全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2010, 45 (6): 739–743, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3969/j.issn.1674-3466.2010.06.011

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收稿日期: 2010-04-13; 接受日期: 2010-07-27
基金项目: 国家科技支撑计划(No.2006BAD09A09)、国家自然科学基金(No.30170164)和湖北省农业科技创新中心资助(No.2007-620-
003-03-04)
* 通讯作者。E-mail: wrl@njau.edu.cn
杂草果实的冰冻切片技术
李儒海1, 2, 3, 强胜1*
1南京农业大学杂草研究室, 南京 210095; 2湖北省农业科学院植保土肥研究所, 武汉 430064
3农作物重大病虫草害防控湖北省重点实验室, 武汉 430064
摘要 介绍一种快速、简便的杂草果实解剖技术。以4种木质化程度高且能够漂浮的杂草果实为材料进行冰冻切片, 经过
材料固定、前处理、样品冷台固定、冷冻切片、展片、染色和观察并拍照等操作步骤, 可以获得清晰的果实解剖照片, 直
观地揭示杂草果实适应漂浮的显微结构。杂草果实冰冻切片方法的优点是不需要对材料进行长时间的软化处理以及繁
琐的脱水和包埋等过程。其关键环节是适宜的甘油浓度、冰冻温度和展片步骤。其中, 15%的甘油浓度进行前处理最
合适。
关键词 冰冻切片, 显微结构, 杂草果实
李儒海, 强胜 (2010). 杂草果实的冰冻切片技术. 植物学报 45, 739–743.
杂草果实传播的途径多种多样, 通过水流传播
也是一种重要的传播方式(李儒海和强胜, 2007)。杂
草果实能够被水流传播, 必定具有适应漂浮的形态
结构。目前的研究只局限于对这种形态结构进行宏
观定性描述, 例如一些杂草果实具有特殊组织, 如
含油、含气室或含比重较轻的组织(如木栓组织), 可
帮助杂草果实漂浮在水面, 典型的如菵草(Beckm-
annia syzigachne)的果实具有气室 , 水芹 (Oena-
nthe javanica)的果皮具有发达的木栓质(李儒海和
强胜, 2007)。然而关于杂草果实适应漂浮的显微结
构研究尚未见报道。开展此方面的研究, 对于从微
观上揭示杂草果实适应水流传播的机制具有重要
意义。
高度木质化材料的切片难度比未木质化和低木
质化材料大得多。进行石蜡切片, 需要在包埋前进行
长时间的软化处理。软化试剂(如硫酸和氢氟酸等)通
常具有高度的腐蚀性。即便如此, 从软化、脱水、包
埋、切片到染色封片, 整个过程大约需要2周。另外,
高度木质化的组织脱水往往不彻底, 包埋剂渗透不深
入; 再者, 由于包埋过程中材料脱水变硬(尤其是一
些组织块, 细胞腔大而壁薄), 要保持完整的切片十
分困难(林月惠等, 2001)。这是石蜡切片技术用于高
度木质化材料的不足之处。杂草果实的果皮一般高度
木质化, 而种子由种皮、胚和胚乳(有或无)组成, 果皮
与种子的质地相差很大, 因此要得到完整的石蜡切片
难度更大。
与常规的石蜡切片相比, 冰冻切片具有快速、简
便和易操作等优点。冰冻切片技术在动物和人体组织
研究中已广泛应用(Laube and Kiderlen, 1998; New-
ton et al., 2002; Makarenko et al., 2003; Kouznet-
sova et al., 2006; Patro et al., 2009)。由于植物细胞
结构的特殊性, 该技术在植物组织研究中难以推广,
仅在少数植物器官和组织的研究中有所应用(Conley
and Hanson, 1994, 1997; 贺新强等, 1999; 林月惠
等 , 2001; 陈丹和赵洁 , 2005; 刘剑锋等 , 2006a,
2006b; 宁代锋等, 2008; 张新成等, 2008; 焦石等,
2009; 陆叶等, 2009)。本研究参考文献报道的高度木
质化植物组织冰冻切片方法(贺新强等, 1999; 林月
惠等, 2001; 刘剑锋等, 2006a, 2006b), 并根据杂草
果实的特性, 对一些环节进行了改进; 选择木质化程
度高且能够漂浮的杂草果实进行冰冻切片, 取得了较
好结果。
·技术方法·
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1 材料与方法
1.1 植物材料
研究材料为4种木质化程度高且能够漂浮的杂草(齿
果酸模(Rumex dentatus Linn.)、牛膝(Achyranthes
bidentata Blume)、南苜蓿 (Medicago polymorpha
Linn.)和窃衣 (Torilis scabra (Thunb.) D. C.))果实
(表1), 2006年采自江苏省南京市, 在室内风干。
1.2 仪器与试剂
仪器与设备 : Leica CM 1850型冰冻切片机(Leica
Microsystems)、 Zeiss数码显微镜(Carl Zeiss, Inc.)、
SHB-III型循环水式多用真空泵(郑州市华科仪器厂)、
德制玻璃真空干燥器(25 cm)和LRH-250-G型恒温培
养箱(广东省医疗器械厂)。
试剂: 70%乙醇、甘油(质量分数分别为10%、
15%、20%和50%)、1%番红水溶液、0.1%固绿乙醇
溶液(95%乙醇配制)、95%乙醇和稀释的胶水。
1.3 方法与步骤
实验操作步骤为: (1)材料固定; (2)前处理; (3)固定样
品至冷台; (4)冰冻切片; (5)展片; (6)染色; (7)观察并
拍照。

