全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2010, 45 (5): 541–547, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3969/j.issn.1674-3466.2010.05.003

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收稿日期: 2009-10-23; 接受日期: 2010-01-05
基金项目: 国家自然科学基金(No.30670174)和国家“十一五”科技支撑计划(No.2006BAD04B08)
* 通讯作者。E-mail: zhongxl@ieda.org.cn
磷脂酶Dδ参与植物的低温驯化过程
王涛1, 2, 梅旭荣1, 钟秀丽1*, 李玉中1, 曾正兵1, 王海燕1, 孙磊1, 夏旭1
1中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所, 农业部旱作节水农业重点开放实验室, 北京 100081
2云南瑞升烟草技术(集团)有限公司, 昆明 650106
摘要 对经低温驯化和未经低温驯化的磷脂酶Dδ (PLDδ)基因敲除突变体与野生型植株进行冻害胁迫处理后, 比较2种基
因型植株的抗冻性。结果发现, 经低温驯化的PLDδ敲除突变体的抗冻性明显低于野生型, 而未经低温驯化的PLDδ敲除突
变体与野生型的抗冻性没有显著差异, 表明PLDδ参与植物的低温驯化过程。对PLDδ的作用途径进行分析, 发现PLDδ在低
温驯化过程中不参与抗氧化酶活性的调节, 对脯氨酸和可溶性糖的积累起负调节作用, 但是参与低温信号转导物质ABA诱
导抗冻性的过程。
关键词 低温驯化, 磷脂酶Dδ, 信号转导
王涛, 梅旭荣, 钟秀丽, 李玉中, 曾正兵, 王海燕, 孙磊, 夏旭 (2010). 磷脂酶Dδ参与植物的低温驯化过程. 植物学报 45,
541–547.
磷脂酶Ds(phospholipase Ds, PLDs)是在植物中
广泛分布的酶类。它们能够水解磷脂产生磷脂酸
(phosphatidic acid, PA)和1个自由头基。在拟南芥
(Arabidopsis thaliana)中已经确认了12个PLD基因,
即PLDα(3)、β(2)、γ(3)、δ、ε和PLDζ(2)(Qin et al.,
2002)。根据生物化学性质和域结构的不同 , 这些
PLDs可以分为2个亚类: C2-PLDs和PH/PX-PLDs。
C2-PLDs包括PLDαs、βs、γ、δ和PLDε。这类PLDs
都含有一个Ca2+-依赖的磷脂结合域, 它们的激活都
需要Ca2+。而PH/PX-PLDs包括PLDζ1和PLDζ2。这
类PLDs不含有C2域, 但是都有1个phox homology
(PX)域和1个plecktrin homology (PH)域(Qin et al.,
2002)。PLDδ在衰老叶片以及脱水、高盐等环境胁迫
下有高的表达量(Katagiri et al., 2001)。它的激活除了
需要Ca2+外, 还需要油酸(Wang and Wang, 2001),
激活后优先水解的底物磷脂是磷脂酰乙醇胺
(phosphatidylethanolamine, PE)(Qin et al., 2002)。
近年来, 人们通过对PLDδ基因进行遗传操作获
得了突变体。利用这些突变体开展的研究揭示出
PLDδ参与水分胁迫、氧化胁迫和冰冻伤害等多种反
应过程。Katagiri等(2001)发现PLDδ及其产物PA参与
脱水胁迫的信号转导。Zhang等(2003)发现, PLDδ与
其产物PA降低拟南芥中H2O2诱导的细胞程序化死
亡, PLDδ基因敲除植株对胁迫更为敏感。Li等(2004)
发现PLDδ基因被敲除的拟南芥抗冻性下降, 而PLDδ
超表达的拟南芥抗冻性则增强, 表明PLDδ对植物的
抗冻性起正调节作用; 此外, 研究还揭示出PLDδ在
植物受胁迫后恢复过程中的重要作用。胁迫后恢复阶
段涉及大量的细胞骨架重组和膜运输过程, PLDδ与
