甲醇/醋酸铵沉淀法(B)和改良的Tris-酚抽提方法(C))并优化提取条件, 确立了最
适提取及分离方法为改良的Tris-酚抽提方法。在2-DE分离时, 该方法所获得的样品图谱中蛋白点总数为993个, 明显多于
TCA-丙酮沉淀(418个)和甲醇醋酸铵沉淀(674个)方法, 并且与其它两种方法相比, 该方法获得的图谱背景更清晰, 蛋白点
聚焦效果更好。此外, 经过3个梯度上样量的图谱分离效果比较, 确定了800 μg为本研究中2-DE分析的理想上样量。另外,
为了验证该提取及分离方法的可行性, 进一步对蛋白质表达谱中的部分蛋白点进行了质谱分析, 且这些蛋白点均得到了成
功鉴定。该研究通过优化总蛋白提取方法及样品上样量等条件, 获得了理想的双向电泳分离图谱, 为苹果属植物树皮组织
材料的蛋白质组学研究奠定了基础。
关键词 苹果, 树皮, 总蛋白, 提取, 双向电泳
张彩霞, 田义, 张利义, 肖龙, 丛佩华 (2015). 苹果属植物树皮组织总蛋白提取及分离方法的建立. 植物学报 50, 739–
745.
蛋白质组学研究已成为后基因组时代的又一前
沿领域(Rampitsch and Bykova, 2012)。2010年, 金
冠苹果全基因组草图(Velasco et al., 2010)的公布,
为苹果属植物蛋白质组学研究的迅速发展奠定了重
要基础。随着苹果全基因组研究的不断完善, 苹果属
植物材料相关的蛋白质组学研究陆续开展(Carpen-
tier et al., 2005; 曹尚银等, 2007; 朱志勇等, 2007;
曾广娟等, 2008; 张彩霞等, 2012)。
双向凝胶电泳技术作为蛋白质组学研究的主要
技术之一, 其蛋白质提取方法的建立是双向电泳分析
的前提(Carpentier et al., 2005)。目前, 国内外关于
苹果属植物材料的蛋白质组学研究, 仅涉及叶片、果
实、根部及果实亚细胞结构等材料的蛋白质提取(Gu-
arino et al., 2007; 王清等, 2009; Qin et al., 2009;
Wang et al., 2010; Cao et al., 2011; Buron-Moles et
al., 2014), 尚缺少关于树皮组织材料的蛋白质提取
的报道。苹果轮纹病和腐烂病等重要病害的致病菌,
多以树皮组织为寄主(Gao et al., 2002; 张玉经等,
2010; 刘欣颖等, 2011), 建立苹果属植物树皮组织
的蛋白质提取方法, 对于开展苹果抗病蛋白质组学研
究具有重要意义。
由于苹果树皮组织中含有丰富的色素、多糖和纤
维素等干扰物质, 使其总蛋白样品的制备比较困难。
本研究在借鉴已有关于木本植物(Carpentier et al.,
2005)总蛋白提取方法的基础上 , 利用 IPG-IEF与
SDS-PAGE双向电泳研究平台, 以一年生苹果枝条
为研究试材, 建立了一套适于苹果属植物树皮组织总
蛋白提取及分离的技术系统, 为苹果属植物与病原菌
互作相关的蛋白质组学研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 供试材料
研究试材取自国家苹果育种中心杂种圃内, 以8年生
华月苹果(Malus domestica L.)实生树为研究对象, 随
机选取1年生无病枝条若干, 快速取下树皮组织, 除杂
·技术方法·
740 植物学报 50(6) 2015

