全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2012, 47 (1): 87–99, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2012.00087
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收稿日期: 2011-07-22; 接受日期: 2011-11-19
基金项目: 国家自然科学基金(No.30871821, No.31171989)、国家科技支撑计划(No.2011BAD17B01)和中央高校基本科研业务费专项
(No.2009-2-06)
* 通讯作者。E-mail: yaguo@cau.edu.cn
禾本科牧草和草坪草雄核发育与单倍体育种研究进展
赵永钦, 吴新新, 李蔚, 李仁, 史文君, 郭仰东*
中国农业大学农学与生物技术学院, 北京 100193
摘要 禾本科牧草与草坪草在农业可持续发展、城市绿化和生态环境保护方面起着至关重要的作用。近年来, 随着生物技
术的发展, 国内外在牧草及草坪草雄核发育与单倍体育种研究方面取得了较大进展。该文在归纳总结该领域研究成果的基
础上, 对影响禾本科牧草及草坪草雄核发育与单倍体育种的几个主要因素进行了探讨。大量研究结果表明, 供试材料的基
因型是影响培养效率的最主要因素。小孢子发育到单核中期至晚期时有利于提高培养效率。培养前花药经过低温和甘露醇
等预处理不但可以提高愈伤组织的诱导效率, 还可提高愈伤组织的质量。适宜的激素种类和配比也是影响培养成败的关键
因素。同时, 总结了雄核发育再生植株的倍性鉴定方法和加倍技术, 对单倍体育种技术在禾本科牧草及草坪草育种中的应
用前景进行了展望。
关键词 雄核发育, 花药培养, 牧草, 小孢子培养, 草坪草
赵永钦, 吴新新, 李蔚, 李仁, 史文君, 郭仰东 (2012). 禾本科牧草和草坪草雄核发育与单倍体育种研究进展. 植物学报
47, 87–99.
禾本科牧草和草坪草在农业可持续发展、生态环
境治理和城市绿化等方面起着不可或缺的作用。牧草
作为草食动物的主要饲料来源是发展畜牧业的前提。
我国畜牧业生产长期以来一直处于自然或半自然的
放牧状态, 牧区牧草退化严重, 极大地影响了畜牧业
的发展。作为优良绿化植物的草坪草, 在城市绿化和
运动场建设等方面发挥着越来越积极的作用。草坪业
在我国是一门新兴的行业, 随着人们生活和审美水平
的提高, 草坪应用范围不断扩大。目前, 基因工程、
细胞工程和酶工程等生物技术迅猛发展, 牧草和草坪
草生物技术研究范畴也在不断拓展, 生物技术正在改
变着传统的育种方式, 其中牧草单倍体育种备受关
注。利用细胞工程和基因工程技术改良禾本科牧草和
草坪草是一种便捷且有效的途径(Guo et al., 1999)。
单倍体育种是指用诱发单性生殖(如花药培养)的
方法, 使某些品种(或其杂交后代)的异质配子长成单
倍体植株, 经染色体加倍成为纯系, 之后进行品种选
育的一种育种方法。自1964年, Guha和Maheshwari
最先在被子植物毛叶曼陀罗(Datura innoxia)的花药
培养中获得胚状体, 并进一步证实这些胚状体是起源
于花粉细胞的单倍体以来, 花药离体培养研究发展十
分迅速。利用花药培养产生单倍体植株的技术已逐步
推广到多种植物的育种研究。获得大量的单倍体植株
对于育种实践以及遗传学、细胞学、细胞生物学及植
物生理学等方面的基础研究均具有重要意义。经过多
年的研究和发展, 单倍体育种已与常规杂交育种、远
缘杂交育种、诱变育种以及转基因技术相结合, 形成
了一套完整的育种技术体系。本文总结了近年来禾本
科牧草和草坪草单倍体育种的相关研究成果(表1),
同时结合多年科研实践, 提出并分析了禾本科牧草和
草坪草单倍体育种研究中存在的问题, 希望能够对从
事相关研究的科研工作者提供有益启示。
1 影响禾本科牧草和草坪草雄核发育的
因素
1.1 供试材料
1.1.1 材料的基因型
影响禾本科牧草和草坪草雄核发育的因素很多。大多
数研究者认为, 供体植株的基因型是影响雄核发育单
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表1 禾本科牧草和草坪草雄核发育与单倍体育种研究进展一览表
Table 1 Research progress in androgenesis and haploid breeding of gramineous forage and turfgrass
中文名 拉丁名 外植体 结果 参考文献
草地羊茅 Festuca pratensis 花药 再生植株 Rose et al., 1987
花药 白化苗 Rose et al., 1987 毒麦 Lolium temulentum
花药 白化苗 Wang et al., 2005
鸭茅 Dactylis glomerata 花药 再生植株白化苗 Christensen et al., 1997
多花黑麦草 Lolium multiflorum 花药 再生植株 Boppenmeier et al., 1989
花药 再生植株 Boppenmeier et al., 1989
花药 再生植株 Halberg et al., 1990
花药 再生植株 Opsahl-Ferstad et al., 1994
多年生黑麦草 L. perenne
花药 再生植株 Madsen et al., 1995
高羊茅 Festuca arundinacea 花药 再生植株白化芽 Kasperbauer and Eizenga, 1985
狼尾草 Pennisetum alopecuroides 花药 再生植株 Shigemune and Yoshida, 2000
花药 愈伤组织 Niizeki and Kati, 1973
花药 再生植株 Abdullah et al., 1994
花药 再生植株 Guo et al., 1999
猫尾草 Phleum pratense
花药 再生植株 Guo et al., 2000a
花药 再生植株 Wenzel and Thomas, 1974
花药 再生植株 Thomas and Wenzel, 1975
小孢子 胚状体 Wenzel et al., 1975
小孢子 再生植株白化苗 Wenzel et al., 1976
花药 再生植株白化苗 Wenzel et al., 1977
花药 再生植株 Flehinghaus et al., 1991
花药 再生植株 Dainel, 1993
花药 再生植株 Flehinghaus-Roux et al., 1995
花药 再生植株 Immonen and Anntila, 1996, 2000
花药 再生植株 Rakoczy-Trojanowska et al., 1997
花药 再生植株白化苗 Guo et al., 2000b
黑麦 Secale cereale
花药、小孢
子
再生植株白化苗 Ma et al., 2004
花药 再生植株 曹禹等, 2007
花药 愈伤组织 孙娜等, 2009
小黑麦 Triticale wittmack
花药 再生植株 Tuvesson et al., 2000
大赖草 Leymus racemosus 花药 再生植株 王子霞等, 2000
象草 Pennisetum purpureum 花药 再生植株 Haydu and Vasil, 1981
冰草 Agropyron cristatum 花药 再生植株 Chekurov and Razmakhnin, 1999
花药 白化苗 Marburger and Wang, 1988 高冰草 Thinopyrum ponticum
花药 再生植株 Wang et al., 1991
中间冰草 Agropyron intermedium 花药 白化芽 Yao et al., 1991
天蓝偃麦草 A. glaucum 花药 再生植株 Chekurov and Razmakhnin, 1999
花药 再生植株 Rines, 1983
花药 再生植株白化苗 Kiviharju and Tauriainen, 1999
燕麦 Avena sativa
小孢子 再生植株 Sidhu and Davies, 2009
不实野燕麦 A. sterilis 花药 白化苗
再生植株
Kiviharju et al., 1997; Kiviharju and
Pehu, 1998; Kiviharju and Tauriain-
en, 1999
燕麦杂交种 Avena sativa × Avena sativa 花药 再生植株 Kiviharju et al., 2005

