全 文 ：核 农 学 报　 ２０１３，２７（１１）：１６３０ ～ １６３５
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
收稿日期：２０１３⁃０５⁃０６　 接受日期：２０１３⁃０９⁃０２
基金项目：国家自然科学基金项目（３１１０１５３４），福建省自然科学基金项目（２０１０Ｊ０１１１），福建省农业科学院科技创新团队重点科研项目
（ＣＸＴＤ２０１１ － ２０）。
作者简介：朱海生，男，副研究员，主要从事园艺植物生理生化与分子生物学研究。 Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｚｈｓ０２４６＠ １６３． ｃｏｍ
通讯作者：温庆放，男，研究员，主要从事蔬菜栽培和育种研究。 Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｆｊｖｒｃ＠ １６３． ｃｏｍ
文章编号：１０００⁃８５５１（２０１３）１１⁃１６３０⁃０６
四种草莓病毒 ＳＭｏＶ、ＳＶＢＶ、ＳＣＶ、ＳＭＹＥＶ
多重 ＲＴ⁃ＰＣＲ检测
朱海生１，２，３ 　 花秀凤４ 　 陈敏氡５ 　 温庆放１，２，３
（ １ 福建省农业科学院作物研究所，福建 福州　 ３５００１３；２ 福建省农业科学院蔬菜研究中心，福建 福州　 ３５００１３；
３福建省蔬菜工程技术研究中心，福建 福州　 ３５００１３；４ 福州市蔬菜科学研究所，福建 福州　 ３５００１２；
５福建农林大学园艺学院，福建 福州　 ３５０００２）
摘　 要：我国草莓病毒主要有草莓斑驳病毒（ＳＭｏＶ）、草莓镶脉病毒（ＳＶＢＶ）、草毒皱缩病毒（ＳＣＶ）和草
莓轻型黄边病毒（ＳＭＹＥＶ），通常发生混合侵染。 本研究针对我国 ４ 种草莓病毒的外壳蛋白基因部分序
列设计引物，通过优化多重 ＲＴ⁃ＰＣＲ反应条件，建立起能同时检测 ４ 种草莓病毒的多重 ＲＴ⁃ＰＣＲ 检测体
系。 应用该体系成功对 ４ 种病毒复合侵染的草莓材料进行多重 ＲＴ⁃ＰＣＲ扩增，得到 ２７８、３９４、７３１ 和 ８６１
ｂｐ共 ４ 条特异性条带。 测序结果表明，４ 种病毒序列与相应的参考序列相似性均达 ９８％以上。 对草莓
茎尖脱毒和叶片离体再生的试管苗样品进行检测，结果显示，该方法可以同步、快速、特异地检测出受侵
染寄主植物中的 ４ 种病毒，并且灵敏度高。
关键词：草莓；病毒；多重 ＰＣＲ；检测
　 　 草莓（Ｆｒａｇａｒｉａ × ａｎａｎａｓｓａ Ｄｕｃｈ． ）是一种营养价
值和经济价值较高的园艺植物［１ － ２］，主要靠葡匐茎埋
压及分株提供种苗。 在长期无性繁殖中，很容易感染
多种病毒，从而造成草莓品种的种性退化，一旦感染病
毒便会代代相传，使草莓长势、品质及产量严重下
降［３ － ４］。 据调查，草莓病毒病危害可使草莓减产 ３０％
～８０％ ［５ － ６］，我国因草莓病毒病每年减产 ３５ 万吨，直
接经济损失 ３０ 亿元［７］。 目前已报道侵染草莓的病毒
有 ２０ 多种，其中对生产造成严重损失的病毒病害主要
有四类草莓病毒病原：草莓斑驳病毒（ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ ｍｏｔｔｌｅ
ｖｉｒｕｓ，ＳＭｏＶ）、草莓镶脉病毒（ ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ ｖｅｉｎ ｂａｎｄｉｎｇ
ｖｉｒｕｓ，ＳＶＢＶ）、草毒皱缩病毒（ ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ ｃｒｉｎｋｌｅ ｖｉｒｕｓ，
ＳＣＶ）、草莓轻型黄边病毒（ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ ｍｉｌｄ ｙｅｌｌｏｗ ｅｄｇｅ
ｖｉｒｕｓ，ＳＭＹＥＶ） ［８ － １０］。 推广应用脱毒种苗，可有效防止