微管骨架结合(Gardiner et al., 2001), 它的激活是启
动细胞骨架重组的关键步骤 (Dhonukshe et al.,
2003)。Li等(2008)还发现在冻害后的恢复阶段, PLDδ
的激活减缓了质体与非质体中脂质的大量降解, 从而
提高了植物的抗冻性。
冻害是主要的环境胁迫因素之一。冻害限制植物
的地理分布和生长季节并导致大量的产量损失
(Boyer, 1982)。许多热带和亚热带植物都不能够抵抗
冻害。而大部分温带植物经过低温驯化后能够获得不
同程度的抗冻性。拟南芥在4°C下驯化2天后, 抗冻性
(LT50)从 –5.5°C提高到 –12.6°C(Xin and Browse,
1998)。低温驯化是植物感受、传递低温信号, 引起
低温适应性反应从而提高抗冻性的过程。低温驯化过
·研究报告·
542 植物学报 45(5) 2010
程中植物体内发生许多生理与生化变化。如渗透调节
物质大量积累, 细胞渗透势降低, 以防止冻害胁迫下
胞间结冰引起胞内失水从而对原生质造成脱水胁迫
(Larsson et al., 1992; Koster and Lynch, 1992)。抗
氧化酶活性增强, 抗氧化物质含量增加, 以清除活性
氧对生物膜系统的氧化胁迫, 增强细胞膜的稳定性
(王以柔等, 1995; 许楠和孙广玉, 2009)。内源脱落酸
(abscisic acid, ABA)水平增加, 参与植物的低温信号
转导过程(Lang et al., 1994; 吴耀荣和谢旗, 2006)。
细胞膜脂质组成发生变化, 脂肪酸不饱和度上升, 磷
脂含量增加(Webb et al., 1994; Uemura et al., 1995;
Welti et al., 2002); 这种变化有助于减缓细胞膜在冻
害胁迫下发生非双层相变, 保护膜的完整性, 从而提
高植物的抗冻性(Uemura and Steponkus, 1999)。
低温驯化过程还包含复杂的基因表达变化(Guy
et al., 1985; 李慧和强胜, 2007)。但是, 一些基因虽
然受低温诱导, 但是却与抗冻性没有关系, 如在拟南
芥中醇脱氢酶、苯丙氨酸解氨酶 (phenylalanine
ammonialyase, PAL)和查耳酮合酶(chalcone syn-
thase, CHS)基因的转录被低温强烈诱导, 但是这些
基因的突变体能够与野生型一样完成低温驯化
(Jarillo et al., 1991; Leyva et al., 1995)。这说明受低
温诱导的基因不一定参与低温驯化。因此, 鉴定参与
低温驯化的基因, 对揭示植物低温驯化过程的机理,
探讨提高植物抗冻性的途径有重要意义。本研究证实
PLDδ是参与植物低温驯化过程的基因, 并从抗氧化
酶活性调节、渗透调节和ABA信号转导过程等角度探
讨了PLDδ基因参与低温驯化过程的途径。
1 材料与方法
1.1 实验材料
实验材料为哥伦比亚生态型的拟南芥(Arabidopsis
thaliana L.)野生型和PLDδ基因敲除的纯合突变体(美
国密苏里大学生物系王学敏教授馈赠)。将拟南芥种
子播于MS培养基中, 在4°C条件下春化处理2天后,
放于光照培养箱中正常培养。生长条件: 温度23°C
/19°C(白天/黑夜), 光照时间14小时/天, 光照强度80
μmol·m–2·s–1, 相对湿度为80%/65%(白天/黑夜)。培
养11天左右, 在拟南芥4–5叶期时, 移栽到草炭蛭石
中培养至实验取材。
1.2 方法
1.2.1 低温驯化与冻害胁迫处理
将培养24天的拟南芥植株放于生长箱中进行低温驯
化。驯化条件: 温度4°C, 光照强度30 μmol·m–2·s–1,
培养3天。利用人工霜箱 (日本ESPEC公司生产 ,
PU-4K型)进行冻害胁迫处理。将箱内温度从室温迅速
降至4°C, 再以3°C/小时的速率降至–2°C, 保持2小
时。在–2°C时喷适量水, 以防出现过冷却状态。之后
以2°C /小时的速率降至–16°C, 分别于–6°C、–8°C、
–10°C、–12°C和–14°C取出植株, 在4°C下解冻12小
时后, 放在正常条件下培养, 调查存活率2–3次, 并
于8–10天后照相记录。