赵永钦等: 禾本科牧草和草坪草雄核发育与单倍体育种研究进展 89
表1 (续) Table 1 (continued)
中文名 拉丁名 外植体 结果 参考文献
多花黑麦草×草
地羊茅
Lolium multiflorum ×
Festuca pratensis
花药 白化苗
再生植株
Rose et al., 1987
多年生黑麦草 ×
草地羊茅
Lolium perenne ×
Festuca pratensis
花药 白化苗, 再生植株 Rose et al., 1987; Guo et al., 2005
高羊茅 ×
多花黑麦草
Festuca arundinacea ×
Lolium multiflorum
花药 再生植株 Zwierzykowski et al., 1999
多年生黑麦草 ×
高羊茅
Lolium perenne ×
Festuca arundinacea
花药 再生植株 Guo et al., 2009
多花黑麦草 ×
高羊茅
Lolium multiflorum ×
Festuca arundinacea
花药 再生植株 Zare et al., 2002
花药 白化苗 Rose et al., 1986
花药 再生植株 Wen et al., 1991
花药 再生植株 韩福光和张颖, 1993
高粱 Sorghum bicolor
花药 白化苗 Kumaravadivel and Rangsamy, 1994


倍体诱导效率的关键因素。在相同的实验条件下, 同
一作物不同基因型的花药(或小孢子)对培养基的反应
不同(甚至有些材料对某些培养基根本没有反应), 主
要表现在愈伤组织诱导率、分化率、胚胎诱导率和植
株诱导率等方面。Olesen等(1988)对二倍体多年生黑
麦草(Lolium perenne)花药培养时发现, 供试的7个
品种其绿苗的分化率存在明显差异, 其中2个品种的
分化率始终很低, 仅为2.3%–3.8%。Boppenmeier等
(1989)对多花黑麦草(Lolium multiflorum)和多年生黑
麦草的花药培养研究证实, 不同基因型多年生黑麦草
对培养条件的反应存在很大差异, 多花黑麦草则表现
不明显。另外, Madsen等(1995)对多年生黑麦草的花
药培养研究还证实, 多年生黑麦草花药培养中白化苗
的形成与特定的基因型有关, 其再生植株的能力取决
于基因型对雄核发育诱导的不同反应。Ślusarkie-
wicz-Jarzina和Ponitka(1997)研究了小黑麦(Triticale
wittmack)20种不同基因型的花药在3种不同培养基
上的诱导效果, 结果表明, 胚状体的诱导和植株再生
受供体植株的基因型影响很大。在猫尾草(Phleum
pratense)的花药培养中, 发现雄性胚胎发生同样依
赖于基因型(Niizeki and Kati, 1973; Abdullah et al.,
1994)。Guo和Pulli(2000a)首次通过游离小孢子培养,
证明了猫尾草小孢子培养的成功受基因型的影响很
大。目前, 有关控制花药培养胚发生及其遗传规律的
基因已在小麦(Triticum aestivum)等作物上陆续得到
克隆。Reynolds和Crawford(1996)在小麦中分离并鉴
定了一种早期半胱氨酸标记金属硫蛋白的转录物
(EcMt)。该基因的转录物仅在胚胎发生的小孢子、胚
状体和发育中的合子胚中形成, 因此可以将EcMt基
因作为小麦小孢子胚胎形成的一种分子标记。Vrinten
等(1999)通过对大麦(Hordeum vulgare)小孢子培养
及早期阶段有差异表达基因的cDNA克隆, 对胚胎发
生早期阶段的分子机理有了更深入的理解。他们利用
培养3天的大麦小孢子建立了一个cDNA文库, 通过
新鲜离体小孢子阶段的cDNA探针筛选, 分离出3种
未鉴定过的cDNA, 且这3种cDNA仅在大麦小孢子培
养的早期阶段出现。

