为建立水蜜桃多酚氧化酶(PPO)高效分离纯化方法,并明确该酶的酶学特性,本研究采用柱层析法对该酶进行分离纯化,对其反应特性及稳定性进行研究。结果表明,Phenyl-Sepharose CL-4B疏水柱层析法对水蜜桃PPO的纯化倍数与硫酸铵分级沉淀法相近,但其得率为89%远高于后者;采用Phenyl-Sepharose CL-4B、DEAE Sepharose Fast Flow和Sephaoryl HR S-200三级柱层析联用的方法对PPO分离纯化,获得PPO总纯化倍数为12.40倍,总得率为20%;该PPO组分经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析得到单一蛋白条带,其分子量为81 kDa。纯化后的水蜜桃PPO对 (+)-儿茶素和(-)-表儿茶素的米氏常数分别为0.14 mM和0.12 mM,最适反应pH值为7.0,最适反应温度为40℃。纯化后的水蜜桃PPO对热以及低pH值都很不稳定。本研究结果为进一步研究PPO酶促褐变机制提供了理论指导,同时也为其他果蔬中PPO的分离纯化提供参考。
全 文 ：!核 农 学 报!"#$%!"&"# $$$"$ ($$"A
!"#$%&"()#*+&$,-$.*#/#$&0*.+%*+1
收稿日期!"#$)*#,*,$!接受日期!"#$%*#"*#,
基金项目!浙江省自然科学基金" W`$"K"###"# !宁波市自然科学基金""#$".$#$,,#
作者简介!刘亮!男!副教授!主要从事农产品贮藏与加工研究% 0*1234$4328943=A";@382>:71
通讯作者!曹少谦!女!副教授!主要从事农产品贮藏与加工研究% 0*1234$@627g328:27;@382>:71
文章编号!$###*A%%$""#$%##*$$"$*#A
水蜜桃多酚氧化酶分离纯化及其酶学特性研究
刘!亮$!王如坤"!程慧媛"!曹少谦"!陈!伟"!戚向阳"
" $ 浙江医药高等专科学校生物与食品系!浙江 宁波!,$%$##& "浙江万里学院生物与环境学院!浙江 宁波!,$%$###
摘!要!为建立水蜜桃多酚氧化酶JJE(高效分离纯化方法!并明确该酶的酶学特性!本研究采用柱层析
法对该酶进行分离纯化!对其反应特性及稳定性进行研究# 结果表明!J6X8<4*IXS62?7@XK` B)-疏水柱
层析法对水蜜桃 JJE的纯化倍数与硫酸铵分级沉淀法相近!但其得率为 A&Q远高于后者$采用 J6X8<4*
IXS62?7@XK` B)-"/0.0IXS62?7@XD2@TD47\和 IXS627?<4YLI B"## 三级柱层析联用的方法对 JJE分
离纯化!获得 JJE总纯化倍数为 $"G)# 倍!总得率为 "#Q$该 JJE组分经 I/I B聚丙烯酰胺凝胶电泳分
析得到单一蛋白条带!其分子量为 A$ N/2# 纯化后的水蜜桃 JJE对 h( B儿茶素和 B( B表儿茶素
的米氏常数分别为 #G$) 1Z和 #G$" 1Z!最适反应 SY值为 +G#!最适反应温度为 )#O# 纯化后的水蜜
桃 JJE对热以及低 SY值都很不稳定# 本研究结果为进一步研究 JJE酶促褐变机制提供了理论指导!
同时也为其他果蔬中 JJE的分离纯化提供参考#
关键词!水蜜桃$多酚氧化酶$纯化$酶学特性
/EF$$#G$$A&H5>3@@8>$##*A%%$G"#$%G#>$$"$
!!水蜜桃":$#%#1>+$1.*& DK6&/1*5#色)香)味)质俱
佳!果实皮薄汁多!味甜质糯!口感细腻!倍受消费者欢
迎!具有较强的市场竞争力!在果品市场占据重要地
位% 但是!水蜜桃采后贮藏及加工过程中易发生褐变!
