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Studies of the Chimeric Stability of Fittonia albivenis with Different Proliferation Methods of Tissue Culture

组培增殖方式对网纹草嵌合性状稳定性的影响



全 文 :植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2015, 50 (3): 372–377, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2015.00372
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收稿日期: 2014-04-15; 接受日期: 2014-08-25
基金项目: 引进国际先进农业科学技术计划(948项目) (No.2011-G31)和中国博士后科学基金(No.2012M521202)
* 通讯作者。E-mail: Jpchen2001@126.com
组培增殖方式对网纹草嵌合性状稳定性的影响
王燕, 汪一婷, 吕永平, 牟豪杰, 李海营, 陈剑平*
浙江省农业科学院病毒与生物技术研究所, 农业部植保生物技术重点实验室, 杭州 310021
摘要 以一种具有良好的谱系细胞标记的周缘嵌合体网纹草(Fittonia albivenis)为研究材料, 对不同增殖方式下其组培苗嵌
合性状的稳定性进行了观察分析。结果表明, 以茎段诱导腋芽增殖时网纹草的稳定性很高, 但以丛生芽增殖时其嵌合性状
发生了变异, 变异率为21.32%; 叶片组织解剖学观察结果显示, 母本嵌合体茎尖分生组织中红和绿2种细胞谱系的细胞层
排布在丛生芽再生过程中发生了改变, 这可能是导致新类型嵌合体产生的原因。研究结果不仅对植物嵌合体种苗的组培生
产具有重要的指导意义, 而且为嵌合体的种质创新工作提供了新方法。
关键词 嵌合体, 组培增殖, 茎尖分生组织, 稳定性, 细胞谱系
王燕, 汪一婷, 吕永平, 牟豪杰, 李海营, 陈剑平 (2015). 组培增殖方式对网纹草嵌合性状稳定性的影响. 植物学报 50,
372–377.
随着生态园林城市的发展, 彩叶植物在园林绿化
中的应用越来越广。常色类型彩叶植物由于具有色彩
绚丽、观赏期长、观赏价值高和易养护等许多优点, 已
成为世界园林绿化的新宠(于晓南和张启翔, 2000;
侯元凯, 2010; 杨潇怡等, 2011)。其中, 嵌合体植物
是一个重要的群体类型, 常见的如金边虎尾兰(San-
sevieria trifasciata var. laurentii)和双色美人蕉(Can-
na generalis cv. ‘Cleopatra’)等都属于嵌合体彩叶植
物 , 它们独特的嵌合性状深受消费者的喜爱 , 并
成为园艺研究者关注的热点 (李明银和何云晓 ,
2005)。
众所周知 , 植物茎端分生组织 (shoot apical
meristem, SAM)是植物产生茎、叶、花和果实等主要
器官的场所。被子植物生活周期完成过程中, 地上部
分所出现的基本器官类型都是SAM不断活动的结果
(Leyser and Day, 2002)。大部分双子叶植物的SAM
都具有明显的3层结构, 从外向内依次为L1、L2和L3
层。其中, L1和L2层细胞主要进行垂周分裂, 称为原
套; L3层及其下的细胞则既可进行垂周分裂也可进行
平周分裂, 称为原体。在SAM中, 细胞谱系的位置与
其发育命运有着密切的关系。L1层细胞只进行垂周分
裂, 形成植物的表皮组织(Satina et al., 1940; No-
guchi et al., 1992; Chen et al., 2006); L2层细胞主要
进行垂周分裂, 但在器官形成时也进行平周分裂, 形
成表皮下的栅栏组织和叶子边缘的海绵组织、皮层和
雌雄配子等(Leyser and Day, 2002); L3层细胞既可
进行垂周分裂又可进行平周分裂, 形成器官和茎的内
部组织 , 如茎的维管组织等 (Marcotrigiano, 1997;
Carles and Fletcher, 2003)。植物嵌合体即为在其
SAM内包含2种或2种以上基因型的细胞, 由这些细
胞层形成器官并最终发育成完整植株(Satina et al.,
1940; Tilney-Bassett, 1986)。根据SAM细胞层中不
同遗传基础的细胞排布的空间结构, 可以将嵌合体分
为周缘嵌合体、扇形嵌合体和混合嵌合体。其中, 周
缘嵌合体的SAM内至少有1层的全部细胞不同于其它
细胞层, 鉴于其结构最为稳定(Burge et al., 2002),
故在园林应用中最为广泛, 且对其需求量也越来越
大。
前人的研究表明, 周缘嵌合体的特性只能通过无
性繁殖方式得以保持, 常规的有性繁殖会导致嵌合体
的分离(Burge et al., 2002)。然而, 传统的分株及扦
插方式繁殖系数低, 无法满足日益增长的市场需求。
朱至清(2002)和徐洁兰(2007)利用组织培养方式对嵌
合体植物进行快繁。但是, 由于嵌合体本身的稳定性
不高, 而且在组织培养条件下植物生长发育旺盛, 细
胞分裂和分化速度较快, 会导致彩斑性状发生改变,
·技术方法·
王燕等: 组培增殖方式对网纹草嵌合性状稳定性的影响 373
这给优良嵌合体品种组培种苗的生产带来很大困难。
因此, 研究嵌合性的组织培养增殖方式对其性状稳定
性的影响, 对嵌合体彩叶植物的组培生产及栽培具有
直接的指导意义。本研究以一种具有良好细胞谱系标
记的红网纹草(Fittonia albivenis)周缘嵌合体为材料,
通过分析不同增殖方式对其增殖率及嵌合性状稳定
性的影响, 探索适合嵌合体植株组织培养的最佳增殖
方式。
1 材料与方法
1.1 实验材料
红网纹草(Fittonia albivenis Lindl.)是由绿色和红色细
胞谱系共同发育而成的一种周缘嵌合体植物。本研究
以红网纹草的无菌组培植株为实验材料。
1.2 实验方法
1.2.1 网纹草的增殖培养
选取与母株性状一致的网纹草, 将切去顶芽后带有2
个节点的茎段和保留顶芽且具有2对叶片的芽苗分别
接种在增殖培养基上, 进行腋芽和丛生芽的增殖培
养。培养基配方为: MS (3%蔗糖+0.7%琼脂)+1.0
mg·L–1 6-BA+0.05 mg·L–1 NAA, pH=5.8。培养条件:
温度(23±2)°C, 光周期为16小时光照/8小时黑暗, 光
强为60 μmol·m–2·s–1。每组处理16瓶, 每瓶接种4个
材料。培养60天后, 观察2种增殖方式下网纹草的增
殖情况并统计增殖率。