并清洗, 经液氮速冻后, 迅速置于–80℃冰箱备用。
1.2 树皮组织总蛋白提取
以下步骤均于4℃条件下进行。
TCA-丙酮沉淀法参照Song等(2006)方法稍加改
进。迅速称取–80℃冰箱中保存的树皮组织3.0 g, 于
液氮中研磨成精细粉末, 将研磨好的粉末样品转入
50 mL的离心管中, 加入20 mL提取液, 即10% (W/V)
TCA/丙酮(含0.7% β-巯基乙醇)。振荡混匀5分钟, 于
–20°C沉淀过夜; 4°C, 15 000 ×g离心20分钟, 收集
沉淀。沉淀物用冷丙酮(含DTT)漂洗(4°C, 15 000 ×g
离心10分钟) 3–5次至丙酮无色为止, 沉淀经室温下
风干, 于–80°C条件下保存备用。
甲醇/醋酸铵沉淀法参照Guarino等(2007)进行。
改良的Tris-酚抽提方法参照Carpentier等(2005)
以及Wang等(2007)并有所调整。迅速称取–80°C冰箱
中保存的树皮组织3.0 g, 于液氮中研磨, 并加入石英
砂以助研至精细粉末状。将研磨好的粉末样品转入50
mL的离心管中, 先悬浮于10 mL的匀浆缓冲液(50
mmol·L–1 Tris-HCl (pH7.5); 30%蔗糖; 100 mmol·L–1
EDTA; 2% β-巯基乙醇1 mmol·L–1 (PMSF); 50
mmol·L–1 硼砂; 1 mmol·L–1 DTT; 1% Triton X-100;
5% PVPP (聚乙烯聚吡咯烷酮))中, 4°C涡旋振荡10
分钟; 之后悬浮于10 mL酚(Tris-buffered, pH=8.0,
Sigma)中, 4°C涡旋振荡20分钟; 4°C, 15 000 ×g离心
15分钟; 收集上层酚相, 加入3倍体积0.1 mol·L–1甲
醇醋酸铵溶液, –20°C, 沉淀4小时。4°C, 15 000 ×g
离心10分钟, 沉淀物经冷丙酮(含20 mmol·L–1 DTT)漂
洗3次, 室温风干, –80°C条件下保存备用。
1.3 蛋白质样品溶解与定量
制备好的蛋白干粉溶于样品裂解液(7 mol·L–1 尿素;
2 mol·L–1 硫脲; 4% (w/v) CHAPS; 2% IPG buffer;
1% (w/v) DTT)。充分溶解4–6小时, 4°C, 15 000 ×g
离心30分钟, 取上清重复离心2次。上清液即为蛋白
质溶液样品。采用双向电泳蛋白定量试剂盒 (2-D
QUANT KIT, GE Healthcare, Cat No.80-6483-56)对
蛋白溶液样品进行定量。
1.4 双向凝胶电泳
等电聚焦过程采用预制IPG胶条(18 cm, pH4–7, 线
性, GE Healthcare, Cat No.17-1233-01)。取定量后
的蛋白质溶液样品, 胶条上样量设3个梯度, 分别为
600、800和1 000 μg, 上样体积350 μL, 室温下水化
10–12小时。水化结束后即进行等电聚焦电泳(IPG-
IEF), 升压程序参照张彩霞等(2012)方法。等电聚焦
过程结束后, 将胶条分别置于含1% DTT和2.5%碘乙
酰胺的平衡液(张彩霞等, 2012)中分别平衡15分钟,
然后再转移至分离胶浓度为12.5%、厚度为1 mm的
SDS-PAGE胶上端 , 进行垂直板电泳 (张彩霞等 ,
2012)。电泳完成后, 取下凝胶, 采用考马斯亮蓝R-350
(CBB R-350)染色。
1.5 图像扫描及分析
凝胶脱色后立即用Image Scanner扫描仪(GE Heal-
thcare)进行扫描, 分辨率300 dpi。图像采用Image
Master 2D Platinum 7.0分析软件进行分析, 检测
参数设置为: Smooth, 5; Min Area, 25; Saliency,
5.0。
1.6 蛋白点质谱分析
将选定的蛋白点切下来, 通过胶内原位酶解方法进行
酶解和浓缩, 再通过串联飞行时间质谱仪(4800 Plus
MALDI TOF/TOFTM Analyzer) (Applied Biosyste-
ms, USA)进行质谱分析。蛋白点质谱分析(MALDI-
TOF-TOF/MS)工作委托中国科学院(上海)蛋白质组
研究分析中心完成。
1.7 数据库检索
酶解样品经过质谱检测后获得PMF数据, 利用Mas-
cot 2.2软件在NCBI数据库中进行检索鉴定目标蛋
白。
2 结果与讨论
2.1 3种方法提取蛋白质样品的比较
本研究参考已报道的植物材料蛋白质样品提取方法,
利用TCA-丙酮沉淀(A)、甲醇醋酸铵沉淀(B)以及改良
的Tris-酚抽提(C)等3种方法, 开展苹果树皮总蛋白提
取及2-DE分析。电泳结果显示, 利用改良的Tris-酚抽
提方法(C)获得凝胶图谱中蛋白点总数为993个, 明
张彩霞等: 苹果属植物树皮组织总蛋白提取及分离方法的建立 741