1.1.2 供体的生理状态
供体植株的生理状态显著影响植物的花药和游离小
孢子培养的后续反应(Ferrie et al., 1995)。许多研究
表明, 不同栽培环境、不同花期和不同部位的花蕾,
其花粉的生理状态均可能不同, 诱导率必然也存在明
显差异(孙敬三等, 1980; 孙海鹏等, 2000)。因此, 在
供体适宜的发育时期选取合适部位进行培养非常重
要。Jacquard等(2006)在研究大麦花药培养时发现,
穗的位置对雄核发育有显著影响。当供体的穗来源于
主芽和第4分蘖时, Igri品种的花药反应从76.6%下降
到31.5%, Cork品种则从58.8%降到32.0%。当花药采
自第2分蘖节的穗上时, 其再生苗的比例迅速增加,
90 植物学报 47(1) 2012
Igri品种增加了316%, Cork品种增加了1 800%。一般
而言, 在适宜的温度条件下, 供体植株年龄越小, 其
花药培养的反应就越好。随着植株老化, 尤其是接近
开花末期的植株, 花蕾较小, 小孢子发育时期同步性
下降, 畸形花粉数量增加, 导致花药培养的反应降低
(或延迟)。从季节上看, 冬季和春季较夏季和秋季更
适合进行花药(或小孢子)培养, 这可能是温度与光周
期共同作用的结果。

1.1.3 小孢子发育时期
在诱导小孢子进行雄核发育的过程中, 不同物种小孢
子最适的发育时期不同。一般而言, 处于单核中期至
晚期的花粉培养效果较好(李守岭和庄南生, 2006),
可能的原因是这一时期的小孢子比较活跃、处于胚胎
形成的临界期且是不同分裂方式和发育途径的共同
起始点。然而, 不同植物的适宜诱导时期也不尽相同。
曹禹等(2007)选取冬性小黑麦(Triticale wittmack)主
穗上处于单核中、晚期的花药, 经培养得到绿苗, 绿
苗分化率最高达22.22%。Guo等(1999)在培养猫尾草
小孢子时发现, 单核晚期至双核期为适宜的培养时
期。而Shigemune和Yoshida(2000)对狼尾草(Penni-
setum alopecuroides)花药培养的研究发现, 其花药
培养最适宜的时期是四分体时期。
1.2 预处理
在花粉或花药培养之前, 对花芽或花药给予特定的物
理 (或化学 )处理有益于小孢子发育成再生植株
(Maheshwari et al., 1980)。花药(或小孢子)培养中采
用的预处理方法很多, 具体采用何种方式需根据培养
材料来定。

1.2.1 温度预处理
为使离体小孢子的遗传发育方向从配子体转向孢子
体, 在进行培养前通常先使用多种方法进行预处理。
多数实验表明, 温度预处理在一定程度上对提高花药
诱导愈伤组织有促进作用。温度预处理的方式主要有
低温、高温和变温3种。在禾本科牧草和草坪草的花
药培养中, 经常采用低温预处理来诱导离体雄核的发
育。低温如何起到提高诱导率的作用, 不同学者的观
点不同。黄斌(1985)曾提出低温预处理对花药培养可
能的作用机制, 他认为低温可能通过3个方面的作用
来促进小孢子雄核发育的启动。(1) 使花药内源激素
发生变化, 并由此影响小孢子, 改变其配子体发育途
径; (2) 导致小孢子孤立化, 对小孢子胚胎发生的诱
导起促进作用; (3) 低温有利于绝大多数的小孢子保
持活力, 防止褐化死亡。Nitsch和Norreel(1973)认为,
在低温预处理时, 小孢子感受到低温信号的刺激, 有
丝分裂由不均等分裂转为均等分裂, 结果多核细胞增
多, 从而启动雄核发育进程。Maheshwari等(1980)
认为低温预处理是花药和花粉培养中大幅度提高雄
核发育频率的有效手段之一。低温预处理与较低培养
温度综合作用可明显提高胚状体的产量, 同时正常胚
状体的诱导率也显著增加。Opsahl-Ferstad等(1994)
在对多年生黑麦草花药培养时, 预先对材料进行了一
段时间的冷处理, 结果表明冷处理有利于提高胚状体
的诱导率, 但也增加了白化植株的诱导率, 而绿色植
株再生率未提高。Shigemune和Yoshida (2000)对狼
尾草花药培养研究时发现, 10°C低温处理7–9天有利
于提高花药愈伤组织的诱导率。对黑麦(Secale ce-
reale)花药和小孢子培养时发现, 4°C低温处理3周,
可以显著提高愈伤组织的诱导和植株再生率(Guo
and Pulli, 2000a; Ma et al., 2004)。但是, Rose等
(1986)对高粱(Sorghum bicolor)小孢子培养时, 分别
用7°C、14°C、20°C、25°C和28°C对高粱花序进行
预处理, 结果表明, 与对照相比愈伤组织诱导率和分
化率并无显著差异。

