全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2011, 46 (2): 189–196, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2011.00189
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收稿日期: 2010-07-16; 接受日期: 2011-02-16
基金项目: 国家自然科学基金(No.30671714, No.31071823)、国家林业局林业公益性行业科研专项(No.200904050)和中国科学院方向性
项目(No.KSCX2-YW-N-043)
* 通讯作者。E-mail: silandai@gmail.com
一种快速有效分析烟草花冠中花青素苷的方法
孙翊1, 李慧2, 3, 王亮生2, 戴思兰1*
1北京林业大学园林学院, 国家花卉工程技术研究中心, 北京 100083; 2中国科学院植物研究所北京植物园, 北京 100093
3中国科学院研究生院, 北京 100049
摘要 花青素苷(anthocyanins)成分和含量的分析是花色研究的重要内容之一。该文利用高效液相色谱-电喷雾离子化-质谱
技术(HPLC-ESI-MS), 建立了一种快速有效地分析烟草(Nicotiana tabacum)花冠中花青素苷成分及含量的方法。在保证良
好分离效果的基础上, 将分析时间缩短至15分钟, 大大提高了分析速度, 降低了成本, 并成功应用于转基因烟草花冠中花
青素苷成分的分析。为不具备高效分析仪器(如超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS))的一般实验室研究花青素苷合成
相关基因在烟草中的异源表达提供了一种有效且实用的分析方法。
关键词 分析方法, 花青素苷, 高效液相色谱-电喷雾离子化-质谱技术, 烟草
孙翊, 李慧, 王亮生, 戴思兰 (2011). 一种快速有效分析烟草花冠中花青素苷的方法. 植物学报 46, 189–196.
花青素苷(anthocyanins)是植物花色形成的重要
物质基础, 因此对花青素苷成分和含量进行分析是花
色研究的重要内容之一(黄金霞等 , 2006; 胡可等 ,
2010)。目前, 花色相关的异源基因在植物中的表达
研究常常以烟草(Nicotiana tabacum)作为受体材料
(Nakatsuka et al., 2008; 韩科厅等, 2008; 夏玉凤
等, 2010)。当前使用的烟草花冠中花青素苷成分分析
的方法主要有薄层层析技术(thin layer chromato-
graphy, TLC)(Shimada et al., 1999; Okinaka et al.,
2003)、高效液相色谱 -光电二极管阵列检测技术
(high-performance liquid chromatography with a
photodiode array detector, HPLC-PAD/DAD)(Na-
katsuka et al., 2005)和高效液相色谱-电喷雾离子化-
质谱联用分析技术 (HPLC-electrospray ionization-
mass spectrometry, HPLC-ESI-MS)(Nakatsuka et
al., 2008)。
早期应用较多的是TLC技术, 该方法通过与已知
的花青素苷元(anthocyanidins)标样的迁移率进行对
比, 可对样品中含有的花青素苷元的种类进行初步
定性研究, 但结构鉴定的准确性较差, 也不能进行
精确的定量分析。后来多采用的是HPLC-PAD/DAD
技术, 该技术根据与已知的花青素苷元标准品进行
洗脱速度和峰面积的对比, 可推测花青素苷元的结
构, 同时进行定量研究, 但是该方法也不能直接确
定花青素苷的种类。最近几年开始采用HPLC-
ESI-MS技术, 利用该方法可以直接对花青素苷的提
取液进行定性和定量分析, 根据二级(或多级)质谱的
结果既可确定其花青素苷元的类型, 也可推测其糖
苷化、酰基化和甲氧基化等情况, 至今已经在许多物
种, 如荷花(Nelumbo nucifera)(Yang et al., 2009)、