病毒病的危害，草莓病毒脱除通常采用茎尖分生组织
法、热处理法、热处理与茎尖分生组织相结合法及花药
愈伤组织再生苗法等［１１ － １４］。
病毒检测手段是病毒研究的一个重要环节，草莓
病毒常规的检测方法有直观测定法、指示植物检测法、
血清学检测、电子显微镜检测法和分子生物学检测
法［１５ － １７］。 以 聚 合 酶 链 式 反 应 （ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ
ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）技术为代表的分子生物学检测技术，检
测病毒具有快速、灵敏等优点，正逐渐成为病毒检测的
主要方法［１６］。 目前已有利用 ＰＣＲ 技术对草莓 ＳＭｏＶ、
ＳＶＢＶ、 ＳＣＶ、 ＳＭＹＥＶ ４ 种 病 毒 进 行 检 测 的 报
道［６，１９，１６ － ２３］。 单重 ＰＣＲ一个反应只能检测一种病毒，
草莓病毒多是复合侵染，利用单重 ＰＣＲ分别对多种病
毒进行系统检测的工作量较大。 多重 ＰＣＲ 技术可在
一次 ＰＣＲ反应中同时检测多种病毒或鉴定病毒的不
同株系，提高检测效率、降低检测成本，是病毒检测的
一个重要发展方向［２３］，草莓上已有运用多重 ＰＣＲ对 ２
种和 ３ 种草莓病毒同时进行了检测报道［６，１１，２３］。 但运
用 ４ 重 ＰＣＲ同时检测草莓 ＳＭｏＶ、ＳＶＢＶ、ＳＣＶ、ＳＭＹＥＶ
４ 种病毒鲜见报道。
本研究旨在针对草莓 ＳＭｏＶ、ＳＶＢＶ、ＳＣＶ、ＳＭＹＥＶ
４ 种病毒，以单一 ＲＴ⁃ＰＣＲ 为基础，通过对反应条件和
０３６１
　 １１ 期 四种草莓病毒 ＳＭｏＶ、ＳＶＢＶ、ＳＣＶ、ＳＭＹＥＶ多重 ＲＴ⁃ＰＣＲ检测
参数的摸索与优化，建立多重 ＲＴ⁃ＰＣＲ 检测方法，实现
４ 种病毒的同时高效快速检测，为草莓病毒检测提供
一种方便、高效的分子学方法，为草莓无病毒苗的实际
生产提供技术支撑。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料
具有典型病毒症状的试验草莓叶片采自福建省农
业科学院作物研究所试验基地，草莓病毒指示植物
ＵＣ５ 和 ＥＭＣ由沈阳农业大学张志宏教授惠赠，保存于
福建省蔬菜工程技术研究中心实验室。
１􀆰 ２　 ＲＮＡ 的提取和反转录
按照百泰克公司通用植物总 ＲＮＡ 提取试剂盒方
法提取草莓总 ＲＮＡ，之后按大连宝生物有限公司的
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ试剂盒的方
法合成 ｃＤＮＡ第一链。
１􀆰 ３　 引物设计
根据 ＧｅｎＢａｎｋ 中 ＳＭｏＶ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．
ＡＪ３１１８７５􀆰 １， ＡＪ３１１８７６􀆰 １ ）、 ＳＭＹＥＶ （ Ｇｅｎｂａｎｋ
Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． Ｄ１２５１７）、ＳＣＶ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．
ＡＹ００５１４６􀆰 １， ＡＹ２５０９８６􀆰 ２ ） 和 ＳＶＢＶ （ Ｇｅｎｂａｎｋ
Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＣ ００１７２５􀆰 １，ＦＭ ８６７８６０􀆰 １）的基因组序
列和文献资料设计引物（表 １），其中 ＳＭＹＥＶ 和 ＳＶＢＶ
引物根据参考文献［１１，２３］设计，ＳＭｏＶ 和 ＳＣＶ 引物为本
实验室设计。
表 １　 多重 ＰＣＲ扩增的病毒特异引物序列