1.3.1 材料固定
将成熟的杂草果实(较大的杂草果实切成长1 cm的小
块)投入固定液中, 固定液配方为多聚甲醛:冰醋酸:
70%乙醇:甘油=5:5:50:40(体积比)。

1.3.2 前处理
将固定的杂草果实用清水洗涤3次后, 放入50°C温水
中浸泡4小时, 之后分别转入装有10%、15%和20%
甘油(3个浓度处理)的小瓶中浸泡。材料转入甘油中
后, 将其置于玻璃真空干燥器内, 使用循环水式多用
真空泵抽气40分钟, 使材料空腔完全被甘油所填充,
然后取出材料置于培养箱中20°C放置3小时。

1.3.3 固定样品至冷台
将切片刀固定在切片机的刀槽上, 平放冷台, 并启动
冰冻切片机, 将冷冻箱温度降低至–25°C。在平放的
冷台上滴加胶水数滴, 将较大的杂草果实细切为长
0.2–0.3 cm, 较小的果实直接垂直置于冷台上, 然后
滴加胶水包埋材料, 使材料迅速冷冻并能够牢固地黏
附在冷台上。

1.3.4 冰冻切片
将黏附有组织材料的冷台固定于冷台固定槽上, 拧紧
固定螺钉, 旋转切片厚度调节旋钮, 将切片厚度调为
15 μm, 摇动旋转手轮进行切片。在切片的过程中,
如发现切片刀上的霜层较厚, 应及时启动除霜程序去
除霜层(也可用毛刷刷掉), 以防卷片。

1.3.5 展片
用毛笔将切下的切片转移至载玻片上, 或者直接将载
玻片以合适的角度靠近切片刀。在快速切片过程中,
使切片直接以一定的速度飞向载玻片并展开在载玻
片上, 后者往往更为简便。

1.3.6 对染
载玻片上的材料用质量分数为1%的番红水溶液染色
20分钟, 然后用蒸馏水洗涤3–5次, 再用质量分数为
0.1%的固绿染色30秒, 用质量分数为95%的乙醇冲
洗固绿至材料不褪色为止, 之后滴加质量分数为50%
的甘油于材料表面, 盖上盖玻片。


