全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (11) : 1613 - 1620
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 04 - 17; 修回日期 : 2008 - 10 - 08
基金项目 : 北京市科委科技项目 ( Z07080501570703)3 E2mail: tongxiaodou@ sohu1com
辣 (甜 ) 椒游离小孢子培养中的雄核发育和胚胎
发生
李春玲 3 , 佟曦然 , 朱至清 , 顾淑荣 , 蒋钟仁 , 张树根
(北京市海淀区植物组织技术实验室 , 北京 100091)
摘 　要 : 对灯笼椒、牛角椒、羊角椒、线形椒和朝天椒等辣 (甜 ) 椒游离小孢子的培养与观察表明 :
在雄核发育过程中 , 分离后仍膨大的小孢子能够继续发育 , 皱缩的小孢子则死亡 ; 小孢子最初的细胞分裂
有均等和不均等两种方式 ; 脱分化的小孢子可经历胚胎发生和器官发生两种发育途径 , 二者之间可相互转
换 ; 胚胎发生过程与合子胚发育过程极相似 , 直到心形胚以前均可观察到胚柄的存在 ; 成熟的胚状体能够
萌发 , 但胚根端生长的能力远远比胚芽端强 ; 观察到胚状体发生不同步及多种畸形发育形式 ; 小孢子在分
裂早期如果突破花粉壁会形成薄壁细胞团 , 继续发育为愈伤组织 , 进而转向器官发生途径 ; 小孢子愈伤组
织易形成不定根 , 可形成次生胚状体 , 未观察到不定芽的发生。不同类型辣 (甜 ) 椒游离小孢子的雄核发
育与胚胎发生程序相同。
关键词 : 辣 (甜 ) 椒 ; 游离小孢子 ; 雄核发育 ; 胚胎发生 ; 细胞学观察
中图分类号 : S 64113　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 1121613208
Androgenesis and Em bryogenesis in Isola ted M icrospore Culture of
C apsicu m annuum L .
L I Chun2ling3 , TONG Xi2ran, ZHU Zhi2qing, GU Shu2rong, J IANG Zhong2ren, and ZHANG Shu2gen
(Laboratory of P lant Tissue Culture Technology of Haid ian D istrict, B eijing 100091, China)
Abstract: Androgenesis and embryogenesiswere observed in isolated m icrospore culture of Capsicum an2
nuum L. D ifferent fruit types of sweet and hot pepper were used as experimental materials. The results indica2
ted that the m icrospores expanding in volume after p retreatment and isolation continue to develop while the
shrivelled ones were dead and that the first sporophytic division was symmetric or asymmetric. It was also ob2
served that the dedifferentiated m icrospores have two developmental pathways: embryogenesis and organogene2
sis, and the two pathways could change each other in developmental p rocess. Embryogenesis course of m icro2
spores was sim ilar to that occurred in zygotic embryogenesis. Suspensor2like structure was observed before and
during heart embryo stage. Matured embryoid could germ inate but the root tip growth more easily than shoot
tip. Embryogenesis of m icrospores was strong asynchrony and there were many abnormality occurred in every
stage of entirely p rocess; W hen a divisional m icrospore broke the cell wall in early stage, it changed to thin2
walled cellmass and then developed callus. Itwas showed that some of m icrospore2derived callus differentiated
secondary embryoids but not adventitious buds although adventitious root differentiation was easily occurred
from the callus. Androgenesis and embryogenesis of isolated m icrospores were sim ilar in different types of Cap2
sicum annuum L.