Ｔａｂｌｅ １　 Ｖｉｒｕｓ⁃ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｍｉｅｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＲＴ⁃ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
病毒
Ｖｉｒｕｓ
引物名称
Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅ
引物序列
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５′→３′）
扩增产物大小
Ｐｒｏｄｕｃｔ ｓｉｚｅ（ｂｐ）
ＳＭＹＥＶ ＳＭＹＥＶＦ ＣＣＧＣＴＧＣＡＧＴＴＧＴＡＧＧＧＴＡ ８６１
ＳＭＹＥＶＲ ＣＡＴＧＧＣＡＣＴＣＡＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧ
ＳＣＶ ＳＣＶＦ ＣＴＡＴＴＴＧＧＧＡＴＧＡＣＴＧＡＡＣＴＧＴ ７３１
ＳＣＶＲ ＡＡＴＣＴＧＡＧＣＣＴＣＣＡＴＴＣＣＴＴＧＣ
ＳＭｏＶ ＳＭｏＶＦ ＡＡＣＣＡＴＣＣＡＧＴＡＡＧＣＧＡＣＣＡＣ ３９４
ＳＭｏＶＲ ＴＴＣＡＡＧＧＣＡＣＣＡＣＡＧＡＡＣＣＴＡ
ＳＶＢＶ ＳＶＢＶＦ ＧＡＡＴＧＧＧＡＣＡＡＴＧＡＡＡＴＧＡＧ ２７８
ＳＶＢＶＲ ＡＡＣＣＴＧＴＴＴＣＴＡＧＣＴＴＣＴＴＧ
１􀆰 ４　 单重 ＲＴ⁃ＰＣＲ
ＰＣＲ反应体系为 １μＬ ｃＤＮＡ， ０􀆰 ４ μｍｏｌ·Ｌ － １引物，
２􀆰 ５ｍｍｏｌ·Ｌ － １ ｄＮＴＰ， １Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶，２􀆰 ５ μｌ １０
× ＰＣＲ 缓冲液，加入灭菌的超纯水至 ２５μＬ。 反应程
序为：９４℃预变性 ３ｍｉｎ 后进行下列循环：９４℃变性 ３０
ｓ， ５２℃退火 ３０ ｓ， ７２℃延伸 １ｍｉｎ， ３５ 个循环，最后
７２℃延伸 ７ｍｉｎ。
１􀆰 ５　 多重 ＲＴ⁃ＰＣＲ检测体系优化和建立
在单一 ＲＴ⁃ＰＣＲ的基础上，在同一 ＰＣＲ 反应体系
中同时加入 ４ 对引物进行 ４ 重 ＰＣＲ 反应，对多重 ＲＴ⁃
ＰＣＲ体系中引物浓度（表 ２）、退火温度（５０、５２、５４、５６
和 ５８℃ ）、延伸温度（６８、７０ 和 ７２℃ ）等因素进行比较
试验。
表 ２　 多重 ＲＴ⁃ＰＣＲ引物不同用量组合
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔｓ
病毒
Ｖｉｒｕｓ
浓度设置组合
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｓｅｔｓ
１ ２ ３ ４ ５ ６
ＳＭＹＥＶ ０． ４ ０． ４ ０． ４ ０． ４ ０． ４ ０． ３
ＳＣＶ ０． ４ ０． ５ ０． ５ ０． ５ ０． ５ ０． ５
ＳＭｏＶ ０． ４ ０． ５ ０． ６ ０． ７ ０． ７ ０． ７
ＳＶＢＶ ０． ４ ０． ４ ０． ４ ０． ４ ０． ５ ０． ５
１􀆰 ６　 检测灵敏度测定
将 ＲＮＡ 样品依次稀释 １００、１０ － １、１０ － ２、１０ － ３和
１０ － ４倍后进行反应，检测其灵敏性。
１􀆰 ７　 ＰＣＲ产物序列分析
４ 种病毒 ＰＣＲ扩增产物经 １％的琼脂糖电泳检测
后，回收纯化连接到 ｐＭＤ１８ － Ｔ 载体上，转化大肠杆
菌，挑取阳性克隆子，ＰＣＲ 检测后送公司测序，利用生
物信息学数据库和软件进行分析。
１３６１
核　 农　 学　 报 ２７ 卷
１􀆰 ８　 样品检测
提取茎尖脱毒和叶片离体再生的试管苗草莓总
ＲＮＡ，进行多重 ＲＴ⁃ＰＣＲ 检测，验证多重 ＲＴ⁃ＰＣＲ 检测
效果。
２　 结果与分析
２􀆰 １　 单重 ＰＣＲ电泳检测结果
根据设计的草莓 ＳＭＹＥＶ、ＳＣＶ、ＳＭｏＶ 和 ＳＶＢＶ ４
种病毒的特异引物，以反转录合成的 ｃＤＮＡ为模板，分
别进行 ＰＣＲ 扩增，均能得到单一的清晰条带（图 １），