表1 切片所用的杂草果实
Table 1 Weed fruits selected for sectioning
Species name Family Appendage Fruit type
Rumex dentatus Polygonaceae Perianth Achene
Achyranthes bidentata Amaranthaceae Perianth Ultricle
Medicago polymorpha Leguminosae Spine Legume
Torilis scabra Umbelliferae None Cremocarp
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图1 4种杂草果实的横切面
(A) 齿果酸模果实的横切面(Bar=400 μm); (B) 牛膝果实的横切面(Bar=400 μm); (C) 南苜蓿果实的横切面(Bar=200 μm); (D) 窃衣
果实的横切面(Bar=400 μm); (E) 齿果酸模果实的横切面(Bar=40 μm); (F) 南苜蓿果实的横切面(Bar=40 μm)

Figure 1 Cross sections of fruits of four weed species
(A) Cross section of Rumex dentatus fruit (Bar=400 μm); (B) Cross section of Achyranthes bidentata fruit (Bar=400 μm); (C)
Cross section of Medicago polymorpha fruit (Bar=200 μm); (D) Cross section of Torilis scabra fruit (Bar=400 μm); (E) Cross
section of Rumex dentatus fruit (Bar=40 μm); (F) Cross section of Medicago polymorpha fruit (Bar=40 μm)


1.3.7 观察并拍照
使用Zeiss数码显微镜观察切片并拍照。
2 结果与讨论
本研究首次使用冰冻切片方法直观地揭示了杂草果
实适应漂浮的显微结构, 是该方法在杂草果实形态结
构研究中的成功尝试。本研究所用的4种杂草果实利
用冰冻切片技术均获得了清晰的图片(图1A–F)。结合
其它杂草果实的冰冻切片研究结果(另文发表)发现,
木质化程度高或低及组织质地差异不大的杂草果实,
应用冰冻切片方法基本上均能够得到完整的切片。但
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有些杂草果实(如禾本科杂草果实)切片的部分结构容
易破碎, 很难获得完整的切片, 可能是由于这些杂草
果实不同结构的组织质地差异较大。种皮以内大部分
是胚乳, 胚乳细胞排列疏松, 内含大量淀粉, 切片时
很容易破碎。要获得这类杂草果实完整结构的切片,
还需要改进相关的操作, 可以尝试先将材料用硫酸或
氢氟酸等适当软化处理后再放入固定液中进行固定。
本文所研究的4种杂草果实均具有发达的果皮组
织。其果皮组织由坚硬且高度木质化的细胞或薄壁组
织细胞组成; 并且这些细胞均是死细胞, 仅剩下细胞
壁(图1A–F)。发达且高度木质化的果皮是这类杂草果
实适应漂浮的结构。
冰冻切片技术的关键是对不同硬度的材料使用
不同的甘油浓度及选用合适的冷台与冷刀温度及展
片技术(贺新强等, 1999; 林月惠等, 2001; 陈丹和赵
洁, 2005; 刘剑锋等, 2006a, 2006b)。其中, 甘油的
浓度选择十分重要, 材料的硬度不同甘油浓度也应不
同(林月惠等, 2001)。我们在研究过程中发现, 甘油浓
度为10%时, 材料的组织和细胞常易破损; 甘油浓度
为20%时, 材料的冻结效果不好, 切片困难; 用15%
甘油前处理杂草果实, 则能够得到完整的切片。本文
的研究结果表明, 15%甘油比较适合于杂草果实这类
质地较硬的材料。此外, 需对材料进行脱气处理, 以
去除组织中的气泡。我们使用胶水包埋材料, 目的是
为了防止材料在对染时被蒸馏水和95%的乙醇冲洗
掉。总之, 冰冻切片是进行杂草果实制片有效且简便
的方法。
参考文献
陈丹, 赵洁 (2005). 适合于植物花器官的冰冻切片技术. 武汉
植物学研究 23, 285–290.
贺新强, 李素文, 胡玉熹, 林金星 (1999). 毛竹细胞壁自发荧
光的显微荧光分光光度分析. 植物学报 41, 711–714.
焦石, 段玉玺, 孙华, 陈立杰 (2009). 大豆根部冰冻切片最佳
方法试验. 湖北农业科学 48, 806–808.
李儒海, 强胜 (2007). 杂草种子传播研究进展. 生态学报 27,
5361–5370.
林月惠, 李寒冰, 贺新强 (2001). 高度木质化材料的冰冻切
片技术. 植物学通报 18, 118–120.
刘剑锋, 程云清, 阎秀峰, 周革, 王淑范 (2006a). 植物冰冻
切片技术的改进 . 南京林业大学学报 (自然科学版 ) 30,
128–130.
刘剑锋, 阎秀峰, 程云清, 李霞 (2006b). 冰冻切片技术在高
山红景天细胞学研究中的应用 . 东北林业大学学报 34,
110–110, 119–119.
陆叶, 席梦利, 郑佳, 施季森 (2009). 杨树和杉木茎段组织的
冰冻切片技术研究. 南京林业大学学报(自然科学版) 33,
44–48.
宁代锋, 尹增芳, 张菁, 孙海燕 (2008). 一种简单快速植物组
织冰冻切片方法. 热带亚热带植物学报 16, 386–389.
张新成, 李志刚, 李素丽, 林丽, 杨丽涛, 李杨瑞 (2008). 冰
冻切片法在植物微管骨架研究中的应用 . 广西植物 28,
164–166.
Conley CA, Hanson MR (1994). Tissue-specific protein
expression in plant mitochondria. Plant Cell 6, 85–91.
Conley CA, Hanson MR (1997). Cryostat tissue printing: an
improved method for histochemical and immunocytoch-
emical localization in soft tissues. Biotechniques 22,
488–496.
Kouznetsova E, Klingner M, Sorger D, Sabri O,
Großmann U, Steinbach J, Scheunemann M, Schliebs
R (2006). Developmental and amyloid plaque-related
changes in cerebral cortical capillaries in transgenic
Tg2576 Alzheimer mice. Int J Dev Neurosci 24, 187–193.
Laube U, Kiderlen AF (1998). Detection of parasites with
DNA-binding bisbenzimide H33258 in Pneumocystis
carinii- and Leishmania-containing materials. Parasitol
Res 84, 559–564.
Makarenko IG, Meguid MM, Gatto L, Chen C, Ugrumov
MV (2003). Decreased NPY innervation of the hypotha-
lamic nuclei in rats with cancer anorexia. Brain Res 961,
100–108.
Newton SS, Dow A, Terwilliger R, Duman R (2002). A
simplified method for combined immunohistochemistry
and in-situ hybridization in fresh-frozen, cryocut mouse
brain sections. Brain Res Protoc 9, 214–219.
Patro N, Shrivastava M, Tripathi S, Patro IK (2009).
S100β upregulation: a possible mechanism of deltame-
thrin toxicity and motor coordination deficits. Neurotoxicol
Teratol 31, 169–176.