Key words: Capsicum annuum ; isolated m icrospores; androgenesis; embryogenesis; cytological obser2
vation
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园 　　艺 　　学 　　报 35卷
在辣 (甜 ) 椒花药培养中 , 由于花药壁等二倍体细胞始终存在并与单倍体的小孢子同时发育 ,
因此后代植株中易出现供体植株二倍体的混杂 (Novak, 1974; Mythili & Thomas, 1995)。游离小孢子
培养技术可以排除二倍体细胞的混杂 , 获得可靠的小孢子来源的胚状体或愈伤组织 , 进而获得单倍体
小植株 , 经自发或人工诱导加倍后形成双单倍体 (DH) 植株用于杂交育种。
许多研究者都强调基因型对小孢子培养成功的影响很大 (Novak, 1974; Yoon et al. , 1991; Mak
& Maheswary, 1994)。
就辣 (甜 ) 椒小孢子培养而言 , Bal等 ( 2003 ) 用甘露醇饥饿 , 10 ℃预处理 , 无激素并添加
17%蔗糖的 NLN培养基得到了小孢子愈伤组织 ; 王烨等 (2004) 报道了 5种预处理对辣椒小孢子离
体培养前期存活率的影响 ; Supena等 (2006) 用 9 ℃低温 , 含有 2%麦芽糖的双层 N itsch培养基培养
辣椒花药并使散落的小孢子成功完成了胚胎发生和成苗的过程 ; 最近 Kim等 (2008) 用热激、蔗糖
饥饿以及含有 9%蔗糖的 NLNS培养基成功诱导出辣椒的胚状体 , 同时证明蔗糖优于麦芽糖。不同作
者的培养方法差异如此之大 , 从一个角度证明了基因型差异的重要影响 ; 然而从另一角度看 , 以往探
索的培养因子很可能并不是培养成功的决定因素。
作者对多个品种和杂交种的辣 (甜 ) 椒在游离小孢子培养中的雄核发育和胚胎发生进行了系统
的观察 , 以期明确基因型差异是否导致游离小孢子发育过程的不同 , 从而为调控其雄核发育和胚胎发
生提供参考。
1　材料与方法
2003—2007年 , 每年选择市售、自选和自配的辣 (甜 ) 椒 ( Capsicum annuum L. ) 品种和杂交
种 5～8种 , 包括灯笼椒 ( 0321009、0421003、0521008) , 牛角椒及羊角椒 ( 0521006、0621009、062
1010) , 线形椒 (0621013) 和朝天椒 (0521007) 种植于北京试验基地。
夏季试验材料在大棚种植 , 取材期 5—9月 ; 冬季试验材料在温室种植 , 取材期 10月 —次年 4
月 , 重复 4年。
取单核期的辣 (甜 ) 椒花蕾 , 经 75%酒精 30 s, 011%升汞 8 m in, 无菌水冲洗 3次后取花药接
种于固体 Cp培养基上。于 35 ℃暗培养 5～12 d后 , 用液体 Cp ( Sibi et al. , 1979) 培养基制备游离
小孢子。经 300目滤网过滤 , 1 000 r·m in - 1离心收集小孢子 , 弃上清液 , 重复 3次 , 最终悬浮于改
良的液体 R (蔗糖或麦芽糖 3%或 6% ) ( Sibi et al. , 1979) 培养基中。调整小孢子含量约 1 ×105个 ·
mL - 1 , 分装于直径 30 mm培养皿中。每皿 2 mL, 进行震荡培养。Leica DM IL、OLYMPUS SZX12显微
观察记录培养过程中小孢子的分裂和生长发育。
2　结果与分析
除朝天椒 0521007仅获得小孢子愈伤组织外 , 其余品种均得到了小孢子愈伤组织和胚状体 , 愈伤
组织诱导率为 01031% , 胚状体诱导率为 01022%。小孢子愈伤组织分化尚不理想 ; 除畸形胚外 , 正
常胚状体可萌发为完整植株 , 移栽成活率 > 95%。下面以灯笼椒 0521008为例 , 说明甜 (辣 ) 椒游离
小孢子培养中的雄核发育和胚胎发生过程。
211　辣 (甜 ) 椒游离小孢子培养中细胞分裂与多细胞团的形成
单核期花药在经过高温预培养后绝大多数小孢子仍处在单核期 (图 1, 1) , 但有些小孢子膨大 ,
有些小孢子皱缩 (图 1, 2)。游离小孢子在液体培养基中培养数日 (9～20 d) 后 , 膨大的小孢子开
始启动生长发育 , 皱缩的小孢子则死亡。
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　11期 李春玲等 : 辣 (甜 ) 椒游离小孢子培养中的雄核发育和胚胎发生 　
　　观察到单核小孢子最初的细胞分裂有均等 (图 1, 3、4) 和不均等分裂 (图 1, 5、6) 两种方
式 , 而且均等分裂略多于不均等分裂 , 与 Kim等 (2004) 对花药培养中雄核发育的报道不一致。随
后的分裂为四细胞 (图 1, 7)。当继续分裂为多细胞时 , 有的还没突破花粉壁 (图 1, 8) , 有的已经
突破花粉壁。
212　辣 (甜 ) 椒游离小孢子培养中愈伤组织的形成
从空间结构角度看 , 突破花粉壁始于萌发孔 (图 1, 9) , 是一个渐变的过程 (图 1, 10～14)。
从时间上看 , 突破花粉壁始于小孢子还未分裂 (图 1, 10) 至分裂几次以前 (图 1, 11～15)。突破
花粉壁后便以薄壁细胞的形式继续非极性分裂生长 (图 1, 15、16) , 进而发育为细胞较大、细胞质
较稀薄的多细胞团 (图 1, 17) , 直至形成愈伤组织 (图 1, 18)。