测序显示 ＳＭＹＥＶ、ＳＣＶ、ＳＭｏＶ、ＳＶＢＶ大小分别为 ８６１、
７３１、３９４ 和 ２７８ ｂｐ，符合预期目标，与 ＧｅｎＢａｎｋ 中已发
表的基因序列相似性在 ９７％ ～ ９９％之间，说明扩增出
的 ４ 条片段为草莓 ４ 种病毒的特异片段。
Ｎｏｔｅ： Ｍ： Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００； １： ＳＭＹＥＶ； ２： ＳＣＶ； ３： ＳＭｏＶ； ４：ＳＶＢＶ．
图 １　 草莓 ４ 种病毒单重 ＰＣＲ
Ｆｉｇ． １　 Ｓｉｍｐｌｅ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｕｒ ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ ｖｉｒｕｓｅｓ
２􀆰 ２　 多重 ＲＴ⁃ＰＣＲ检测体系优化和建立
在单 重 ＲＴ⁃ＰＣＲ 的 基 础 上， 首 先 按 照 ０􀆰 ４
ｕｍｏｌ·Ｌ － １的终浓度等量加入 ４ 对引物，采用 ５２℃的退
火温度，结果显示 ＳＭｏＶ 和 ＳＣＶ 片段较弱（图 ２ 泳道
１），将 ＳＭｏＶ和 ＳＣＶ引物的浓度提高到 ０􀆰 ５μｍｏｌ·Ｌ － １，
其他引物浓度保持不变，结果显示 ＳＣＶ 片段变亮，
ＳＭｏＶ片段仍较弱（图 ２ 泳道 ２），再将 ＳＭｏＶ引物的浓
度提高到 ０􀆰 ６μｍｏｌ·Ｌ － １，结果显示 ＳＭｏＶ 片段亮度有
所加强（图 ２ 泳道 ３）。 在此基础上，进一步调整 ４ 对
引物浓度（图 ２ 泳道 ４、５），最终结果显示当 ＳＭＹＥＶ引
物浓度为 ０􀆰 ３μｍｏｌ·Ｌ － １，ＳＣＶ 为 ０􀆰 ５μｍｏｌ·Ｌ － １，ＳＭｏＶ
为 ０􀆰 ７μｍｏｌ·Ｌ － １，ＳＶＢＶ为 ０􀆰 ５μｍｏｌ·Ｌ － １时多重 ＰＣＲ扩
增效果较好（图 ２ 泳道 ６）。
退火温度试验表明（图 ３），退火温度从 ５０℃到
５８℃都能获得理想的结果，差异不大，只有在退火温度
为 ５０℃ 时，４ 种病毒的目的条带略暗，综合考虑，退火
温度定为 ５４℃。 延伸温度也是一个重要因素，３ 个延
伸温度（６８、７０ 和 ７２℃ ）结果表明（图 ４），７０℃延伸温
度相对较好，也比较稳定。
综合以上研究结果，建立了 ４ 重 ＲＴ⁃ＰＣＲ 反应体
系为 ２５μＬ，其中， ２􀆰 ５μｌ １０ × ＰＣＲ 缓冲液、 １μＬ
ｃＤＮＡ、２􀆰 ５ｍｍｏｌ·Ｌ － １ ｄＮＴＰ、 １Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶、
ＳＭＹＥＶ引物 ０􀆰 ３μｍｏｌ·Ｌ － １、ＳＣＶ 引物 ０􀆰 ５μｍｏｌ·Ｌ － １、
ＳＭｏＶ引物 ０􀆰 ７ μｍｏｌ·Ｌ － １、ＳＶＢＶ引物 ０􀆰 ５ｕｍｏｌ·Ｌ － １，加
入灭菌的超纯水至 ２５μＬ。 反应程序为：９４℃预变性
３ｍｉｎ后进行下列循环：９４℃变性 ３０ ｓ， ５４℃退火 ４０ｓ，
７０℃延伸 １􀆰 ５ｍｉｎ， ３５ 个循环，最后 ７２℃延伸 ７ｍｉｎ。
注：Ｍ： Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００；１ － ６：见表 ２ 中不同浓度组合
Ｎｏｔｅ：Ｍ： Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００；１ － ６：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ．
图 ２　 多重 ＲＴ⁃ＰＣＲ引物浓度优化
Ｆｉｇ． ２　 Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＲＴ⁃ＰＣＲ
２􀆰 ３　 检测灵敏度分析
将 ＲＮＡ样品依次稀释 １００、１０ －１、１０ －２、１０ －３和 １０ －４
倍逆转录后进行多重 ＲＴ⁃ＰＣＲ反应，扩增产物进行 １％