牡丹 (Paeonia suffruticosa)(Li et al., 2009)和菊
花 (Chrysanthemum×morifolium Ramat.)(孙卫等 ,
2010)中得到了较好应用。
Nakatsuka等 (2008)使用HPLC-ESI-MS技术对
烟草花冠中的花青素苷成分进行分析, 取得了较好的
分析效果, 但是其HPLC分析时间相对较长, 大约需
要30分钟。本研究在改善原有分离效果的基础上, 建
立了一种更加快速、有效地分析烟草花冠中花青素苷
成分和含量的方法。本方法同样以HPLC-ESI-MS技
术为基础, 但将HPLC的分析时间由32分钟缩短至15
分钟, 并取得了很好的分离效果, 大大加快了分析速
度。这一方法的建立, 为烟草花冠中花青素苷成分分
析和转基因烟草中花色相关基因功能的解析提供了
一种快速、有效且实用的分析方法。
·技术方法·
190 植物学报 46(2) 2011
1 材料与方法
1.1 植物材料
烟草(Nicotiana tabacum ‘NC89’)盛开期(花冠筒先端
已完全张开, 约为90°, 且下部完全呈白色, 长度为
45–55 mm)花冠着色部分。
1.2 花青素苷的提取
采集烟草的新鲜花朵, 称取花冠着色部分样品250
mg, 迅速直接处理, 或经液氮速冻后保存于–80°C的
超低温冰箱中备用。将样品用液氮研磨成粉末, 并用
1 mL提取液(0.1%盐酸-甲醇, v/v)于4°C避光浸提24
小时 , 每隔8小时振摇1次 , 吸取上层清液 , 置于
–40°C以下的冰箱中保存备用或直接用于下一步
分析。
1.3 花青素苷成分的HPLC分析
将花青素苷提取液(上层清液)经0.22 μm微孔滤膜过
滤后用于HPLC分析。HPLC-DAD分析采用戴安公司
(Dionex, Sunnyvale, CA)生产的高效液相色谱系统
进行 , 该系统装备有PDA-100二极管阵列检测器
(PDA-100 photodiode array detector)、 P680 A
LPG-4型二元梯度泵、 UltiMate公司生产的3000型自
动进样器(UltiMate 3000 autosampler)、TCC-100色
谱柱控温箱以及色谱工作站(变色龙数据处理软件,
Chameleon 6.60)。色谱柱为日本Tosoh公司生产的
反相C18柱(型号, ODS-80Ts QA; 柱长×内径, 150
mm×4.6 mm, 固定相粒度为5 μm; 生产厂商Tosoh,
Tokyo, Japan), 之前连接有C18保护柱 (C18 guard
cartridge, Shanghai ANPEL Scientific Instrument,
Shanghai, China)。柱温35°C, 进样体积10 μL, 流速
0.8 mL·min–1。设置不同的HPLC洗脱条件(表1)以筛
选最佳分析效果, 其流动相和梯度洗脱程序详见表1。
检测波长为525 nm。
采用与已知浓度的花青素苷标准品, 如锦葵素
-3, 5-O-二葡萄糖苷 (malvidin-3, 5-di-O-glucoside,
Mv3G5G, Extrasynthese, France)进行对比分析的
方法对样品中所含的花青素苷进行定量分析。HPLC
分析采用上述方法。根据HPLC分析结果 , 对
Mv3G5G进行线性回归分析, 获得标准品浓度与其峰
面积之间的标准曲线。依据待测样品HPLC分析图中
获得的峰面积计算待测样品中花青素苷的浓度, 进而
计算每克新鲜植物材料中花青素苷的含量 (μg·g–1
FW)。每个单株重复3次。
1.4 花青素苷成分的HPLC-ESI-MS鉴定
使用安捷伦公司1100 HPLC-ESI-MSn系统对花青素
苷成分进行定性分析(Agilent-1100 HPLC system,
Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)。质谱分
析条件: 电喷雾电离, 正离子模式; 干燥气(N2)温度
350°C; 气体流速为8 L·min–1; 雾化压力35 psi; HV
电压为4 kV; 八级杆射频幅度150 Vpp; 一级锥孔电
压为47.7 V(skim 1 voltage, 47.7 V); 二级锥孔电压
为6.0 V(skim 2 voltage, 6.0 V); 毛细管出口电压为