图 1　辣 (甜 ) 椒游离小孢子培养中的雄核发育
1. 单核小孢子 ; 2. 膨大小孢子和皱缩小孢子 ; 3. 均等分裂 , 二细胞 ; 4. 均等分裂 , 三细胞 ;
5. 不均等分裂 , 二细胞 ; 6. 不均等分裂 , 三细胞 ; 7. 分裂为四细胞 ;
8. 分裂初期不突破花粉壁 ; 9. 突破花粉壁始于萌发孔或花粉沟 ;
10～14. 突破花粉壁的渐变过程 ; 15、16. 突破花粉壁后成为薄壁细胞 ;
17. 多细胞团 ; 18. 愈伤组织。观察倍数 : 单细胞 , 600 ×;
多细胞团 , 300 ×。
F ig. 1　Androgenesis in isola ted m icrospore culture of Capsicum annuum L.
1. Late2uninucleate m icrospore; 2. Expanded m icrospores will develop and the shrivelled ones will dead; 3. Symmetric division,
2 cells; 4. Symmetric division, 3 cells; 5. A symmetric division, 2 cells; 6. A symmetric division, 3 cells;
7. D ivision to 4 cells; 8. D ivision but not breaking the cell wall; 9. B reaking the cell wall from germ inal
aperture or pollen ditch; 10 - 14. B reaking the cell wall was a gradual p rocess;
15, 16. Became to thin2walled cell after B reaking the cell wall;
17. Multicellular mass; 18. Callus. Observational multip le:
Single cell, 600 ×; Multicellular mass, 300 ×.
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图 2　辣 (甜 ) 椒游离小孢子培养中的胚胎发生和胚状体畸形
1. 球形胚初期无胚柄 ; 2. 球形胚初期有胚柄 ; 3. 球形胚有胚柄 ( su) ; 4. 球形胚无胚柄 ; 5～9. 心形胚发育过程 ,
6、9. 有胚柄 ( su) ; 10. 鱼雷形胚 ; 11. 子叶期胚 ; 12、13. 单列或较少细胞构成的胚柄结构 ; 14. 多细胞柱状胚柄 ;
15. 混合型胚柄 ; 16. 胚状体和愈伤组织混合生长 ; 17. “话筒形”胚状体的发育 ; 18. “连头胚”的发育 ;
19～21. “连头胚”萌发根 ; 22、23. “连根胚”; 24. “并连胚”; 25、26. 多子叶胚状体 ; 27～29. 次生胚。
观察倍数 : 1、2、14～16. 300 ×; 3～13. 150 ×; 17、18、22～26. 150 ×; 19～21. 70 ×; 27～29. 200 ×。
F ig. 2　Em bryogenesis in isola ted m icrospore culture of Capsicum annuum L. and abnorma l em bryo id
1. Early stage of globular embryo has not suspensor2style like structure; 2. Early stage of globular embryo has suspensor2style;
3. Globular embryo has suspensor ( su) ; 4. Globular embryo has not suspensor; 5 - 9. Development of heart shaped embryo;
6, 9. Heart shaped embryo has susponsor ( su) ; 10. Torpedo shaped embryo; 11. Embryo at cotyledon stage;
12, 13. Suspensor2style like structure with single line or few cells; 14. Multicellular and p illar2like suspensor structure;
15. M ixed type2like suspensor structure; 16. M ixed growth of embryoid and callus; 17. Development of“m icrophone”
shaped embryoid; 18. Development of“head2linked”embryoid; 19 - 21. Germ inated root tip in
“head2linked”embryoid; 22, 23. “Root2linked”embryoid; 24. “Shunt2wound embryoid”;
25, 26. Embryoid with multi2cotyledon; 27 - 29. Regenerative embryoid.