1.2.2 甘露醇预处理
甘露醇预处理对小孢子由配子体发育转向孢子体发
育也有较好的效果, 这一点在麦类作物上表现得尤为
突出。甘露醇溶液的浓度一般为0.3 mol·L–1左右。董
静等(2005)研究表明, 甘露醇预处理的机理主要是其
对小孢子内源激素水平产生影响。培养材料经预处理
后, 小孢子内源激素水平在24小时内达到峰值, 从而
引发一系列的细胞生理变化, 导致小孢子细胞向孢子
体发育转变。不同浓度的甘露醇溶液预处理虽然在诱
导胚状体数量上没有较大差异, 但在形成的胚状体质
量上差异明显。较高的渗透压可使诱导的胚状体结构
致密且坚硬, 因而再分化能力强, 绿苗产量明显增
加。杜永芹等(1997)研究发现, 在固体培养体系中,
采用甘露醇预处理3天其效果完全可以取代常规
3–5°C条件下21天的低温预处理, 而且前者的效果一
赵永钦等: 禾本科牧草和草坪草雄核发育与单倍体育种研究进展 91
般会更好, 并能缩短培养周期。郭向荣等(1999)用不
同浓度的甘露醇预处理大麦, 发现随着甘露醇浓度的
增加, 绿苗分化频率显著提高。基因型与甘露醇预处
理的时间之间存在相互作用, 即甘露醇预处理的最适
时间, 因大麦基因型的不同而有所差异, 其变动范围
为3–5天。另外, 李文泽和胡含(1991)对大麦花药培
养中甘露醇预处理的作用进行了研究, 结果表明甘露
醇预处理能明显提高小孢子的存活率和质量, 有利于
进一步分裂形成胚状体和愈伤组织, 而且, 各发育时
期明显比对照提早2–5天。Cistué等(1999)通过实验
发现, 对于低响应的大麦基因型, 甘露醇预处理比低
温预处理效果好, 而最佳的甘露醇预处理浓度因基因
型而异, 低响应基因型比敏感型需要的甘露醇浓度
高。对黑麦花药和小孢子的培养发现, 适当浓度的甘
露醇处理有利于后期愈伤组织诱导率和分化率的提
高(Guo and Pulli, 2000b; Ma et al., 2004)。

1.2.3 其它预处理方法
Arabi等(2005)对3种基因型大麦(Igri、Arabi Abiad和
AECS76)分别用不同强度(0、5和10 Gy)的γ射线辐
照, 观察其对胚状体和植株再生的影响。结果表明,
经γ射线辐照处理的品种其胚状体产量明显升高, 且
辐照的影响与基因型有关。尽管Igri胚状体诱导率高,
但其植株再生率低, Arabi Abiad品种产生绿色植株的
能力强, 辐照对Igri和AECS76植株的再生无影响。总
体来看, 10 Gy剂量γ射线辐照的胚状体产量比5 Gy剂
量辐照高。李文泽和胡含(1995)首次将山梨醇预处理
应用到大麦花药培养中, 获得了理想的实验结果。不
同浓度(0.1–0.5 mol·L–1)的山梨醇预处理3天, 绿苗产
量差异不显著; 但同一浓度(0.3 mol·L–1)的山梨醇预
处理不同天数(1–7天)绿苗产量差异明显, 以3天预处
理的效果最好, 绿苗产量为对照的51.2倍。
1.3 培养基及其附加成分
1.3.1 基本培养基
选择合适的基本培养基是花药(或小孢子)培养技术的
重要环节之一。培养基既提供了营养物质又创造了渗
透性的环境。在大多数实验中尚未有一种确定的培养
基可同时满足不同种植物花药(或小孢子)的培养。禾
本科牧草和草坪草花药(或小孢子)培养中常采用的基
本培养基有MS、B5、PG-96、C17、N6以及在此基础
上优化出的配方。其中, MS基本培养基最为普遍。
Jähne和Lörz(1995)认为, 诱导培养基不但能够滋养
小孢子, 而且可改变小孢子的发育途径, 使其转向胚
状体的形成。另外, 培养基的状态及所用的琼脂浓度
也会影响花药培养的效果(萨日娜等, 2008)。Guo等
(1999)利用添加适宜激素的液体PG-96基本培养基并
附加6%麦芽糖, 对猫尾草进行小孢子培养时获得了
大量胚状体和愈伤组织。Ponitka等(2007)比较了固体
和液体C17培养基上9种基因型冬性小黑麦花药培养
诱导的效率, 结果表明在液体培养基上, 所有基因型
小黑麦的胚状体和绿色植株的诱导率均较高。Opsahl-
Ferstad等(1994)对多年生黑麦草的研究表明, 培养
基中的总氮含量和NO3–/NH4+比率等可影响其花粉培
养的结果。Christensen等(1997)以R2M和FW培养基
作为诱导培养基 , 研究了不同基本培养基对鸭茅
(Dactylis glomerata)花药培养的影响, 结果发现R2M
培养基上得到的胚状体大约是FW上得到的4.5倍。
R2M培养基上得到的绿色植株是FW上得到的5.5倍。
王子霞等(2000)对大赖草(Leymus racemosus)花药
培养的研究表明, C17培养基较W14更适宜大赖草的花
药培养, 其绿苗分化率可达10.34%。