1.2.2 增殖苗的性状观察及统计
以网纹草的母株性状为参照, 观察腋芽和不定芽增殖
方式下产生的增殖苗在叶缘及叶脉颜色等叶片形态
指标上的变化情况, 比较不同增殖方式对网纹草性状
稳定性的影响。
1.2.3 叶片组织解剖学观察
以新展开的网纹草成熟叶片为材料, 切取部分叶面将
其连同叶缘组织一起置于3%的低熔点琼脂糖中包埋,
修块后固定在Leica VT1000S (德国LEICA 公司)振
动切片机上进行横向切片, 切片厚度为40 μm。挑取
切片置于载玻片上, 盖上盖玻片后置于显微镜下观察
并拍照(每个样品设3次重复)。依据嵌合体植物的传统
命名法对产生的新类型进行命名 (Satina et al.,
1940)。

1.2.4 数据处理及分析
使用SPSS统计分析软件包 (SPSS Inc, Chicago,
USA)对数据进行差异(ANOVA)和显著性差异分析
(LSD)。
2 结果与讨论
2.1 增殖方式对网纹草增殖率和稳定性的影响
在相同培养条件下 , 我们对2种增殖方式下网纹草
的增殖及变异情况进行了观察, 结果见表1。从表1
可以看出, 利用诱导腋芽的方法对网纹草嵌合体进
行增殖时, 其增殖率为2.84, 显著低于丛生芽增殖
方式 (4.30); 但是其产生的增殖芽群体的变异率
仅为1.10%, 显著低于丛生芽增殖方式的变异率
(21.32%)。
2.2 新类型嵌合芽的形态观察及命名
母本类型网纹草(图1A)在丛生芽繁殖过程中从茎段
基部再生出3种形态特征与母本不同的新类型芽(图
1B–D); 而在腋芽增殖过程中仅产生少数的新类型2
的芽。母本类型具有红色叶脉和绿色的叶缘及叶面,
产生的新类型1的叶脉为白色(不表达花青素); 新类
型2的叶脉粗且稀疏, 叶缘为绿色; 新类型3也具绿色