Observational multip le: 1, 2, 14 - 16. 300 ×; 3 - 13. 150 ×;
17, 18, 22 - 26. 150 ×; 19 - 21. 70 ×; 27 - 29. 200 ×.
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　11期 李春玲等 : 辣 (甜 ) 椒游离小孢子培养中的雄核发育和胚胎发生 　
213　辣 (甜 ) 椒游离小孢子培养中的胚胎发生
21311　小孢子胚状体发生　
在多细胞进入球形胚初期这一阶段 , 观察到无胚柄 (图 2, 1) 和有胚柄 (图 2, 2) 两种发育状
况。随后的发育在不同品种中均按照球形胚 (图 2, 3、4)、心形胚 (图 2, 5～9)、鱼雷形胚 (图 2,
10)、子叶期胚 (图 2, 11) 的模式或程序发育。
值得注意的是 , 胚柄结构虽然形成于球形胚初期 , 但有些情况下可以经过球形胚期 (图 2, 32
su)、心形胚期 (图 2, 62su) 一直保留到晚心形胚期 (图 2, 92su)。而且胚柄结构有少量或单列细
胞 (图 2, 12、13) 和多细胞柱状集合 (图 2, 14) 或两种形式的混合 (图 2, 15)。经常观察到同
一培养皿内有胚状体和愈伤组织同时生长发育 (图 2, 16)。
游离小孢子在液体培养基中发育的启动时间极不一致 , 与 Kim等 (2004) 对花药培养中雄核发
育的报道一致。
培养 4周时可观察到第 1批子叶型胚状体 , 与此同时仍观察到不少存活的单核小孢子 , 它们还会
继续发育 , 在同一批培养物中可连续转出 3～4批子叶型胚状体。
这一现象说明同样处在单核靠边期的小孢子其生理状况却差异极大 , 这对发育的调控提出了更高
的要求。
观察中还发现游离小孢子的胚胎发生过程中有多种形式的畸形胚出现 :
第一 , 胚状体胚根端分化发育正常 , 胚芽端不分化 , 形成小愈伤团 , 整体形状类似于 “话筒 ”
状 (图 2, 17) ;
第二 , 不同胚状体胚芽端相连、胚根端游离形成 “连头胚 ”, 游离的胚根端可连续生长直至萌发
(图 2, 18～21) , 连接部位可以是小愈伤组织团 (图 2, 18) , 也可以是芽端 (图 2, 19) ;
第三 , 不同胚状体胚根端相连 , 胚芽端游离形成 “连根胚 ” (图 2, 22、23) ;
第四 , 不同胚状体彼此靠在一起形成 “并连胚 ” (图 2, 24) ;
第五 , 观察到多子叶胚状体 (图 2, 25、26) ;
第六 , 观察到了胚状体上产生次生胚 (图 2, 27～29)。
21312　胚状体愈伤化和器官发生的潜能 　
在游离小孢子胚胎发生过程的各个阶段均观察到了再次脱分化形成愈伤组织的现象 (图 3, 1～
7) , 从而降低了产生正常胚状体的频率。
另外 , 当小孢子经多次分裂形成薄壁细胞团和愈伤组织时 , 多数情况下易产生不定根 (图 3, 92
r) , 偶尔有胚状体产生但未见发育成熟 (图 3, 82e、92e)。
目前还未观察到不定芽的产生。
以上结果说明甜 (辣 ) 椒游离小孢子愈伤组织具有一定的器官发生潜能。
214　胚状体萌发和小植株形成及移栽
成熟的胚状体转移至固体的 R培养基上便可萌发为完整植株 (图 4, 1～7) , 这一过程历时 1～2
周。小植株外形与供体植株接近 , 即甜椒叶形较宽 (图 4, 4、5、9) , 辣椒叶形较窄 (图 4, 6、7、
10)。
研究中发现胚状体胚芽、子叶端发育及萌发的能力明显低于胚根端 (图 4, 2) , 因而试管苗极易
生根 (图 4, 8)。正常小植株移栽成活率 > 90% (图 4, 9～11)。