1.3.2 碳源
培养基中的糖不仅能为培养物提供能量, 而且起着调
节渗透压的作用。另外, 其对小孢子的脱分化和再分
化也具有益的效应。对多数植物组织来说, 蔗糖、葡
萄糖和麦芽糖是较好的碳源。不同植物细胞渗透压差
异很大, 故不同植物对花药培养需要的糖浓度和糖种
类不同。例如, 在花药培养中, Flehinghaus等(1991)
实验证明, 麦芽糖能够提高黑麦的花药培养诱导率。
用麦芽糖代替蔗糖作为碳源, 冬性小黑麦(Lazaridou
et al., 2005)、小黑麦(Marciniak et al., 1998)、燕麦
(Avena sativa)(Kiviharju and Pehu, 1998)和大麦(孙
敬三等, 1991)的花药培养诱导率均较高。Christen-
sen等(1997)研究了所选基因型鸭茅花药培养得到的
无性繁殖系, 在麦芽糖取代蔗糖作为碳源的培养基上
的反应状况, 结果发现, 麦芽糖能够显著提高胚状体
(或愈伤组织)的分化率。因而, 在实验中应根据不同
的作物选用合适的碳源及其浓度。在黑麦的花药和小
孢子培养中, 大部分学者认为麦芽糖作为黑麦小孢子
培养的碳源时, 其适宜浓度为6%(Flehinghaus et al.,
92 植物学报 47(1) 2012
1991; Guo and Pulli, 2000b; Ma et al., 2004); 而作
为黑麦花药培养的碳源时, 其适宜浓度为9%(Dainel,
1993; Ma et al., 2004)。

1.3.3 激素
培养基中激素的种类、用量和配比对诱发小孢子的启
动、分裂、生长和分化均具重要的影响。在花药培养
中, 调节激素成分不仅可影响花粉发育的类型(即形
成胚状体还是形成愈伤组织), 而且还可影响二倍体
体细胞组织(如药壁、药隔等)的生长增殖及单倍体花
药的细胞生长增殖。在大多数禾本科牧草和草坪草的
花药培养中, 外源生长素特别是2,4-D是启动小孢子
细胞形成愈伤组织的必要条件。Rose等(1986)通过对
高粱的小孢子培养研究证实, 当培养基中的2,4-D浓
度小于2.5 mg·L–1时, 愈伤组织诱导率随着其浓度的
增加而增加, 当2,4-D浓度大于2.5 mg·L–1时, 愈伤组
织诱导率随着其浓度的增加而下降。此外, Cistué等
(1999)通过实验证明 , 抗生素三碘苯甲酸 (2,3,5-
Triiodobenzoicacid,TIBA)可促进低反应型大麦胚状
体的产生。

1.3.4 附加成分
附加成分是指在含有碳源和一定激素配比的基本培
养基中添加的某些营养物质(如谷氨酰胺等)和吸附物
质(如活性炭等)等外源添加物。许多研究证明, 附加
成分在花药和小孢子培养中发挥着积极的作用。

1.3.4.1 活性炭
目前, 活性炭已在多种作物的单倍体育种及禾本科牧
草和草坪草(如毒麦(Lolium temulentum)、草地羊茅
(Festuca pratensis)、黑麦和小黑麦等)的花药培养中
得到应用, 但不同种类的作物对活性炭的反应不同。
Opsahl-Ferstad等(1994)对多年生黑麦草的花药培养
证实, 在培养基中适量添加活性炭有利于其胚状体的
形成。Rose等(1987)对毒麦和草地羊茅等的小孢子培
养发现 , 在愈伤组织诱导培养基中添加2,4-D(0.1–
2.0 mg·L–1)、NAA(1–10 mg·L–1)或IAA(1–10 mg·L–1)
对愈伤组织的形成具抑制作用。当在每升培养基中添
加1–2 g活性炭时, 能够增加毒麦愈伤组织的诱导率
且不影响其后期的分化培养。

1.3.4.2 氨基酸及植物提取液
袁妙葆等(1989)研究了大麦花药培养中不同氨基酸
(L-丙氨酸、谷氨酰胺和天冬氨酸)添加物对绿苗分化
的影响, 结果发现添加氨基酸对绿苗分化有一定的促
进作用, 诱发频率与对照相比有所增加。杜永芹等
(1997, 2001)以不同基因型大麦为试材, 研究了天然
大麦芽提取液对大麦花药培养的影响, 结果表明在诱
导培养基中添加大麦芽提取液对大麦花药离体培养
具明显的促进作用, 尤以新鲜大麦芽提取液的效果最
为理想。孙月芳等(2003)以4个大麦品系为供试材料,
比较了诱导培养基中添加不同发育时期和不同添加
量的大麦幼穗提取液, 以及添加油菜(Brassica cam-
pestris)花蕾提取液对大麦花药培养反应的影响, 探
讨促进诱导分化率提高的最佳方案, 结果表明诱导培
养基中添加油菜花蕾提取液可明显促进花药反应率
及幼苗分化率的提高, 单核期大麦提取液的效果优于
二核期的油菜提取液, 添加油菜花蕾提取液对花药培
养反应的影响优于单核期大麦幼穗提取液。
1.4 培养条件
1.4.1 温度
温度是培养条件中最主要的因素, 特别是在诱导花粉
形成愈伤组织(或胚状体)阶段。由于离体花药对温度
比较敏感, 因此温度是诱导雄核发育的关键因素。花
粉萌发的适宜温度因植物种类不同而异。大量离体培
养实验证明, 温度与愈伤组织的产量呈负相关, 说明
供体植株离体时的外界温度是影响花药培养的因素
之一。Rose等(1986)在对高粱的小孢子培养时发现温
度对小孢子愈伤组织的形成影响很大, 最适宜的高粱
小孢子培养温度为33°C。Rose等(1987)在对毒麦、
草地羊茅、Elmet(多花黑麦草与草地羊茅的杂交种)
和Prior(多年生黑麦草与草地羊茅的杂交种)小孢子培
养研究时发现, 在25°C条件下愈伤组织生长最好, 而
20°C条件下愈伤组织的分化效果最好。