表1 不同增殖方式对网纹草增殖率和稳定性的影响
Table 1 Effects of different multiplication ways on the proliferation rate and stabilities of Fittonia albivenis
Proliferation way No. of explants No. of buds propagated No. of buds variated Proliferation rate Variation rate (%)
Axillary bud proliferation 64 182 2 2.84±0.06 b 1.10±0.32 b
Cluster bud proliferation 64 272 58 4.30±0.20 a 21.32±2.77 a
同列不同行数值后的小写字母表示差异显著(P<0.05)。
Values with different letters in each column mean significantly different at P<0.05.

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图1 丛生芽增殖过程中产生的新类型网纹草的叶片形态
(A) 母本类型; (B) 新类型1; (C) 新类型2; (D) 新类型3。Bar=1 mm

Figure 1 The leaf morphology of the new Fittonia albivenis types generated by cluster-bud proliferation
(A) Mother plant; (B) New type 1; (C) New type 2; (D) New type 3. Bar=1 mm


叶缘, 但叶脉为白色, 叶面为红色。网纹草在丛生芽
增殖过程中产生4种类型的几率如图2所示, 母本类
型最高 , 为78.67%; 新类型2和3分别为16.18%和
4.41%; 新类型1最低, 仅为0.74%。
前人研究认为, 周缘嵌合体是较为稳定的嵌合体
类型, 其SAM中的不同细胞层一般会形成特定的组
织。例如, Burge等(2002)研究发现植物的表皮层一般
来源于SAM的L1层; L2层发育成紧贴表皮下面的亚
表皮组织、栅栏组织和配子等 (Leyser and Day,
2002; Wang et al., 2011); L1层(或)与L2层共同发育
成植物的叶缘 (McHale and Marcotrigiano, 1998;
Wegner, 2003); L3层则发育成植物的内部组织, 如
叶脉、叶片内部的海绵组织及茎的维管束等(Carles
and Fletcher, 2003)。因此, 研究者一般采用基于叶
片组织结构特征的传统命名法命名嵌合体植物(Sa-
tina et al., 1940)。
通过叶片组织解剖学观察并结合叶片的表观性
状, 发现母本类型网纹草的叶缘为绿色(图1A), 表明
其L1层来源于绿色细胞谱系; 其亚表皮细胞内表达
叶绿素(图3A), 因此其L2层起源于绿色细胞谱系; 叶
脉为红色(图1A), 且叶片维管束细胞内能合成花青素
(图3A), 这表明母本类型网纹草的L3层来源于红色细
胞谱系。我们以G代表榨菜谱系, R代表紫甘蓝谱系,
根据SAM内的细胞层结构 , 按照由外向内的顺序
(L1-L2-L3), 可将母本类型网纹草命名为GGR。同理,
新类型1的叶缘和亚表皮细胞均呈绿色, 叶脉为白色


图2 丛生芽增殖过程中不同类型网纹草的诱导率

Figure 2 Induction rate of different Fittonia albivenis types
during cluster bud proliferation


(叶绿素在网纹草叶脉处的细胞中不表达) (图3B), 因
此其SAM细胞层的排布结构为GGG。新类型2与母本
组织结构相似, 也属于GGR嵌合体类型, 所不同的
是二者叶脉维管束的红色谱系细胞在群体数量和分
布上存在差异(图3C)。新类型3具有绿色叶缘(L1)、红
色的亚表皮细胞(L2)和白色叶脉(L3) (图3D), 因此被
命名为GRG。
王燕等: 组培增殖方式对网纹草嵌合性状稳定性的影响 375


图3 不同类型网纹草嵌合体的叶片解剖学观察(左侧为叶缘部位)
(A) 母本类型; (B) 新类型1; (C) 新类型2; (D) 新类型3。Bar=100 μm

Figure 3 Leaf histological structures of different Fittonia albivenis types (The left side is leaf margin)
(A) Mother plant; (B) New type 1; (C) New type 2; (D) New type 3. Bar=100 μm