严重影响产品品质!而多酚氧化酶"JJE#所引起的氧
化反应是导致褐变的主要原因%
JJE是广泛存在于自然界中的含铜酶% 酶促褐变
是由 JJE氧化酚类底物产生醌类化合物所致% 这些
醌类化合物是具有高反应性的物质!可以参与许多不
同的反应途径!它们是强亲电试剂!在果蔬衰老和贮藏
过程中可以被其它酚类化合物)氨基酸)蛋白质亲核攻
击而产生深褐色或者黑色的色素 $ B,( %
目前!有关果蔬中 JJE的研究报道较多!但主要
集中在果实贮藏中或加工过程中 JJE活性变化 ) B&(
以及对果蔬中 JJE粗提物的酶学特性研究上 $# B$,( %
而果蔬中 JJE的分离纯化一直都是果蔬酶促褐变研
究领域的一个重点难题!其中分离纯度不高和酶活得
率较低 是 果 蔬 JJE 分 离 纯 化 过 程 中 主 要 的 问
题 $) B$%( % 因此!开发一种高得率的果蔬 JJE的分离
纯化方法对果蔬褐变机制的研究显得尤为重要% 而另
一方面!对于水蜜桃 JJE的分离纯化目前还未见报
道!从而导致有效控制水蜜桃褐变的调控手段以及相
关理论依据较为缺乏% 针对以上问题!本研究拟建立
一种高效分离水蜜桃 JJE的纯化方法!并对纯化后的
JJE的酶学特性进行研究!为进一步阐明水蜜桃褐变
机制以及开发水蜜桃贮藏及加工过程中的护色保鲜技
术提供一定的理论依据% 同时!本研究结果也为其它
果蔬中 JJE的分离纯化提供了可借鉴的思路和方法%
!"材料与方法
!#!"材料
$G$G$!试验原料!试验用水蜜桃为奉化玉露!购于宁
波市水果批发市场!选择商业成熟度)新鲜)色泽好且
无机械损伤的蜜桃榨汁取果肉!密封置于 B$AO下保
存备用%
$G$G"!试剂!儿茶素标准品购于美国 @3912公司!其
他试剂均为分析纯&/0.0IXS62?7@XD2@TD47\)J6X8<4*
$"$$
核!农!学!报 "& 卷
IXS62?7@XK` B)-) IXS627?<4YL I B"## 均 购 于
J62?12:32公司%
$G$G,!仪器!试验所用仪器主要有 IYFZ./effmB
$+## IJK紫外可见分光光度计"日本岛津公司#!磁力搅
拌器"上海大普仪器公司#!高速组织捣碎机"金坛市维诚
实验器材厂#!0SSX8P7?[%A#)L冷冻离心机 "德国
0SSX8P7?[公司#!-FE*L./I0"%# 电泳仪"美国 -FE*L./
公司#.iU.J?31XJ$蛋白纯化系统"美国R0公司#等%
!#$"方法
$G"G$!JJE粗酶液的提取!称取 % ###9冻藏的桃肉!
加入 & ###1` 丙酮!用高速组织捣碎机匀浆 $ 138 后于
)O冰箱中静置 "6!再用布氏漏斗抽滤!滤饼用% ###1`
丙酮冲洗后置于蒸发皿中!室温下放于通风橱中让丙酮
挥发即得到 JJE丙酮干粉% 将丙酮粉加入到 )##1`
$## 1ZSY值 GA 的磷酸缓冲液中!并加入丙酮粉重量
为 %Q的JmJJ均质 "# 138 后 A ### ?*138 B$离心 % 138!
收集上清液即为水蜜桃 JJE粗提液%
$G"G"!硫酸铵分级沉淀!将 JJE粗提液放置在磁力
搅拌器上!缓慢加入硫酸铵!使溶液的硫酸铵饱和度依
次达到 ,#Q))#Q)%#Q)+#Q)A#Q)&#Q!每一级梯
度在 ) O 环境下静置 "6 后!)O下 A ### ?*138 B$离心
$# 138!上清液再加入硫酸铵至下一级饱和度!静置!