1.2.2 离子渗漏率的测定
按照Welti等(2002)的方法测定离子渗漏率。在冻害胁
迫处理后, 将植株取出, 置于4°C下保存24小时。然
后, 取其叶片, 加入去离子水, 在23°C水浴中轻微振
荡1小时 , 测定初电导值。再将含有叶片的溶液在
100°C下煮沸10分钟, 冷却至23°C, 测定总电导值。
离子渗漏率＝初电导值/总电导值×100%。

1.2.3 ABA处理与抗冻性鉴定
ABA处理采用根施方法。对培养22天的拟南芥野生型与
突变体植株, 用30 μmol·L–1的ABA溶液浇透培养基质。
处理4天后鉴定植株的抗冻性: 将处理与对照植株置于
人工霜箱中, 快速降温至4°C(10分钟内从室温降至4°C),
再以3°C/小时的速率降温至–2°C(保持3小时, 并喷少量
的水防止出现过冷却状态)。然后以2°C/小时的速率降温
至–8°C、–10°C、–12°C、–14°C和–16°C, 并分别保持1
小时。将不同温度下处理后的植株取出, 置于4°C培养箱
中解冻24小时后, 测定处理和对照植株的离子渗漏率。之
后, 置于正常生长条件下培养, 10天后照相记录。

1.2.4 渗透调节物质的测定
脯氨酸含量的测定采用酸性水合茚三酮比色法(邹琦,
1995); 参考Li等(2004)的方法用蒽酮比色法测定可
溶性糖含量。

1.2.5 抗氧化酶活性的测定
超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化
王涛等: 磷脂酶 Dδ参与植物的低温驯化过程 543
物酶(POD)活性的测定分别采用氮蓝四唑法(李合生
等, 2003)、比色法(曾永三和王振中, 2004)和愈创木
酚法(张龙翔等, 1997)。
2 结果与讨论
2.1 PLDδ参与植物的低温驯化过程
在4°C下驯化3天后进行冻害胁迫处理, PLDδ基因敲
除植株的抗冻性明显低于野生型(图1A)。而未经低温
驯化的PLDδ基因敲除植株与野生型之间抗冻性没有
显著差异(图2)。PLDδ基因的缺失影响了拟南芥植株
的低温驯化, 表明PLDδ参与植物的低温驯化过程。
离子渗漏率是反映细胞膜稳定性的重要指标(逯明辉
等, 2004)。低温驯化后进行冻害胁迫处理, PLDδ基因


图1 低温驯化后拟南芥PLDδ基因敲除植株(PLDδ-KO)的抗冻
性较野生型(WT)下降
(A) 表型; (B) 离子渗漏率

Figure 1 The freezing tolerance of PLDδ-knockout plants of
Arabidopsis thaliana (PLDδ-KO) was decreased compared
with wild-type (WT) when subjected to freezing stress after
cold acclimation
(A) Phenotype; (B) Ion leakage

图2 未经低温驯化的拟南芥PLDδ基因敲除植株(PLDδ-KO)的
抗冻性与野生型(WT)差异不显著
(A) 表型; (B) 离子渗漏率; (C) 植株存活率

Figure 2 No significant difference in freezing tolerance was
detected between PLDδ-knockout (PLDδ-KO) and wild-type
(WT) plants of Arabidopsis thaliana when subjected to freez-
ing stress without cold acclimation
(A) Phenotype; (B) Ion leakage; (C) Survival rate


敲除植株与野生型之间离子渗漏率没有显著差异(图
1B), 因此推测PLDδ在低温驯化中可能不参与细胞
膜稳定性的调节。
2.2 PLDδ不参与低温驯化过程中抗氧化酶活性
的调节
经低温驯化后PLDδ敲除植株的SOD、CAT和POD 3
544 植物学报 45(5) 2010
种抗氧化酶的活性与野生型相比没有明显差异(图
3A–C), 表明PLDδ在低温驯化过程中没有参与抗氧
化系统的调节。膜保护酶的活性与细胞膜稳定性密切
相关, 逆境胁迫下抗氧化酶活性越高, 膜稳定性越好
(王国莉和郭振飞, 2003; 袁琳等, 2005; 贺文婷和郭
维明, 2006)。PLDδ不参与抗氧化酶活性的调节, 这
一结果支持PLDδ不参与膜稳定性调节的推测。生物



图3 低温驯化后拟南芥PLDδ敲除突变体(PLDδ-KO)的抗氧化
酶活性与野生型(WT)相比没有显著差异
(A) 超氧化物歧化酶; (B) 过氧化氢酶; (C) 过氧化物酶