琼脂糖凝胶电泳（图 ５），检测其灵敏性。 在稀释 １０ －２倍
后，扩增出特异条带很清晰，当稀释到 １０ －３和 １０ －４倍
后，仍能扩增出条带，但条带比较微弱。 依据抽提核酸
的样品质量，可以得出 ＳＭＹＥＶ、ＳＣＶ、ＳＭｏＶ 和 ＳＶＢＶ ４
种病毒的检测灵敏度相当于 １０ －２ｍｇ样品组织。
２􀆰 ４　 样品检测
用已建立的多重 ＲＴ⁃ＰＣＲ检测茎尖脱毒和叶片离
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　 １１ 期 四种草莓病毒 ＳＭｏＶ、ＳＶＢＶ、ＳＣＶ、ＳＭＹＥＶ多重 ＲＴ⁃ＰＣＲ检测
Ｎｏｔｅ：Ｍ： Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００；１： ５０℃； ２： ５２℃；
３： ５４℃； ４： ５６℃； ５： ５８℃ ．
图 ３　 多重 ＲＴ⁃ＰＣＲ退火温度优化
Ｆｉｇ． ３　 Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｎｅａｌ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏ
Ｎｏｔｅ： Ｍ： Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００；１： ６８℃； ２： ７０℃； ３：７２℃ ．
图 ４　 多重 ＲＴ⁃ＰＣＲ延伸温度优化
Ｆｉｇ． ４　 Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
体再生的试管苗样品，在 １０ 株茎尖脱毒样品中，７ 株
完全脱出病毒，有 ３ 株脱除效果不彻底，其中 １ 株带有
ＳＭＹＥＶ和 ＳＣＶ 病毒，１ 株带有 ＳＭＹＥＶ、ＳＣＶ 和 ＳＭｏＶ
病毒； ５ 株叶片离体再生样品大部分都带有病毒，３ 株
带有 ４ 种病毒，１ 株带有 ＳＭＹＥＶ、ＳＭｏＶ 和 ＳＶＢＶ ３ 种
病毒（图 ６）。 表明本研究建立的多重 ＲＴ⁃ＰＣＲ 检测体
系可以快速、高效、特异地检测出受侵染寄主植物中 ４
种病毒。
注：Ｍ：ＤＬ ２０００ Ｍａｒｋｅｒ；１：稀释 １００；２：稀释 １０ － １；
３：稀释 １０ － ２；４：稀释 １０ － ３ ５：稀释 １０ － ４。
Ｎｏｔｅ：Ｍ： ＤＬ ２０００ Ｍａｒｋｅｒ； １： １００ ｄｉｌｕｔｉｏｎｓ； ２： １０ － １ ｄｉｌｕｔｉｏｎｓ；
３： １０ － ２ ｄｉｌｕｔｉｏｎｓ； ４： １０ － ３ ｄｉｌｕｔｉｏｎｓ； ５： １０ － ４ ｄｉｌｕｔｉｏｎｓ．
图 ５　 多重 ＲＴ⁃ＰＣＲ敏感性试验
Ｆｉｇ． ５　 Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ＲＴ⁃ＰＣＲ
注：Ｍ：ＤＬ ２０００ Ｍａｒｋｅｒ；１ － ５：叶片离体再生植株；
７ － １６：茎尖培养植株；６：阳性对照；１７：阴性对照。
Ｎｏｔｅ：Ｍ：ＤＬ ２０００ Ｍａｒｋｅｒ；１ － ５：ｍｉｃｒｏｐｌａｎｔ ｆｒｏｍ ｌｅａｖｅ
ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ；７ － １６：ｍｉｃｒｏｐｌａｎｔ ｆｒｏｍ ｓｔｅｍ ｔｉｐ ｃｕｌｔｕｒｅ；
６：ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏ１；１７： Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏ１．
图 ６　 草莓组培苗检测结果
Ｆｉｇ． ６　 Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒｕｓ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ ｐｌａｎｔｌｅｔｓ
３　 讨论