显多于TCA-丙酮沉淀(A)及甲醇醋酸铵沉淀(B)获得
的418个及674个(图1)。


图1 苹果树皮组织分别采用3种方法提取总蛋白后获得的电泳
图谱
(A) TCA-丙酮沉淀方法; (B) 甲醇醋酸铵沉淀方法; (C) 改良的
Tris-酚抽提方法

Figure 1 Representative 2-DE maps of the total protein
extracts from the bark of apple branches following 3 proto-
cols
(A) TCA-acetone precipitation; (B) Methanol/ammonium ace-
tate precipitation; (C) Improved Tris-phenol extraction

从图谱分离效果看, 改良Tris-酚抽提方法(C)所
获得样品2-DE背景更干净且清晰, 除碱性端外, 无
明显纵横拖尾。而通过TCA-丙酮沉淀(A)和甲醇醋酸
铵沉淀(B)方法获得的凝胶图谱背景杂质较多且不清
晰, 可能因提取获得的总蛋白样品纯度不高、核酸污
染和溶解度低等因素的影响, 使得分离的图谱横纵纹
较多。此外, 方法(C)获得图谱蛋白点聚焦效果普遍优
于方法(A)和方法(B), 除少量低丰度蛋白点, 多数蛋
白点无明显弥散现象(图1)。
综合以上分析, 本研究结果表明, 改良的Tris-酚
抽提方法(C)提取步骤较为简单, 获得样品杂质少、纯
度高, 蛋白降解和丢失较少, 且蛋白点聚焦效果好,
是适于苹果属植物树皮组织总蛋白提取及分离的理
想方法。
2.2 蛋白质样品上样量优化
综合考虑木本植物树皮组织蛋白的溶解性及分离效
果, 针对18 cm预制IPG胶条, 本研究将上样量设为
600、800及1 000 μg 3个梯度。实验结果表明, 上样
量每增加200 μg, 2-DE图谱分离效果差异较为显著
(图2)。上样量为600 μg, 凝胶图谱分离背景较清晰,
但所示区域内某些低丰度蛋白点有丢失(图2A); 上样
量为1 000 μg, 高丰度蛋白点同样也会影响其它蛋白
点的分离效果(图2C); 而图2B所示上样量为800 μg
时, 图谱中蛋白点分布均匀, 所示区域内低丰度蛋白
点分离效果较好, 且图谱背景清晰。综合比较3个梯
度上样量的分离效果, 认为800 μg上样量可作为苹
果树皮组织总蛋白2-DE分析的理想上样量。
2.3 蛋白质点质谱分析
为了检测Tris-酚抽提方法(C)的总蛋白分离质量, 选
择蛋白质表达谱中10个蛋白点进行质谱分析, 包括5
个高丰度蛋白点(volume ratio>0.5)及5个低丰度蛋白
点(volume ratio<0.5) (图3)。结果表明, 10个蛋白点均
得到成功鉴定(表1)。在已鉴定的10个蛋白点中, 除了
2个与苹果属植物同源的蛋白外, 其余蛋白均为与其
它植物高度同源的相关蛋白。此外, 从鉴定所得分值
(score)来看, 高丰度蛋白点(1–5)的鉴定分值普遍高
于低丰度蛋白点(6–10)。蛋白点6的丰度较低, 其鉴定
分值仍高于60分的可信度分值(MOWSE score), 说

742 植物学报 50(6) 2015



图2 采用不同上样量的双向电泳图谱比较
(A), (D) 600 μg; (B), (E) 800 μg; (C), (F) 1 000 μg

Figure 2 Comparison of 2-DE maps of different sample load
(A), (D) 600 μg; (B), (E) 800 μg; (C), (F) 1 000 μg