Figure 3 No significant difference in the activity of anti-
oxidative enzymes was detected between PLDδ-knockout
(PLDδ-KO) and wild-type (WT) plants of Arabidopsis thaliana
after cold acclimation
(A) SOD; (B) CAT; (C) POD
膜的磷脂组成(Steponkus and Arvinte, 1987; Ue-
mura and Steponkus, 1999)和糖脂组成(Moellering
et al., 2010)是影响冻害胁迫下膜稳定性的重要因素。
然而, Li等(2004)对冻害胁迫处理后的拟南芥植株进
行脂质组分析, 结果发现PLDδ敲除植株中磷脂和糖
脂水解的产物PA水平与野生型中大体相同 , 表明
PLDδ不是冻害胁迫下导致膜脂组成变化的主要贡献
因子, 即PLDδ的激活对膜脂组成的变化影响不大。可
见, PLDδ虽然参与低温驯化过程, 但是不参与膜稳
定性的调节, 其在低温驯化过程中有特殊的作用机
制, 有待进一步揭示。
2.3 PLDδ在低温驯化过程中负调节脯氨酸与可
溶性糖的积累
低温驯化过程中, 植物大量积累脯氨酸和可溶性糖等
渗透调节物质以降低细胞渗透势。在冰冻胁迫下, 较
低的细胞渗透势有利于缓解胞外结冰对细胞质产生
的脱水胁迫(Xin and Browse, 1998)。因此, 渗透调节
被认为是植物提高抗冻性的主要机制之一。然而, 在
低温驯化3天后, PLDδ基因敲除植株的脯氨酸和可溶
性糖含量却高于野生型, 且分别达到极显著和显著水
平(图4A, B)。PLDδ基因对2种渗透调节物质的积累起
负调控作用。这一结果表明, PLDδ基因不是通过调控
脯氨酸和可溶性糖2种渗透调节物质的积累这一途径
来参与植物低温驯化过程的。Xin和Browse(1998)提
出, 低温驯化不是依靠一条简单、线性的信号转导途
径来完成的, 而是由多条平行或交叉的途径共同激活
一系列的低温反应过程。可以推测, PLDδ的作用途径
与渗透调节途径平行, 协同作用提高植物的抗冻性。
2.4 PLDδ参与ABA诱导植物抗冻性的过程
植物经过低温驯化, 内源ABA水平明显增加(Lang et
al., 1994; 吴耀荣和谢旗, 2006), 一些低温诱导基因表
达增强(Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki, 2006),
抗冻性大幅度提高。外源ABA处理能在常温下诱导许
多低温诱导基因的表达, 提高植物的抗冻性(Gilmour
and Thomashow, 1991)。另外, ABA合成缺陷突变体
(aba-1)与ABA不敏感突变体(abi-1)经低温驯化, 都不
能提高抗冻性(Mantyla et al., 1995)。这些研究结果证
明, ABA作为信号物质参与植物的低温驯化过程。本研
究发现PLDδ也参与植物的低温驯化过程, 那么PLDδ
王涛等: 磷脂酶 Dδ参与植物的低温驯化过程 545


图4 低温驯化后拟南芥PLDδ基因敲除植株(PLDδ-KO)的渗透
调节物质积累量高于野生型(WT)
(A) 脯氨酸; (B) 可溶性糖
*和**分别表示基因型间有显著和极显著差异。

Figure 4 PLDδ-knockout (PLDδ-KO) had the higher level of
osmotic compounds than wild-type (WT) plants of Arabidop-
sis thaliana after cold acclimation
(A) Proline; (B) Soluble sugar
* and ** indicated the significant difference at 5% and 1%
level, respectively.


是否参与ABA诱导植物抗冻性的过程呢？
用30 μmol·L–1的ABA处理拟南芥后再进行冻害胁
迫处理, PLDδ基因敲除植株的抗冻性明显低于野生型
(图5A)。因为ABA处理能够在常温下提高植物的抗冻
性, 这种差异说明PLDδ基因的缺失影响了ABA诱导植
株抗冻性的过程, 即表明PLDδ参与ABA诱导植株抗冻
性的信号转导过程。但是, 如同低温驯化后再进行冻害
胁迫处理的结果一样, ABA处理后PLDδ基因敲除植株
和野生型之间离子渗漏率亦无显著差异(图5B)。
PLDδ参与植物的低温驯化过程, 而且参与低温
胁迫下ABA信号的转导过程。我们近期的实验还揭示