表1 烟草花冠中花青素苷分析的HPLC洗脱条件
Table 1 The analysis of anthocyanins in tobacco corolla by different HPLC elution conditions
Number Mobile phase A Mobile phase B Gradient elution program Time (min)
1 Trifluoroacetic acid, formic acid
and water
(0.1:10:89.9, v/v/v)
Acetonitrile and methanol
(85:15, v/v)
0 min, 5%B; 30 min, 12%B;
40 min, 25%B; 50 min, 30%
B; 60 min, 5%B
60
2 Trifluoroacetic acid, formic acid
and water
(0.1:10:89.9, v/v/v)
Acetonitrile and methanol
(85:15, v/v)
0 min, 10%B; 20 min, 30%B;
25 min, 10%B
25
3 Formic acid and water
(1:9, v/v)
Acetonitrile and methanol
(85:15, v/v)
0 min, 10%B; 20 min, 30%B;
25 min, 10%B
25
4 Formic acid and water
(1:9, v/v)
Acetonitrile and methanol
(85:15, v/v)
0 min, 10%B; 10 min, 20%B;
12 min, 50%B; 14 min, 10%
B; 15 min, 10%B
15

孙翊等: 一种快速有效分析烟草花冠中花青素苷的方法 191
127.3 V; 保护盖出口电压为79.6 V (cap exit offset,
79.6 V); 全扫描质量范围 (m/z)为0–1 200。使用
LC/MSD Trap5.2软件分析质谱结果。
2 结果与讨论
2.1 花青素苷成分的HPLC分析
烟草花冠中花青素苷提取液的HPLC分析结果见图1。
从图1可以看出, 本实验中采用的不同洗脱条件下的
HPLC分析方法均可有效分离样品中的花青素苷。其
中, 洗脱条件1能够很好地将烟草花冠中花青素苷的
成分进行分离, 但是其出峰时间主要集中在30分钟
之前。因此, 尝试对其进行优化, 以期缩短分析时间。
洗脱条件2采用了与洗脱条件1相同的流动相, 但调
整了洗脱程序, 结果在取得与洗脱条件1相同分离效
果的基础上, 将分析时间缩短为25分钟。洗脱条件3
与洗脱条件2的梯度洗脱程序完全相同, 仅流动相有
差别, 但洗脱条件3的出峰时间与前两者相比更早,
说明洗脱条件3采用的流动相效果更好。而洗脱条件4
在保留了洗脱条件3流动相的基础上, 再次对洗脱程
序进行了改进, 进一步将洗脱时间缩短至15分钟。与
所需要时间最长的洗脱条件1相比, 洗脱条件4的分
离效果并没有变差, 但是其所需分析时间最短, 是本
实验中获得的最佳洗脱条件。
矢车菊素 -3-O-芸香糖苷 (cyanidin-3-O-rutin-
oside, Cy3R)是烟草花冠中积累的主要花青素苷, 其
占总花青素苷含量的比例大于90%(Aharoni et al.,
2001), 据此初步推测主峰(图1A–D)可能是Cy3R, 但
尚需进一步的质谱分析加以验证。
2.2 花青素苷成分的结构鉴定
将样品经过多级质谱分析, 得到主峰化合物的分子离
子m/z 595 ([M+H]+)、碎片离子m/z 448.9 ([M+H-
146]+)和矢车菊素苷元特征碎片离子m/z 286.9 ([Y0]+)


图1 烟草花冠中花青素苷成分的HPLC分析
(A)–(D)显示的是不同洗脱条件下获得的结果。(A) 洗脱条件1; (B) 洗脱条件2; (C) 洗脱条件3; (D) 洗脱条件4

Figure 1 The absorbance profiles of anthocyanins in tobacco flowers analyzed by HPLC
(A)–(D) show results of different elution programs. (A) Elution program 1; (B) Elution program 2; (C) Elution program 3; (D) Elu-
tion program 4
192 植物学报 46(2) 2011





图3 花青素苷标准品Mv3G5G浓度与其峰面积的标准曲线

Figure 3 The standard curve obtained by concentrations
and peak areas of anthocyanin standard substance Mv3G5G



(图2), 从而推定此化合物为Cy3R。本实验获得的烟
草花冠中花青素苷成分的结构与前人的研究结果一
致(Aharoni et al., 2001; Dueñas et al., 2008; Naka-
tsuka et al., 2008; Fischer et al., 2011), 说明本方法
能够快速有效地对烟草花冠中的花青素苷成分进行
结构鉴定(图2)。
2.3 花青素苷的定量分析
建立不同浓度的标准品Mv3G5G(y)与其经HPLC分
析获得的峰面积(x)的标准曲线(图3), 获得线性回归
方程y=0.002x, R2=0.999。根据13个野生型烟草植株
(分别用WT1–13表示)花冠中花青素苷提取液HPLC
分析得到的峰面积, 经过计算得出烟草花冠中Cy3R
的平均含量为690±103 μg·g–1FW(图4)。
2.4 转基因烟草花冠中花青素苷成分的分析
采用洗脱条件4对8株经Southern blot检测为单拷贝
的转瓜叶菊F3′5′H同源基因(GenBank accession:
AY791885)的烟草T1代植株(分别用TG1–8表示)花冠
中花青素苷成分进行HPLC分析。结果显示, 在转基
因烟草花冠的色素提取液中均含有新生成的花青素
苷(图5)。经质谱鉴定, 得到新生成化合物的分子离子
m/z 611([M+H]+)和飞燕草素苷元特征碎片离子m/z
302.9([Y0]+)(图6), 从而推定此化合物为飞燕草素衍
生物。对转基因烟草花冠中花青素苷的定量分析结果