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215　辣 (甜 ) 椒游离小孢子培养中的发育模式
辣 (甜 ) 椒游离小孢子培养中的发育模式总结为图 5。
不同类型辣 (甜 ) 椒游离小孢子的雄核发育包括均等分裂与不均等分裂 , 分裂初期突破花粉壁
与不突破花粉壁两个关键环节 (图 5, 雄核发育部分所示 ) ; 不同品种胚胎发生的程序相同 , 均有两
个显著特点 , 即发育初期具有或不具有胚柄以及发育全程都有可能出现愈伤化 (图 5, 胚胎发生部
分 ) , 因此 , 对胚胎发生的调控应着重避免胚胎发生过程中的愈伤化 (红色箭头所示 ) ; 在小孢子愈
伤组织的器官发生中 , 不定根容易分化 , 但不定芽和胚状体的分化为技术难点 (图 5, 器官发生部
分 , 黄色虚箭头所示 )。
另外 , 游离小孢子脱分化启动后的发育程序没有变 , 因此对脱分化启动前不同品种基因差异表达
的研究与调控是提高启动生长效率的关键。
图 5　辣 (甜 ) 椒游离小孢子发育过程总结
F ig. 5　Summar ize the developm en t of isola ted m icrospore culture in Capsicum annuum L.
3　讨论
类似胚柄结构的存在意味着细胞或组织在发育初期出现极性分化 , 很可能与小孢子的不均等分裂
相关 , 但本文还未能明确这种联系。胚柄结构的有无和其形态多样性引出的问题是 : 与胚状体发生相
关的极性分化是出现在小孢子分裂前、分裂中 , 还是已经分裂为多细胞但仍未突破花粉壁的时候。在
有些情况下小孢子突破花粉壁后即形成薄壁细胞 , 经历一定时段的非极性分裂与生长发育形成愈伤组
织 , 可见非极性的分裂发育是阻碍胚状体形成的一个重要原因。显然 , 如何调控小孢子分裂的极性以
及正常的胚胎发育进程是进一步研究中的重要课题。另外 , 游离小孢子的胚胎发生是否与不均等分裂
有关而与均等分裂无关 , 分裂如果发生在单核中期或极晚期 , 或发生在双核早期的营养核或生殖细胞
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时是否会导致不同的发育结果 , 这些细节是否与最终收获胚状体的数量和质量有关 , 都还需要进一步
研究。
辣 (甜 ) 椒游离小孢子培养中的胚胎发生过程与花药培养以及合子胚的胚胎发生过程极其相似。
然而由于完全脱离母体组织的滋养 , 游离小孢子来源的胚状体畸形频率比花药培养的要高 , 比合子胚
发育结果更高 , 表明游离小孢子培养基中的营养和激素组成还有待进一步改进。
辣 (甜 ) 椒游离小孢子培养中胚胎发生与器官发生可经由脱分化的愈伤组织相互转化。相同基
因型的小孢子在条件相同的同一培养皿内有胚状体和愈伤组织同时生长发育 (图 2, 16) , 说明在基
因型和培养条件相同的条件下细胞所处的生理状况可以影响甚至决定发育 , 从而增加了调控的细微程
度和复杂性。研究中发现愈伤组织形成很容易 , 由愈伤组织分化不定根容易 , 由愈伤组织分化胚状体
很难 , 分化不定芽更难 , 这构成了辣 (甜 ) 椒游离小孢子培养技术环节中的重要难点 , 即营养芽生
长点分化难。这可能与本试验观察到的小孢子胚状体胚芽、子叶端正常发育能力较弱而胚根端正常发
育能力较强有相同归因 , 推测可能与辣 (甜 ) 椒微繁殖中不定芽分化难、栽培中育苗期较长或者生
殖生长状态下的假二叉分枝等生物学特性具有相同、相近或相关的生物学机制。
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