图5 ABA处理后拟南芥PLDδ基因敲除植株(PLDδ-KO)的抗冻
性低于野生型(WT)
(A) 表型; (B) 离子渗漏率

Figure 5 PLDδ-knockout (PLDδ-KO) had lower freezing
tolerance than wild-type (WT) plants of Arabidopsis thaliana
after treated with ABA
(A) Phenotype; (B) Ion leakage


了PLD家族的其它成员在植物低温胁迫反应中的作
用。PLDα也参与低温驯化过程, 但是与PLDδ不同,
它不参与ABA信号转导过程; PLDξ1不参与低温驯化
过程, 而通过它的磷脂降解功能影响植物的抗冻性
(未发表资料)。可见, PLDs不但在结构和生化特性方
面具有多样性, 而且不同成员的功能和作用机制均具
特异性。与对不同胁迫刺激均做出反应的“共同信号
物质”(如Ca2+)相比, PLD家族成员功能的多样性和特
异性可能为揭示信号转导物质对不同胁迫类型和胁
迫强度进行精确转导的机制提供有用信息。
如前所述, 低温驯化涉及多种复杂的细胞过程,
包括渗透调节、受抗氧化系统活性和细胞膜脂质组成
变化影响的细胞膜稳定性的调节、以及内源ABA参与
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的低温信号转导过程等。然而, PLDδ在低温驯化过程
中既不参与渗透调节, 也不参与调控抗氧化酶活性和
细胞膜磷脂组成, 即不参与细胞膜稳定性的调节。但
是PLDδ参与ABA诱导抗冻性的信号转导过程。
Zhang等(2004)的研究揭示了PLDα介导ABA诱导气
孔关闭的作用机制, PLDα通过产物PA与下游靶物
ABI1(一种磷酸酶2c)相互作用调控气孔的关闭。在低
温胁迫下, PLDδ可能通过产物PA参与ABA诱导抗冻
性的过程, 但是尚不清楚PLDδ-PA的下游靶物。因此
查明ABA介导的低温信号转导途径中PLDδ-PA的下
游靶物, 对于揭示低温信号转导途径和低温驯化机制
有重要意义。
致谢 美国密苏里大学生物系王学敏教授为本研究
提供PLDδ基因敲除的拟南芥纯合突变体和野生型材
料, 在此表示诚挚的谢意！
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Zhang W, Qin C, Zhao J, Wang X (2004). Phospholipase
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cell death in Arabidopsis. Plant Cell 15, 2285–2295.

Phospholipase Dδ Mediates the Process of Cold Acclimation in
Arabidopsis thaliana
Tao Wang1, 2, Xurong Mei1, Xiuli Zhong1*, Yuzhong Li1, Zhengbing Zeng1, Haiyan Wang1, Lei Sun1, Xu Xia1
1Key Laboratory of Dryland Farming and Water-saving Agriculture, Ministry of Agriculture, Institute of Environment and
Sustainable Development in Agriculture, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
2Yunnan Reascend Tobacco Technology (Group) Co., Ltd, Kunming 650106, China
Abstract We compared cold-acclimated and non-acclimated phospholipase D (PLD)δ-knockout and wild-type
Arabidopsis thaliana plants for tolerance to freezing. PLDδ-knockout plants showed lower freezing tolerance than did
wild-type plants with cold acclimation; without cold acclimation, the two genotypes did not differ in freezing tolerance.
Therefore, the PLDδ gene is involved in the process of cold acclimation. The pathways through which PLDδ acts in the
process of cold acclimation were then analyzed. During cold acclimation, PLDδ was not involved in the activation of SOD,
CAT, or POD anti-oxidative enzymes; it negatively regulated the accumulation of proline and soluble sugar, and mediated
the process of freezing resistance induced by the low temperature signaling molecule ABA.
Key words cold acclimation, phospholipase Dδ, signaling
Wang T, Mei XR, Zhong XL, Li YZ, Zeng ZB, Wang HY, Sun L, Xia X (2010). Phospholipase Dδ mediates the process
of cold acclimation in Arabidopsis thaliana. Chin Bull Bot 45, 541–547.
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* Author for correspondence. E-mail: zhongxl@ieda.org.cn
(责任编辑: 刘慧君)