离心直至 &#Q为止%
$G"G,!IXS62?7@XK`*)-柱层析!向水蜜桃 JJE粗提
液中添加"MY)# " IE) 至 )#Q饱和度!然后将此溶液以
" 1` *138 B$ 的 流 速 流 过 预 先 用 " 174*`B$ 的
"MY) # " IE) 溶液平衡好的 J6X8<4*IXS62?7@XK` B)-
"":1C"#:1#柱!先用含 $GA) 174*`B$ "MY) # " IE) 的
#G#% Z磷酸缓冲液"SY值 GA#冲洗!再用 #G#% Z磷
酸缓冲液"SY值 GA#洗脱!收集有酶活的组分!透析%
$G"G)!/0.0*DD柱层析!将 $G"G, 中所得透析液上
样于 /0.0IXS62?7@XD2@TD47\"$G:1C$#:1#柱!先
用 $# 1174*` B$ U?3@*YK4"SY值 GA#缓冲液以不同的
流速"#G+)$G%),G# 1`*138 B$ #冲洗!再用 %# 1174*
`B$ U?3@*YK4"SY值 GA#缓冲液以相同的流速洗脱!收
集有酶活的组分%
$G"G%!IXS627?<4YLI B"## 柱层析!将 $G"G) 中所
得样品上样于用 #G#% Z的磷酸缓冲液"SY值 GA#平
衡好的 IXS627?<4YLI B"##""G#:1C#:1#柱!用同
样的 缓 冲 液 以 不 同 流 速 " #G% 1` *138 B$ 和 $G#
1`*138 B$#进行洗脱!收集有酶活的组分%
$G"G!JJE活性测定!采用分光光度法 $( !以儿茶
素为底物测定多酚氧化酶活性!具体方法如下$$G&
1` 磷酸缓冲液 "#G#%Z! SY值 GA#和 $1` ,1Z底
物!调零后快速加入 #G$1` 酶液!开始计时!用紫外分
光光度计在 ),% 81下每隔 ,# @读取吸光度值!计时 ,
138!平行测定 , 次% 依据曲线最初直线部分"反应初
速度#计算酶活力% 以每分钟吸光值值增加 #G##$ 为
一个酶活性单位%
酶活计算公式$酶活 k.H"TCmC#G##$#
.HT即为反应初速度"吸光度 B时间曲线的斜
率#&m为酶的取样体积%
$G"G+!蛋白含量测定!采用考马斯亮蓝法 $+( %
$G"GA!I/I B聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 ! 按 照
2`X1143$A(所描述的方法进行 I/I*J.R0% 先将样品
溶于样品缓冲液中!再在 &% ($##O的条件下加热
%138!待冷却后用 $#Q的分离胶进行分离% 电泳结束
后再用考马斯亮蓝 LB"%# 进行染色%
$"结果与分析
$#!"硫酸铵分级沉淀法与 D4+M65-:4NX]
传统方法分离 JJE常采用硫酸铵分级沉淀% 由图
$ 可知!多酚氧化酶在硫酸铵饱和度达到 ,#Q时开始沉
淀!但沉淀中酶活很低&而当硫酸铵饱和度达到 )#Q时!
绝大部分的酶活仍然保留在上清液中&当硫酸铵饱和度
到达 %#Q时!上清液中的酶活有了较为明显的下降!说
明只有当硫酸铵的饱和度接近 %#Q时!JJE的沉淀速率
才开始加快% 硫酸铵饱和度在 #Q (+#Q范围内时所
得 JJE沉淀最多!而硫酸铵饱和度在 A#Q (&#Q范围
内时仅有少量的酶沉淀下来% 因此!采用硫酸铵分级沉
淀法纯化水蜜桃 JJE时!最佳的分离方法是收集硫酸
铵饱和度在 )#Q (A#Q时的沉淀%
由表 $ 可知!水蜜桃 JJE的粗提取液经过 )#Q (
!!!!