图3 苹果树皮组织总蛋白表达谱中筛选的蛋白点
1–5: 高丰度蛋白点; 6–10: 低丰度蛋白点

Figure 3 Representative protein spots of the total protein
extracts from the bark of apple branches
1–5: High-abundance proteins; 6–10: Low-abundance proteins
明通过改良Tris-酚抽提方法(C)及800 μg上样量进行
的双向电泳分析方法是可行的。
2.4 讨论
蛋白质样品提取是双向电泳分析的前提, 蛋白质提取
方法的建立对于后续蛋白质组学分析至关重要(Jiang
et al., 2004)。以往关于模式植物的蛋白质组学研究证
实, 不同植物材料或组织器官, 其总蛋白提取方法主
要以TCA-丙酮沉淀法及酚抽提法为主(谷瑞升等 ,
1999; Carpentier et al., 2005; Song et al., 2006;
Guarino et al., 2007)。本研究尝试应用TCA-丙酮沉
淀(Song et al., 2006)、甲醇醋酸铵沉淀(Guarino et
al., 2007)以及改良的Tris-酚抽提(Carpentier et al.,
2005; Wang et al., 2007) 3种方法, 开展苹果属植物
树皮组织总蛋白提取方法的筛选及优化工作。因苹果
树皮组织富含色素、多糖和纤维素等干扰物质, 致使
其总蛋白样品制备工作较为困难, 改良的Tris-酚抽提
方法(C), 基于已有文献的研究基础(Carpentier et al.,
2005; Wang et al., 2007), 在匀浆缓冲液中添加了硼
张彩霞等: 苹果属植物树皮组织总蛋白提取及分离方法的建立 743

表1 苹果树皮组织蛋白点质谱分析
Table 1 Identification of representative proteins in apple branches with MALDI-TOF/TOF and database searching
Spot Protein name Accession No. Theoretical MW Species Protein score
1 ATP synthase subunit beta gi|470126069 60.12/6.01 Fragaria vesca 431
2 Actin gi|355329944 40.37/5.67 Malus domestica 587
3 Oxygen-evolving enhancer protein gi|470129332 35.35/6.1 Fragaria vesca 265
4 Oxygen-evolving enhancer protein gi|470129332 35.35/6.1 Fragaria vesca 569
5 Uncharacterized protein At2g37660 gi|470133785 35.44/5.86 Fragaria vesca 91
6 PRUPE_ppa007855mg gi|462397824 37.65/8.09 Prunus persica 62
7 PRUPE_ppa006513mg gi|462411618 42.18/5.82 Prunus persica 289
8 Acetyl-CoA carboxylase 1 isoform 3 gi|508724180 24.65/6.17 Theobroma cacao 64
9 Cytosolic malate dehydrogenase gi|78216493 35.97/6.01 Malus domestica 334
10 PRUPE_ppa007772mg gi|462411755 39.12/5.88 Prunus persica 222