1.4.2 培养密度及花药接种位置
关于培养密度及花药接种位置对花药(或小孢子)培养
的影响多源于对大麦的研究, 培养其它作物的花药
(或小孢子)时可以考虑这2个因素。培养的花药释放出
的内源性激素和特定化学物质, 依次调节和影响胚胎

赵永钦等: 禾本科牧草和草坪草雄核发育与单倍体育种研究进展 93
的发生。孙敬三等(1991)研究了大麦花药在培养基上
的接种位置对愈伤组织形成的影响, 结果发现, 花药
竖放比平放的效果要好, 竖放时不仅绝大多数花粉愈
伤组织发生在上部的2个药室中, 而且愈伤组织的质
量也好, 它比源于下部的愈伤组织胚胎发生能力强。
Shannon等(1985)研究了大麦花药的方位对小孢子
愈伤组织产生的影响, 结果表明, 经过冷预处理的大
麦穗接种时, 若2个小室均接触到培养基, 则不产生
或产生很少的愈伤组织; 若接种时仅有1个小室接触
到培养基, 则有高比例的花药产生愈伤组织, 且顶部
小室朝上的花药产生愈伤组织的比例最高。平放的花
药与竖放的相比, 不仅产生多细胞花粉粒和微愈伤组
织的速度慢, 而且可产生微愈伤组织的部分少, 且很
早便终止愈伤组织的产生。Davies和Morton(1998)
在研究大麦小孢子培养时发现, 小孢子接种密度和群
体密度对植株再生也有显著的影响。当小孢子接种密
度大于5×104个·mL–1时可产生大量的群体; 当群体数
量为12.5–25个·cm–2时, 产生绿色小苗的数目最理
想。

1.4.3 光照
不同植物的离体花药(或小孢子)对光照的反应不同。
一般认为, 花药培养时, 在诱导愈伤组织和胚胎期间
进行暗培养(或给予散射光处理)较好。Kiviharju等
(2005)研究了光照对燕麦花药培养的影响, 结果表
明, 燕麦花药培养诱导期间对光照的反应因基因型而
异。使用暗光可明显降低栽培品种Lisbeth的绿苗再生
率 , 但对栽培品种Aslak的影响不明显。Rose等
(1987)对毒麦、草地羊茅、Elmet和Prior小孢子培养
研究时发现, 光照在低温预处理时有益, 后期培养阶
段则起抑制作用。

1.4.4 培养基pH值
花药(或小孢子)在一定的pH值范围内培养, 能够诱导
出愈伤组织或胚状体。如果培养基的pH值超出培养花
药(或小孢子)的适应范围, 则会产生抑制作用。朱建
华和彭士勇(2001)提出不同植物花药(或小孢子)的最
佳诱导pH值不同, 一般大多数花药培养基的pH值均
在5.8左右。Karsai等(1994)研究了pH值对离体小黑
麦花药培养的影响, 结果表明诱导培养基pH值为4.8

时, 所有处理的胚状体诱导率比pH值为5.8时高。李
文泽和胡含(1995)研究了pH值对甘露醇预处理效果
的影响, 结果表明, 甘露醇预处理溶液的pH值不同,
其预处理的效果也不同, 其中愈伤组织诱导率和绿苗
产量均以pH值为5.6时最高。
2 禾本科牧草和草坪草单倍体植株鉴定
及染色体加倍技术
2.1 单倍体植株的鉴定方法
再生植株的倍性鉴定在植物遗传育种中起着十分重
要的作用。由于花药壁和绒毡层等细胞的影响, 通过
雄核诱导途径获得的再生株系往往是单倍体、二倍体
及其它倍性植株的混合群体。因此, 有效的倍性鉴定
是了解其遗传背景和进一步应用的基础。由于植株倍
性的不同, 其在细胞学和形态解剖学上会具有较大的
差异, 通常采用的倍性鉴定方法有直接鉴定法和间接
鉴定法2种。

2.1.1 直接鉴定法
直接鉴定法是指染色体计数方法, 这是确定再生植株
倍性最基本且最准确的方法。一般以根尖和叶片愈伤
组织为记数材料, 采用压片法进行染色体标本制备。
压片法是指先在对二氯甲苯(或8-羟基喹啉)水溶液中
预处理, 使中期染色体缩短, 再用卡诺固定液固定
1–2小时, 之后用醋酸洋红或铁矾苏木精染色, 观察
细胞中期染色体并计数。在鉴定单倍体植株根尖细胞
染色体数目时, 由于其具有二倍化倾向, 即细胞中染
色体组可能自然加倍, 故仅进行根尖分析, 还不能为
植物的染色体倍性分析提供可靠的证据, 应辅助根尖
以外细胞(如嫩叶细胞和花粉母细胞等)的染色体观
察, 以便排除嵌合体的干扰。