图 !"硫酸饱和度与多酚氧化酶沉淀的关系
/*01!";;4I.-;:6.G56.*-9-;6AA-9*GA
:G,;6.4-9.M4:6,.*90 -G.A4.M-8;-5SSU
""$$
! 期 水蜜桃多酚氧化酶分离纯化及其酶学特性研究
表 !"硫酸铵分级沉淀法与 D4+M65-:4NX]
IM5-A6.-056+M7 -9SM497,(D4+M65-:4NX]
ZXT67P
步骤
J=?3[3:2T378 @TXS
总体积
U7T24
a74=1XH1`
总酶活
U7T24X8d<1X
2:T3a3T
J?7TX38H19
比活性
ISX:3[3:2:T3a3T
纯化倍数
J=?3[3:2T378 [74P
得率
b3X4PHQ
$ 粗提取 $+, ))& #$ )+>## & %%% $>## $##
)#Q硫酸铵上清液 $&# ),$ #&& ,>## $$ &+% $>"% &
A#Q硫酸铵沉淀 ,, "A" &#& $,>## "$ +" ">"A ,
" 粗提取 $+, ))& #$ )+>## & %%% $>## $##
)#Q硫酸铵上清液 $&# ),$ #&& ,>## $$ &+% $>"% &
IXS62?7@XK` B)- "% )#$ ,," $%>)A "% &" ">+$ A&
A#Q硫酸铵分级沉淀后!其最终纯化倍数为 "G"A 倍!
得率为 ,Q% 由于硫酸铵分级沉淀法需多次离心!对
样品的损失较大!所以其得率不高% 为了找寻能获得
更高得率的分离纯化方法! 本试验同时采用了
IXS62?7@XK` B)-疏水柱层析对水蜜桃 JJE粗提液进
行纯化%
!!疏水层析柱的分离原理是蛋白质在高盐浓度时吸
附在柱子上!而低盐浓度时蛋白质被洗脱下来% 根据图
$ 和表 $ 的结果可知!当硫酸铵饱和度小于 )#Q时!绝
大部分的 JJE活性还保留在上清液中!因此!本研究选
择以 )#Q硫酸铵沉淀所得上清液作为 IXS62?7@XK` B
)-柱的上样液!以 #G#% Z磷酸缓冲液"SY值 GA#为洗
脱液进行洗脱!所得酶液的纯化倍数为 "G+$ 倍"表 $#!
与硫酸铵沉淀法的纯化倍数相近!但其得率为 A&Q!远
高于硫酸铵分级沉淀法的得率% 另外!经 IXS62?7@XK`
B)-柱分离后!酶液的体积显著减少!说明该柱在分离
JJE的同时还具有很好的浓缩作用%
表 $"水蜜桃 SSU的柱色谱分离纯化
L6),4$"SG5*;*I6.*-9-;SSU;5-A+46IM+G,+)7 I-,GA9IM5-A6.-056+M*I+5-.-I-,
步骤
J=?3[3:2T378
@TXS
总体积
U7T24
a74=1XH1`
蛋白质
J?7TX38H19
总酶活
U7T24X8d<1X
2:T3a3T
2:T3a3T
J=?3[3:2T378 [74P
得率
b3X4PHQ
粗提取 "%# "&G+% +%, &$A "% ,)$G+A $G## $##
)#Q硫酸铵上清液 ", "#G, +,$ ,## ,% &$AG)& $G)" &+
IXS62?7@XK4B)- "% &G$, %% &#& +$ A)$G#) "GA, A+
/0.0*DD "$ "G%, )"" $&) $ A+%G$, G%A %
IXS627?<4YLI B"## $A #G)A $%# +A) ,$) $,"G%# $"G)# "#
$#$"三级柱层析分离水蜜桃 SSU
根据上面的结果!本研究选择用疏水层析柱
J6X8<4*IXS62?7@XK` B)-柱来代替硫酸铵分级沉淀!