砂及聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)。PVPP分子是强的氢
离子受体, 能够有效吸附多酚类物质, 常用于各类植
物材料的总蛋白提取(Carpentier et al., 2005); 硼砂同
样具有吸附多糖和多酚等干扰物质的作用(Wang et
al., 2007; Wang et al., 2010)。方法(C)在匀浆缓冲液
中加入PVPP及硼砂, 使得提取后的总蛋白样品纯度
较高, 所得凝胶图谱背景清晰, 蛋白点聚焦效果好。
双向凝胶电泳分析过程涉及因素较多, 为建立适
于本研究的苹果属植物树皮组织总蛋白提取方案, 需
要对其它关键环节进行摸索。研究发现, 蛋白质上样
量多少也是影响电泳分离效果的重要因素(王一鸣等,
2007; 丁承强等, 2011)。上样量主要与染色方法及
IPG胶条长度和pH值范围等因素有关。理论上讲, 在
条件一致情况下, 上样量多少直接影响图谱分离质
量, 可通过比较各个上样量的分离效果来确定最适上
样量。本研究中, 我们选择兼容性较好的考马斯亮蓝
染色方法, 通过比较3个梯度上样量的图谱分离效果,
最终选择800 μg作为本研究的理想上样量。蛋白质提
取方法及上样量的选择直接决定后续质谱分析的成
功率(Song et al., 2006)。本研究通过对已筛选高、低
丰度蛋白点进行MALDI-TOF-TOF质谱检测, 验证了
已建立的苹果属植物树皮组织总蛋白提取及分离方
法的可行性。
3 结论
针对苹果树皮组织材料, 本研究通过比较3种不同提
取方法以及上样量梯度筛选, 确定改良的Tris-酚抽提
方法为苹果树皮组织总蛋白提取的最适方法, IPG-
IEF过程采用18 cm (pH4–7)预制IPG胶条, 上样量为
800 μg, 最终得到蛋白点分布均匀且分离效果较好
的2-DE图谱, 进而通过MALDI-TOF-TOF质谱分析验
证不同丰度蛋白点的鉴定结果, 证实提取及分离方法
的可行性。本研究建立了适用于苹果树皮组织材料的
总蛋白提取及分离技术体系, 为以苹果属植物树皮组
织为材料的蛋白质组学研究奠定了基础。
参考文献
曹尚银, 张秋明, 朱志勇, 郭俊英, 陈玉玲, 薛华柏 (2007).
苹果花芽孕育蛋白质组学初步分析 . 中国农业科学 40,
2281–2288.
丁承强, 马丹, 王绍华, 丁艳锋 (2011). 水稻蛋白质组双向电
泳优化流程及方法. 植物学报 46, 67–73.
谷瑞升, 刘群录, 陈雪梅, 蒋湘宁 (1999). 木本植物蛋白提取
和SDS-PAGE分析方法的比较和优化 . 植物学通报 16,
171–177.
刘欣颖, 吕松, 王忆, 王昆, 李天红, 韩振海, 张新忠 (2011).
苹果种质资源对苹果树腐烂病抗性评价 . 果树学报 28,
843–848.
王清, 产祝龙, 秦国政, 田世平 (2009). 果实蛋白质组学研究
的实验方法. 植物学报 44, 107–116.
王一鸣, 花宝光, 王有年, 孟海玲 (2007). 桃果实蛋白质双向
电泳影响因素的研究. 园艺学报 34, 1579–1584.
曾广娟 , 李春敏 , 张新忠 , 田义 , 陈东玫 , 赵永波 , 董文轩
(2008). 苹果实生树阶段转变特异蛋白质的SDS-PAGE分
析. 园艺学报 35, 1059–1064.
张彩霞, 李壮, 张利义, 田义, 康国栋, 陈莹, 丛佩华 (2012).
苹果叶片总蛋白提取及其双向电泳分析 . 果树学报 29,
744 植物学报 50(6) 2015

488–492.
张玉经, 王昆, 王忆, 韩振海, 高源, 许雪峰, 张新忠 (2010).
苹果种质资源果实轮纹病抗性的评价. 园艺学报 37, 539–
546.
朱志勇, 曹尚银, 徐小彪, 郭俊英, 陈玉玲, 薛华柏 (2007).
新红星苹果花芽蛋白质提取及双向电泳的改良方法. 果树
学报 24, 549–552.
Buron-Moles G, Torrres R, Amoako-Andoh F, Viñas I,
Teixidó N, Usall J, Keulemans W, Davey MW (2014).
Analysis of changes in protein abundance after wounding
in ‘Golden Delicious’ apples. Postharv Biol Technol 87,
51–60.
Cao X, Gao Y, Wang Y, Li CM, Zhao YB, Han ZH, Zhang
XZ (2011). Differential expression and modification of
proteins during ontogenesis in Malus domestica. Pro-
teomics 11, 4688–4701.
Carpentier SC, Witers E, Laukens K, Deckers P,
Swennen R, Panis B (2005). Preparation of protein
extracts from recalcitrant plant tissues: an evaluation of
different methods for two-dimensional gel electrophoresis
analysis. Proteomics 5, 2497–2507.
Gao KX, Liu XG, Liu YG, Zhang TB, Wang SL (2002).
Potential of Trichoderma harzianum and T. atroviride to
control Botryosphaeria berengeriana f. sp. piricola, the
cause of apple ring rot. J Phytopathol 150, 271–276.
Guarino C, Arena S, De Simona L, Dambrosio C,
Santoro S, Rocco M, Scaloni A, Marra M (2007). Pro-
teomic analysis of the major soluble components in An-
nurca apple flesh. Mol Nutr Food Res 51, 255–262.
Jiang L, He L, Fountoulakis M (2004). Comparison of pro-
tein precipitation methods for sample preparation prior to
proteomic analysis . J Chromatogr A 1023, 317–320.
Qin GZ, Wang Q, Liu J, Li BQ, Tian SP (2009). Proteomic
analysis of changes in mitochondrial protein expression
during fruit senescence. Proteomics 9, 4241–4253.
Rampitsch C, Bykova NV (2012). Proteomics and plant
disease: advances in combating a major threat to the
global food supply. Proteomics 12, 673–690.
Song J, Braun G, Bevis E, Doncaster K (2006). A simple
protocol for protein extraction of recalcitrant fruit tissues
suitable for 2-DE and MS analysis. Electrophoresis 27,
3144–3151.
Velasco R, Zharkikh A, Affourtit J, Dhingra A, Cestaro A,
Kalyanaraman A, Fontana P, Bhatnagar SK, Troggio
M, Pruss D, Salvi S, Pindo M, Baldi P, Castelletti S,
Cavaiuolo M, Coppola G, Costa F, Cova V, Dal Ri A,
Goremykin V, Komjanc M, Longhi S, Magnago P,
Malacarne G, Malnoy M, Micheletti D, Moretto M,
Perazzolli M, Si-ammour A, Vezzulli S, Zini E, Eldredge
G, Fitzgerald LM, Gutin N, Lanchbury J, Macalma T,
Mitchell JT, Reid J, Wardell B, Kodira C, Chen ZT,
Desany B, Niazi F, Palmer M, Koepke T, Jiwan D,
Schaeffer S, Krishnan V, Wu CJ, Chu VT, King ST,
Vick J, Tao QZ, Mraz A, Stormo A, Stormo K, Bogden
R, Ederled D, Stella A, Vecchidtti A, Kater MM,
Masiero S, Lasserre P, Lespinasse Y, Allan AC, Bus V,
Chagné D, Crowhurst RN, Gleave AP, Lavezzo E,
Fawcett JA, Proost S, Rouzé P, Sterck L, Toppo S,
Lzaazri B, Hellens RP, Durel CE, Gutin A, Bumgarner
RE, Gardiner SE, Skolnick M, Egholm M, Van de Peer
Y, Salamini F, Viola R (2010). The genome of the
domesticated apple (Malus × domestica Borkh.). Nature
Genet 42, 833–839.
Wang JY, Ruan SL, WU WH, Xu XF, Wang Y, Han ZH
(2010). Proteomics approach to identify differentially ex-
pressed proteins induced by iron deficiency in roots of
Malus. Pak J Bot 42, 3055–3064.
Wang XC, Li XF, Deng X, Han HP, Shi WL, Li YX (2007). A
protein extraction method compatible with proteomic
analysis for the euhalophyte Salicornia europaea. Elec-
trophoresis 28, 3976–3987.