图2 烟草花冠中主要花青素
苷的质谱结果
m/z: 质荷比

Figure 2 The mass spec-
trum of main anthocyanin in
tobacco corolla
m/z: Mass to charge ratio

图4 不同烟草植株花冠中花
青素苷Cy3R的含量
WT1–WT13分别代表不同的
野生型烟草植株。

Figure 4 Contents of an-
thocyanin Cy3R in tobacco
flower corollas analyzed by
HPLC
WT1–WT13 stand for single
individuals of wild type to-
baccos, respectively.
孙翊等: 一种快速有效分析烟草花冠中花青素苷的方法 193
显示, 转基因烟草中新生成的飞燕草素衍生物的平均
含量为83±53 μg·g–1FW(图7); 此外还发现Cy3R的平
均含量为830±107 μg·g–1FW。对比2.3节中的结果可
以看出, 转基因烟草中Cy3R的平均含量比非转基因
烟草增加了约220 μg·g–1FW。
2.5 讨论
目前已经被广泛使用的烟草花冠中花青素苷的分析
方法, 如TLC分析方法(Shimada et al., 1999; Oki-
naka et al., 2003; Nakatsuka et al., 2005)和HPLC-
PAD/DAD分析方法(Nakatsuka et al., 2005, 2006;
Nishihara et al., 2005), 需要先将提取的花青素苷水
解转化成花青素苷元再进行分析。上述2类方法最大
的局限性在于只能够鉴定到花青素苷元的类型, 而不
能对花青素苷的种类进行结构鉴定; 此外, 还破坏了
花青素苷的天然存在形式, 无法全面有效地研究花青
素苷的结构和功能。同时, 这2类方法均需要先从专
业的化学试剂公司购得标准品进行洗脱速度的比较
才能推测花青素苷元的结构。因此, 目前在烟草中使
用的花青素苷TLC分析法和HPLC-PAD/DAD分析法
操作复杂且所需成本高。
HPLC-ESI-MS分析方法比上述2类方法准确性
高、成本低且操作简单。目前, 基于此技术已经建立
了一种新的烟草花冠中花青素苷的分析方法, 但是其
分析时间较长(Nakatsuka et al., 2008)。本文参考前
人的方法(Nakatsuka et al., 2008; Li et al., 2009)并
对花青素苷的提取及HPLC-ESI-MS分析方法进行了
改进, 改进后的方法能够快速、便捷地提取和分析花



图5 转瓜叶菊F3′5′H同源基因的烟草花冠中花青素苷成分的
HPLC分析
(A) 转瓜叶菊F3′5′H同源基因的烟草TG1植株的分析结果; (B)
转瓜叶菊F3′5′H同源基因的烟草TG2植株的分析结果

Figure 5 The absorbance profiles of anthocyanins from
cineraria F3′5′H homologous gene transgenic tobacco flower
corollas analyzed by HPLC
(A) Result of cineraria F3′5′H homologous gene transgenic
plant TG1; (B) Result of cineraria F3′5′H homologous gene
transgenic plant TG2



图6 转瓜叶菊F3′5′H同
源基因的烟草花冠中新生
成花青素苷的质谱结果
m/z同图2。

Figure 6 The mass sp-
ectrum of the novel peak
in cineraria F3′5′H homo-
logous gene transgenic
tobacco corolla
m/z see Figure 2.
194 植物学报 46(2) 2011


图7 转瓜叶菊F3′5′H同源基因的不同烟草植株花冠中花青素苷的含量
TG1–TG8分别代表转瓜叶菊F3′5′H同源基因的不同烟草植株。

Figure 7 Contents of anthocyanin from cineraria F3′5′H homologous gene different transgenic tobacco flower corollas analyzed
by HPLC
TG1–TG8 stand for single individuals of cineraria F3′5′H homologous gene different transgenic tobaccos, respectively.