2.3 讨论
嵌合体植物是彩叶植物中一个重要的群体类型。鉴于
其较高的观赏价值, 嵌合体在花卉市场中所占的份额
越来越大, 目前已在很多国家被广泛研究和应用。但
由于嵌合体的结构特征不稳定, 在繁殖过程中常会产
生变异, 这给嵌合体观赏植物种苗的组培快繁带来了
很大困难。本研究表明, 网纹草周缘嵌合体丛生芽增
殖方式的变异率显著高于腋芽繁殖方式, 但诱发产生
了多种不同于母本的新类型植株; 通过叶片组织解剖
学观察, 发现母本网纹草嵌合体内红、绿2种颜色的
谱系细胞在丛生芽再生过程中, 其SAM中细胞层排
布发生了变化, 这很可能是不同结构类型嵌合体产生
的直接原因。前人研究认为腋芽为定芽, 其茎尖分生
组织继承了植株顶端分生组织的细胞层组成, 因此嵌
合体通过腋芽繁殖比较稳定(Zhu et al., 2007)。本研
究也表明, 腋芽繁殖是嵌合体植物离体快繁的最佳方
式, 这与以往的研究结论一致。然而, 不定芽的起源
(包括丛生芽)与腋芽不同, 它们一般为多细胞起源,
且大多源于L2或/和L3层, 因此无法保持其原本的细
胞层排布结构 (Marcotrigiano, 1997; Zhu et al.,
2007; Zonneveld, 2007)。此外, 由于不定芽的形成
也可能仅由SAM中的单一细胞谱系参与(Burk et al.,
1964; Stewart and Dermen, 1970; Broertjes and
Van Harten, 1985; Tian and Marcotrigiano, 1993),
故其再生可能会导致嵌合体分离为遗传类型组成单
一的植株。在本研究中, GRG类型则为多细胞谱系起
源; 而GGG则是红网纹草中单一谱系来源的非嵌合
体回复植株, 它很可能来源于母本的L2层。
有研究表明, 嵌合体植物的不稳定性与嵌合体中
不同谱系细胞的遗传性及生长竞争力强弱有关(Sw-
artz et al., 1991)。Hagemann和Scholze (1974)通过
研究嵌合体天竺葵(Pelargonium zonale), 发现绿色
正常细胞的生长势强于突变而成的白色细胞。此外,
周围生长环境也对不同谱系细胞的生长发育具有一
定的影响。本研究中, 产生频率最高的GGR新类型网
纹草与母本类型在形态特征上具有较明显的差异, 但
是叶片解剖学观察结果显示, 2种类型网纹草仅在叶
脉处红色谱系细胞的数量上略有不同, 这可能是生长
环境等外部因素作用的结果。
376 植物学报 50(3) 2015
综上所述, 本研究通过分析不同组培增殖方式下
网纹草嵌合体的增殖率及性状稳定性, 并探索新类型
变异芽的形成原因及重新排布特性, 明确了茎段腋芽
繁殖是嵌合体植物增殖的最佳方式。研究结果不仅对
植物嵌合体种苗的组培生产具有一定的指导意义, 而
且也为嵌合体的种质创新和育种工作提供了一种简
单有效的新方法。
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王燕等: 组培增殖方式对网纹草嵌合性状稳定性的影响 377
Studies of the Chimeric Stability of Fittonia albivenis with Different
Proliferation Methods of Tissue Culture
Yan Wang, Yiting Wang, Yongping Lü, Haojie Mou, Haiying Li, Jianping Chen*
Ministry of Agriculture Key Laboratory of Biotechnology in Plant Protection, Institute of Virus and Biotechnology, Zhejiang
Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China
Abstract The chimeric stability of Fittonia albivenis with different proliferation methods was analysed, with assistance
from favourable markers of cell lineage. The axillary bud proliferation was appropriate for the multiplication of ornamental
chimera plants; the variation rate of cluster-bud proliferation was 21.32%, and the two lineages with red and green color
separately were found rearranged in the shoot apical meristem of cluster buds, which might directly induce the appear-
ance of new chimera types. This study offers insights into the production of chimera plantlets via tissue culture and a new
method for producing innovative germplasm for plant chimeras.
Key words chimera, proliferation, shoot apical meristem, stability, cell lineage
Wang Y, Wang YT, Lü YP, Mou HJ, Li HY, Chen JP (2015). Studies of the chimeric stability of Fittonia albivenis with
different proliferation methods of tissue culture. Chin Bull Bot 50, 372–377.
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* Author for correspondence. E-mail: Jpchen2001@126.com
(责任编辑: 孙冬花)