2.1.2 间接鉴定法
间接鉴定法主要包括外部形态指标鉴定、叶片气孔保
卫细胞数目鉴定以及流式细胞仪鉴定法。流式细胞仪
鉴定法是通过测定处于分裂间期细胞的DNA含量 ,
从而确定细胞的倍性, 是一种快速的鉴定方法。它不
受取样部位和时间的限制, 且对样品的需要量少, 适
合大量样本检测使用, 但检测成本较高。
94 植物学报 47(1) 2012
2.2 单倍体植株的加倍方法
利用离体雄核诱导培养出的单倍体植株并没有直接
利用价值, 经过染色体加倍处理后的材料在育种过程
中则应用价值较大。人工加倍一般选用适宜浓度的秋
水仙素进行处理。韩彬等(1990)在对小麦进行染色体
加倍实验时发现, 采用的秋水仙素浓度高低对植物材
料并不存在阈值, 处理时间则是一个关键因素。有研
究表明, 秋水仙素的浓度、处理时间和处理温度三因
素是一个统一体, 任何一个因素水平的上升或下降,
均会不同程度地影响染色体的加倍效果。在一定范围
内若某一因素水平上升(或下降)1个等级, 通过另一
因素水平的调整, 同样可获得满意的效果(李志武等,
1996)。马艳红(2006, 2007)首先建立了加拿大披碱草
(Elymus nutans)与披碱草(E. dahuricus)和圆柱披碱
草(E. cylindricus)2个杂种F1的组培再生体系, 然后
用秋水仙素处理愈伤组织, 结果表明, 加拿大披碱草
与披碱草杂种F1用浓度为150 μmol·L–1的秋水仙素处
理48小时的变异率最高为12%; 而加拿大披碱草与
圆柱披碱草杂种F1用浓度为200 μmol·L–1的秋水仙素
处理16小时的变异率最高为10%。Park和Walton
(1989)用秋水仙素处理加拿大披碱草与黑麦属间杂
种F1愈伤组织产生的再生苗获得了双倍体植株。
Kasperbauer和Eizenga(1985)通过组织培养对高羊
茅(Festuca arundinacea)单倍体进行了加倍, 并获
得了加倍植株。在雄核诱导培养过程中, 对于禾本科
牧草和草坪草来说, 染色体自然加倍得到二倍体纯合
植株是目前花药培养育种最为常见的加倍方法。自然
加倍过程受到多种因素的影响, 其中物种的影响最
大。如水稻(Oryza sativa)花药培养其自然加倍率可达
70%, 小麦花药培养其自然加倍率介于20%–30%之
间, 烟草(Nicotiana tabacum)花药培养该值则几乎为
0(袁惠燕等, 2008)。Guo和Pulli(2000a)在对猫尾草小
孢子培养研究时发现, 获得的再生植株中二倍体植株
占65.6%, 自然加倍率较高。
3 问题与展望
随着现代生物技术的迅速发展, 禾本科牧草和草坪草
雄核发育与单倍体育种研究的意义在不断扩大。利用
此项技术不仅可以缩短育种材料的纯化时间及通过
对杂交F1、F2的单倍体培养选择特异的性状等, 还可
建立DH(double-haploid)群体。DH群体中的双单倍体
植株具有遗传上的纯合基因组, 是筛选分子标记和构
建基因图谱的理想材料。目前, 利用花药(或小孢子)
培养获得禾本科牧草和草坪草单倍体植株的研究虽
然已取得了较大进展, 但在理论和应用方面还存在许
多亟待解决的问题。单倍体育种与常规育种技术相比
虽然有较大优势, 但尚未真正广泛应用到禾本科牧草
和草坪草的育种中,主要存在以下几个方面的问题。
(1) 诱导频率和分化成苗率较低。一方面原因是
愈伤组织诱导频率和分化成苗率低; 另一方面原因是
禾本科牧草单倍体育种过程中会产生大量的白化苗
(Day and Ellis, 1984, 1985; Dunford and Walden,
1991; Harada et al., 1991)。对于大多数禾本科牧草
和草坪草来说, 能形成有活力胚的花药(或小孢子)百
分率很低, 且在花药(或小孢子)离体培养时, 通常会
出现许多问题, 如没有生长和发育的迹象, 刚开始生
长胚便败育, 大量畸形胚状体出现, 愈伤组织分化能
力低, 出现白化苗等。例如, Guo和Pulli(2000a)在对
猫尾草小孢子培养时发现, 植株再生过程中出现了大
量白化苗, 其白化苗率在9.3%–22%之间。
(2) 单倍体培养易受到体细胞等的干扰。在花药
培养过程中, 花药壁和绒毡层组织均会经过愈伤组织
阶段形成胚状体, 因而, 花药培养易受体细胞的干
扰, 在产生单倍体的同时会产生二倍体或四倍体。在
离体状态下, 花药壁和绒毡层细胞对花粉发育的作用
尚不十分清楚。如何用人工合成培养基代替绒毡层的
作用目前还知之甚少。培养过程中小孢子分裂而二倍
体组织不分裂的理想状态往往难以实现。此外, 在混
倍性的材料中很难分离出单倍体, 且单倍体细胞的生
长易被生长旺盛的多倍体细胞所掩盖。
(3) 单倍体植株的起源问题有待进一步研究。有
些获得单倍体植株的报道缺乏细胞学和组织学鉴定,
没有充分的证据证明其单倍体的起源。Wang等
(1991)培养了十倍体高冰草(Thinopyrum ponticum)
(2n=10x=70)的花药, 发现胚状体由花药中的小孢子
直接形成, 进一步培养, 胚状体上长出根和芽, 最终
形成绿色再生植株。取花药培养得到的再生植株的根
尖细胞, 经形态鉴定发现其中含有36条染色体, 说明
得到的再生植株为非整倍多元单倍体(2n=36)。有些
牧草花药培养只得到混倍体, 故未证明其再生植株的
起源问题。Christensen等(1997)研究了同源四倍体
赵永钦等: 禾本科牧草和草坪草雄核发育与单倍体育种研究进展 95
(2n=4x=28)鸭茅的花药培养, 利用流式细胞仪技术
对取自不同无性繁殖系的54株绿色再生植株的倍性
进行了分析, 结果发现有22株为二倍体, 29株为四倍
体, 3株为八倍体, 其中9株植株根尖细胞的染色体数
目证实了流式细胞仪的结果, 二倍体植株中有近40%
的再生植株源于四倍体亲本的小孢子。
(4) 将单倍体育种与常规育种和分子育种有效结
合, 拓宽单倍体育种的应用领域。这不但可以显著提
高培养效率, 快速纯化植物基因型, 尽快获得纯合转
基因植物, 而且易于目的基因的表达。Ferrie等(1995)
认为单倍体胚性系统提供了一种有效的转化手段, 引
入的性状很容易通过染色体加倍固定下来。例如 ,