青素苷, 结合质谱分析结果还可以准确地鉴定花青素
苷的结构。
Nakatsuka等 (2008)建立的HPLC-ESI-MS分析
方法中HPLC分析时间为32分钟, 且并未明确给出流
动相的组成。本实验所用改进的方法, 在保证分离效
果的前提下, 将分析一个样品的时间缩短至15分钟,
将HPLC所需的洗脱时间缩短了1倍左右, 且该方法
也适用于进一步的质谱鉴定分析。与Nakatsuka等
(2008)的方法相比, 本方法更为经济、有效和便捷。
花色作为重要的生物学性状和观赏性状, 一直备
受研究者的关注。近年来, 利用分子生物学手段, 研
究者通过对花青素苷的生物合成途径进行调控, 培育
出了许多具有新异花色的花卉新品种(Tanaka et al.,
2009), 如矮牵牛(Petunia hybrida)、香石竹(Dianthus
caryophyllus)和月季 (Rosa spp.)(Tanaka et al.,
2008)。花色分子育种技术的有效开展依赖于对花色
相关基因功能的解析。由于烟草的遗传转化体系相对
成熟, 因而其已经成为研究外源基因在植物体内异源
表达的重要受体物种之一(Aharoni et al., 2001; Na-
katsuka et al., 2008)。目前, 许多研究表明, 花青素
苷合成相关基因在烟草中异源表达可以为花青素合
成调控机理的研究提供重要的参考资料(Shimada et
al., 1999; Martens et al., 2002; Okinaka et al., 2003;
Nakatsuka et al., 2008)。本研究方法的建立, 为不具
备高效分析仪器, 如超高效液相色谱-串联质谱(ultra
performance liquid chromatography-mass spec-
trometry/mass spectrometry, UPLC-MS/MS)的一般
实验室研究花青素苷合成相关基因在烟草中的异源
表达提供了一种有效且实用的分析方法。
3 结论
本实验的液相色谱系统中采用的色谱柱为ODS-80Ts
QA的C18柱, 并用C18保护柱对其进行保护。在此分析
条件下, 获得的最佳HPLC洗脱条件为条件4, 即流动
相 : A液为甲酸和水 (1:9, v/v), B液为乙腈和甲醇
(85:15, v/v)。梯度洗脱程序如下: 0分钟, 10%B; 10分
钟, 20%B; 12分钟, 50%B; 14分钟, 10%B; 15分钟,
10%B。检测波长为525 nm。分析时间为15分钟。此
洗脱条件既保证了良好的分离效果, 又极大地加快了
分析速度, 降低了成本。利用此方法已成功地对转瓜
叶菊F3′5′H同源基因的烟草植株花冠中的花青素苷
成分进行了鉴定和定量分析, 鉴定出了新生成化合物
的种类和含量, 表明其能够为花青素苷合成相关基因
在烟草中的异源表达研究提供一种有效的色素分析
方法。
孙翊等: 一种快速有效分析烟草花冠中花青素苷的方法 195
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196 植物学报 46(2) 2011
Rapid, Effective Method for Anthocyanin Analysis in
Tobacco Corolla
Yi Sun1, Hui Li2, 3, Liangsheng Wang2, Silan Dai1*
1College of Landscape Architecture, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China; 2Beijing Botanical Garden, Institute of
Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093, China; 3Graduate University of Chinese Academy of
Sciences, Beijing 100049, China
Abstract The analysis of anthocyanins is an important task for studies of flower coloration. This paper describes a rapid,
effective method for analysis of anthocyanin composition and content in tobacco corolla based on high-performance liquid
chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry. HPLC analysis time was shortened to 15 min by this method,
and the separation effect was guaranteed. The analysis speed is largely improved, and costs are reduced. The analysis of
anthocyanins in transgenic tobacco was successful with this method, so it can be used in a general laboratory, even
without advanced instruments such as ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry.
This method offers a practical approach to studies of heterologous expression of anthocyanin biosynthesis path-
way-related genes in tobacco.
Key words analysis method, anthocyanin, HPLC-ESI-MS, Nicotiana tabacum
Sun Y, Li H, Wang LS, Dai SL (2011). Rapid, effective method for anthocyanin analysis in tobacco corolla. Chin Bull Bot
46, 189–196.
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* Author for correspondence. E-mail: silandai@gmail.com
(责任编辑: 孙冬花)