李儒海等: 杂草果实的冰冻切片技术 743
Application of Cryo-sectioning Technique in Weed Fruits
Ruhai Li1, 2, 3, Sheng Qiang1*
1Weed Research Laboratory, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2Institute of Plant Protection and Soil
Science, Hubei Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430064, China; 3Hubei Key Laboratory for Crop Diseases,
Insect Pests and Weeds Control, Wuhan 430064, China
Abstract A fast, simple and effective technique for weed fruit cryo-sectioning is introduced. Highly lignified fruits of 4
weed species that can float on water were selected to be dissected by a cryo-sectioning technique so that the internal
structure adaptive to floating could be clearly observed. The method includes six steps: material fixation, pre-treatment,
fixing to cold stage, cryo-sectioning, section flattening, stain and observation and photography. The successful application
of cryo-sectioning technique to weed fruit anatomy demonstrated its advantage without a long process of softening, de-
hydration and embedding. The crucial steps of the technique are to select a proper concentration of glycerin, a suitable
temperature of freezing and an appropriate way of section flattening. In this study, the better micrographs could be ob-
tained when the weed fruits were pretreated with 15% glycerin.
Key words cryo-sectioning, microstructure, weed fruits
Li RH, Qiang S (2010). Application of cryo-sectioning technique in weed fruits. Chin Bull Bot 45, 739–743.
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* Author for correspondence. E-mail: wrl@njau.edu.cn
(责任编辑: 孙冬花)