并在此基础上进一步采用 /0.0IXS62?7@XD2@TD47离子交换层析柱和 IXS627?<4YLI B"## 分子筛凝胶
层析柱对水蜜桃 JJE进行分离纯化%
!!由表 " 可知!经 /0.0IXS62?7@XD2@TD47\柱分离
后!所得 JJE组分的纯化倍数进一步提高!但由于
JJE与该离子交换色谱的结合能力较弱!在上样平衡
过程中可能会有部分 JJE被洗脱下来!所以此步骤分
离过程中酶活损失较大!导致得率大大降低%
将 /0.0*DD分离所得酶液进一步用 IXS627?<4
YLI B"## 柱层析进行纯化% 经该柱层析分离后!得
到 , 个主要的蛋白峰!经酶活分析发现!只有第 $ 个蛋
白峰显示有 JJE酶活性!而后面 " 个蛋白峰均不显示
有 JJE酶活性"图 "#% 经过三级柱层析分离后!最终
得到总纯化倍数为 $"G)# 倍的 JJE!其总得率为 "#Q
"表 "#%
经 I/I*J.R0分析可知!经 IXS627?<4YLI B"##
柱分离所得水蜜桃 JJE组分在凝胶上形成 $ 条清晰
的蛋白带"图 ,#!说明经三级柱层析分离后!水蜜桃
JJE得到有效的纯化% 通过比较标准蛋白的迁移率得
出水蜜桃 JJE的亚基分子量为 A$ N/2"图 )#%
,"$$
核!农!学!报 "& 卷
图 $"D4+M6-57,_TD]$\\ 柱分离水蜜桃 SSU的洗脱图
/*01$"SG5*;*I6.*-9-;+46IM+G,+SSU
)7 D4+M6-57,_TD]$\\ I-,GA9
注$$>标准蛋白!">IXS627?<4YL
I B"## 柱分离所得 JJE组分%
M7TX$$>Z2?NX?@>">JJE7]T238XP [?71
IXS627?<4YLI B"## :74=18>
图 %"D4+M6-57,_TD]$\\ 柱分离所得水蜜桃
SSU组分的 D@D]聚丙烯酰胺凝胶电泳图
/*01%"D@D(S2&-;+46IM+G,+SSU;56I.*-9
+G5*;*48)7 D4+M6-57,_TD]$\\ I-,GA9
$#%"水蜜桃 SSU的酶学特性研究
"G,G$!酶动力学参数!本研究分别以 " h# B儿茶
素)" B# B表儿茶素以及邻苯二酚 , 种底物!对纯化
后的水蜜桃 JJE进行米氏常数 "i1#)最大反应速率
"m12^#以及特异性 "m12^Hi1#测定% 由表 , 可知!以
" h# B儿茶素和 " B# B表儿茶素为底物时水蜜桃
JJE的 i1值较为接近!但均明显小于以邻苯二酚为底
物时的 i1值!说明水蜜桃 JJE对 " h# B儿茶素和
" B# B表儿茶素均有很强的亲和力!而对邻苯二酚的
亲和力相对较弱%
图 <"水蜜桃 SSU分子量测定
/*01<":.*A6.48A-,4IG,65C4*0M.-;+46IM+G,+SSU
表 %"水蜜桃 SSU催化不同底物时的米氏常数&
最大反应速率以及特异性
L6),4%"P*IM64,*:(P49.49I-9:.69.& A6W*AGA 34,-I*.7
698:+4I*;*I*.7 -;+46IM+G,+SSUC*.M8*;;4549.:G):.56.4:
底物
I=]@T?2TX
最大反应速率
m12^ H"f*138
B$ #
米氏常数
i1H1Z
特异性
m12^ Hi1H
"f*138 B$*1ZB$#
" h# B儿茶素 "$& j$A #G$) j#G#$ $ %,+ j$$
" B# B表儿茶素 ,)+ j"$ #G$" j#G#$ " A% j$&$
邻苯二酚 &) j+ ,GA j#G"& "% j$
"G,G"!SY值和温度对水蜜桃 JJE活性的影响!由
图 % 可知!酶促反应受 SY值的影响很大!纯化后的水
蜜桃 JJE只在 SY值 G# (+G% 时表现出较高的活性!
且最适反应 SY值为 +G#&而当 SY值小于 G# 时!其酶
活性随 SY值下降而快速下降&当 SY值低于 )G# 时!