张彩霞等: 苹果属植物树皮组织总蛋白提取及分离方法的建立 745

Extraction and Separation Analysis of Total Protein from
the Bark of Apple Branches
Caixia Zhang1, 2, Yi Tian1, 2, Liyi Zhang1, 2, Long Xiao1, 2, Peihua Cong1, 2*
1Key Laboratory of Horticulture Crops Germplasm Resources Utilization, Ministry of Agriculture, Research Institute of Po-
mology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Xingcheng 125100, China; 2Research Institute of Pomology, Chinese
Academy of Agricultural Sciences, Xingcheng 125100, China
Abstract We aimed to establish a suitable extraction method for analyzing total protein in the bark of apple branches.
The branches of an 8-year-old cultivar (Huayue) were used as material. We compared 3 different extraction methods,
including TCA-acetone precipitation (A), methanol/ammonium acetate precipitation (B), and improved Tris-phenol extrac-
tion (C). We optimized the extraction procedures and established an ideal method for analyzing the total protein in the
bark of apple branches. The improved Tris-phenol extraction method could reveal a good map of 993 protein spots, sig-
nificantly more than the other two methods: 418 and 674 protein spots were obtained with TCA-acetone precipitation and
methanol/ammonium acetate precipitation, respectively. Furthermore, the gel background was clear, and the protein
spots were better focused than with the two other methods. After comparing sample loading quantity, we selected 800 μg
as the ideal loading quantity for our study. Furthermore, we selected several proteins for MALDI-TOF-TOF/MS analysis
and database searching, and the protein spots were finally identified. In this study, we optimized the extraction procedures
and sample loading quantity for total protein and finally obtained an ideal 2-D electrophoresis map. Our study may provide
a good basis for further proteome analysis of apple branches.
Key words Apple, bark, total protein, extraction, 2-D electrophoresis
Zhang CX, Tian Y, Zhang LY, Xiao L, Cong PH (2015). Extraction and separation analysis of total protein from the bark
of apple branches. Chin Bull Bot 50, 739–745.
———————————————
* Author for correspondence. E-mail: congph@163.com
(责任编辑: 朱亚娜)