Guo等(2009)利用农杆菌转化花药培养得到的愈伤组
织, 最终获得了双二倍体羊茅黑麦草植株。将携带
CaMV35S启动子控制的编码潮霉素抗性和β-葡萄糖
醛酸酶基因pIG121-Hm的农杆菌LBA4404侵染羊茅
黑麦草Bx351花药培养得到的愈伤组织, 经潮霉素筛
选发现, 82.6%的转化株有GUS活性。通过分子鉴定,
证明外源基因已经整合到双单体转化株中。
(5) 单倍体培养中, 诱导单倍体植株的发育调控
及其分子机理的研究尚不够深入。小孢子的诱导机
制、启动机理、发育途径及其与生理生化变化的关系
等均需进一步明确。目前, 关于禾本科牧草和草坪草
雄核发育方面的研究不多。Rose等(1987)研究了毒
麦、草地羊茅及其杂交种花药培养过程中花粉雄核发
育的途径, 结果表明, 营养细胞的发育为其花粉雄核
发育的主要途径, 生殖细胞的发育则差异显著。小孢
子自身的核内复制和核融合等会产生倍性变异, 故应
进一步研究如何有效地调控以达到控制不利变异和
利用有效变异的目的。
高频再生体系的建立和染色体加倍技术仍是今
后深入研究的基础。在此基础上根据对单倍体植株的
利用目的不同, 选择具代表性的种和品种进行单倍体
培养; 并可应用分子生物学手段进行基础性研究, 从
根本上消除基因型对花粉植株诱导率的影响。将单倍
体培养技术与细胞离体筛选、诱变和转基因技术相结
合, 在短时间内, 可培育出高抗、优质的禾本科牧草
和草坪草新品种。构建双单倍体群体, 可为分子标记、
遗传图谱的构建、基因克隆以及各种遗传学研究提供
理想的实验材料。深入研究小孢子脱分化启动与胚状
体的发生机理和诱导条件是从胚状体途径提高禾本
科牧草与草坪草单倍体诱导率的关键。因此进一步研
究小孢子的发育调控机理, 从而主动定向地进行调
控, 筛选目标性状, 增强育种的可预见性, 将是禾本
科牧草与草坪草单倍体育种的发展方向。
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赵永钦等: 禾本科牧草和草坪草雄核发育与单倍体育种研究进展 99
Research Progress in Androgenesis and Haploid Breeding of
Gramineous Forage and Turfgrass Plants
Yongqin Zhao, Xinxin Wu, Wei Li, Ren Li, Wenjun Shi, Yangdong Guo*
College of Agriculture and Biotechnology, China Agricultural University, Beijing 100193, China
Abstract Gramineous forage and turfgrass are critical to sustainable agriculture and contribute extensively to urban
landscaping and ecological protection. In recent years, with the rapid development of biotechnology, significant progress
has been made in androgenesis and haploid breeding research of gramineous forage and turfgrasses. This review de-
scribes the development of androgenesis systems for gramineous forage and turfgrass and summarizes the latest pro-
gress of some important influencing factors on androgenesis and haploid breeding. The genotype of experimental mate-
rials is the main factor influencing androgenesis efficiency. The optimal stage for efficient androgenesis of microspore
development is between middle and late uninucleate. The ratio and quality of callus induction were improved after anthers
were pretreated with low temperature or mannitol. Suitable varieties and ratios of hormone are also the key factors in
androgenesis. We summarize the methods of ploidy determination and techniques of chromosome doubling and point out
prospects for further research into double haploid breeding in forage and turfgrass.
Key words androgenesis, anther culture, forage, microspore culture, turfgrass
Zhao YQ, Wu XX, Li W, Li R, Shi WJ, Guo YD (2012). Research progress in androgenesis and haploid breeding of
gramineous forage and turfgrass plants. Chin Bull Bot 47, 87–99.
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* Author for correspondence. E-mail: yaguo@cau.edu.cn
(责任编辑: 孙冬花)