其酶活性变得非常低%
研究结果表明!纯化后的水蜜桃 JJE的反应速率
受温度的影响也比较大!由图 可知!当温度低于
)#O时!酶活性随着温度的升高而逐渐变大&到 )#O
时!达到该酶的最适反应温度&当反应温度高于 )#O
后!酶的活性又随着温度的升高而迅速下降%
"G,G,!水蜜桃 JJE的热稳定性!热稳定性研究结果
表明!纯化后的 JJE在 %#O时较为稳定!热处理
$"#138 仍有 +AG%"Q的酶活剩余&而当热处理温度超
过 %#O时!酶开始变得不稳定!且随着温度的增加!热
对酶的破坏作用加大!其稳定性迅速降低% 在 #O下
保温 "138 后!仅有 ,"G%$Q的酶活剩余&在 A#O下保
温 "%@后!仅有 AG$+Q的酶活剩余"图 +#%
"G,G)!水蜜桃 JJE的 SY稳定性!SY稳定性研究结
果表明!纯化后的 JJE在 SY值 G# (AG# 的范围内较
为稳定!而随着 SY值的不断降低!其稳定性不断下
)"$$
! 期 水蜜桃多酚氧化酶分离纯化及其酶学特性研究
图 ="+_对水蜜桃 SSU活性的影响
/*01=";;4I.-;+_ -96I.*3*.7 -;SSU;5-A+46IM
图 >"温度对水蜜桃 SSU活性的影响
/*01>";;4I.-;.4A+456.G54-96I.*3*.7 -;
SSU;5-A+46IM
图 ?"温度对水蜜桃 SSU稳定性的影响
/*01?";;4I.-;.4A+456.G54-9:.6)*,*.7 -;SSU;5-A+46IM
降% 在 SY值 %G# 的条件下贮藏 AP!仅有 %&G,)Q的残
余酶活剩余!而在 SY值 ,G# 条件下贮藏 P 后就只有
,GA"Q的残余酶活剩余"图 A#%
图 ["+_对水蜜桃 SSU稳定性的影响
/*01[";;4I.-;+_ 36,G4:-9:.6)*,*.7 -;SSU;5-A+46IM
%"讨论
水蜜桃果肉中含有大量果胶!这些果胶在硫酸铵
分级沉淀的过程中会随着 JJE一起沉淀下来!给 JJE
的分离纯化带来困难% 同时!由于在采用硫酸铵分级
沉淀法时需要多次沉淀和离心!在这些操作过程中
JJE的损失较大!所以硫酸铵沉淀法分离纯化 JJE的
得率较低% 本研究采用疏水层析柱 IXS62?7@XK` B)-
来取代硫酸铵沉淀!对水蜜桃中的 JJE进行分离纯
化% 研究表明!IXS62?7@XK` B)-柱是高效分离纯化
水蜜桃 JJE的重要手段!该方法不仅能有效的除去
JJE组分中的果胶!同时使水蜜桃 JJE的得率大幅度
提高% 尽管如此!研究结果却发现疏水层析柱与硫酸
铵沉淀法的蛋白纯化倍数相近!因此!本文认为!
IXS62?7@XK` B)-柱对 JJE组分中杂蛋白的去除能力
有限!在 JJE的分离纯化过程中其所起的作用更多的
是使蛋白质浓缩%
有关柱色谱分离纯化 JJE的研究已经被广泛报
道!但由于 JJE在分离纯化过程中损失较大!导致许
多纯 化 方 法 最 终 的 纯 酶 得 率 很 低 " 不 超 过
$Q# $"!$& B"#( % 本 研 究 通 过 疏 水 层 析 柱 J6X8<4*
IXS62?7@XK` B)-! 离子交换层析柱 /0.0IXS62?7@X
D2@TD47\和分子筛凝胶层析柱 IXS627?<4YLI B"##
三级联用!不仅从水蜜桃果肉中分离得到了电泳纯的
JJE!而且 JJE的得率比前人的研究报道有显著地提
高 $) B$%!$& B"$( %
经测定!本研究所得水蜜桃 JJE组分的亚基分子
量为 A$ N/2!与段玉权等 $"(报道的中华寿桃 JJE的
亚基分子量" N/2#有较大差异!可能是由于所用原
料品种不同所致% 现有研究报道表明!不同果蔬中
%"$$
核!农!学!报 "& 卷
JJE的分子量差异较大!比如草莓 JJE的分子量为
$"" N/2""( !茄子 JJE的分子量为 $$" N/2$&( !枇杷
JJE的分子量为 %& N/2"#( !土豆 JJE的分子量为 &
N/2"$(以及桑葚 JJE的分子量为 % N/2",( % 另外!
JJE的亚基组成也与其来源有着密切联系!不同植物
组织中提取的 JJE的亚基组成不一样!如茄子 JJE由
" 个亚基组成 $A( !而枇杷 JJE为单体酶 $&( %
前人的研究报道表明!" h# B儿茶素是水蜜桃中
最主要的酚类物质之一 ") B"( % 本文对纯化后的水蜜
桃 JJE进行酶动力学研究!发现水蜜桃 JJE对" h#
B儿茶素有很强的亲和力!这是导致水蜜桃在榨汁的
过程中快速褐变的原因% 当水果组织完整时!JJE主
要存在于细胞质体中!而酚类底物存在与液泡中!当对
水蜜桃进行压榨时!水果的完整细胞结构被破坏!导致
JJE和底物结合!而水蜜桃中的 JJE与其内源底物
" h# B儿茶素的亲和力很强!使酶促反应快速进行!
从而最终导致了水蜜桃汁的迅速褐变%
大量关于 JJE最适 SY的研究结果表明!大部分
植物 JJE在中性或者中性附近的 SY范围内显示其有
最大活性 )!$# B$,!$%!$&!" B"+( !本文的结果再次证实了该
观点% 同时!对比前期研究结果发现!就水蜜桃 JJE
而言!酶的最适 SY值和最适反应温度受酶纯度的影
响不大 "A( % 而本文的热稳定性研究结果表明!纯化后
的水蜜桃 JJE热稳定性很差!在 #O下保温!其酶活
都会迅速下降% 这与前期报道的有关水蜜桃 JJE粗
提物的热稳定性有较大差异$水蜜桃 JJE粗提物在
#O时较为稳定!在 $"%138 之后仍有 +G%#Q 酶
活 "A( % 这种差异可能是由于水蜜桃 JJE粗提物中含
有一定量的果胶等杂质!这些物质可能对 JJE活性具
有保护作用% 这与之前在研究脉冲强光及紫外线对水
蜜桃 JJE的钝化作用时所得到的推论类似 $( % 这说
明在水蜜桃的护色保鲜工作中!一定要考虑果胶等物
质对 JJE稳定性的保护作用!如果是含果胶较多的产
品!热力钝酶的效果会较差!而在含果胶较少的产品中
使用热力钝酶效果较好% 同时!本研究结果还表明!在
低 SY值下!JJE的稳定性较差!在实际生产加工过程
中可以考虑采用酸处理来降低 JJE的稳定性% 另外!
本研究的结果与其它桃类中 JJE的热稳定性也有较
大差异% 段玉权等 $$(报道中华寿桃 JJE的耐热性较
好!+#O以下较稳定!在 &#O下保温 ,#138 才能使酶
基本丧失活性% 李秀锦 $"(研究表明油桃 JJE活性在
温度高于 )#O时即开始下降!+#O处理 $%138 后 JJE
活性几乎完全丧失% 这种结果差异可能与各研究中所
研究的桃的品种不同!所用底物不同有关%
<"结论
本研究建立了 $ 种高效分离水蜜桃 JJE的纯化
方法!该方法通过疏水层析柱 J6X8<4*IXS62?7@XK` B
)-)离子交换层析柱 /0.0IXS62?7@XD2@TD47\和分子
筛凝胶层析柱 IXS627?<4YLI B"## 三级联用!得到分
子量为 A$ N/2的水蜜桃 JJE% 该方法的总纯化倍数
为 $"G)# 倍!总得率为 "#Q% 酶学特性研究表明!纯
化后的水蜜桃 JJE对水蜜桃中主要酚类物质" h# B
儿茶素有很强的亲和力!该酶与" h# B儿茶素反应的
最适 SY值为 +G#!最适反应温度为 )#O% 同时!研究
结果还表明!纯化后的水蜜桃 JJE与水蜜桃 JJE粗提
物的热稳定性存在较大差异!纯化后的水蜜桃 JJE热
稳定性变差%
参考文献!
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