草莓易受到病毒病的侵染，造成生长势衰退、品质
变劣、产量降低等退化现象［１０，２４］。 ＳＭｏＶ、ＳＶＢＶ、ＳＣＶ、
ＳＭＹＥＶ是侵染我国草莓的 ４ 种主要病毒，总侵染率为
８０􀆰 ２％ ，其中单病毒的侵染率达 ４１􀆰 ６％ ，两种以上病
毒的复合侵染率达 ３８􀆰 ６％ ［２５ － ２６］。 采用草莓脱毒种苗
是提高草莓产量和品质，促进草莓产业化的有效途
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核　 农　 学　 报 ２７ 卷
径［２７］。 采用各种脱毒技术所获得的草莓苗并不一定
都能完全脱除病毒，因此，在把这些草莓植株作为生产
无病毒原种苗的母株之前，需要进行无病毒检测鉴
定［４］。 草莓病毒的检测技术是草莓无病毒种苗生产
的关键技术之一，建立快速、准确地草莓病毒检测体系
具有非常重要的意义。 以往草莓病毒检测主要有小叶
嫁接法、酶联免疫吸附分析法等，但均存在局限性［１１］。
核酸水平上的病毒检测技术因具有灵敏度高、特异性
强、适应范围广、不受检测时间的限制和操作简便快速
等优势正逐步成为最实用的病毒检测方法［２１］。
以 ＰＣＲ 为基础的分子生物学技术因其在草莓病
毒检测中具有特异性强、检测快速灵敏和费用相对较
低，适应范围广泛等特点，所以具有广阔的应用前景，
相对于单重 ＰＣＲ，多重 ＰＣＲ同时检测多重病毒可以提
高检测效率、降低检测成本，已经广泛应用到各类动植
物病毒检测上［２８ － ３０］。 草莓上张志宏等［６］应用多重
ＲＴ⁃ＰＣＲ检测了草莓斑驳病毒和草莓轻型黄边病毒，
孙崇波等［１１］、杨洪一等［２３］利用多重 ＲＴ⁃ＰＣＲ 检测了
ＳＭｏＶ、ＳＶＢＶ、ＳＭＹＥＶ ３ 种草莓病毒。 本研究在前人研
究基础上，探索利用多重 ＰＣＲ 同时检测草莓 ＳＭｏＶ、
ＳＶＢＶ、ＳＣＶ、ＳＭＹＥＶ ４ 种病毒。 在多重 ＲＴ⁃ＰＣＲ 反应
中，引物的设计至关重要，它决定着多重 ＰＣＲ 反应的
成功与否［３１］。 本研究在参考相关研究［１１，２３］基础上，
设计草莓 ４ 种病毒特异引物，避免引物之间的相互影
响，同时要尽量使各对引物的退火温度相一致， 扩增
出的条带具有特异性，并且有一定差异，便于直接判定
扩增结果；引物浓度也是影响多重 ＲＴ⁃ＰＣＲ 的一个重
要的因素［３２］，本研究在单重 ＰＣＲ 基础上，对多重 ＲＴ⁃
ＰＣＲ引物浓度进行调整，获得一个合适浓度，同时优
化了反应条件和参数，最终建立多重 ＲＴ⁃ＰＣＲ 检测方
法，实现 ４ 种病毒的同时快速检测，并且具有良好的特
异性和敏感性，为草莓病毒检测供了一条快速、准确的
检测途径，对草莓无病毒苗生产检测技术研究与应用
具有重要意义。
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ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｒｃｈｏｒｕｓ ｇｏｌｄｅｎ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ａ
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ｔｈｅ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ
ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｖｉｒｕｓ， ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ， ａｎｄ ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ ｉｎ
ｐｉｇｓ ［Ｊ］ ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， ２０１３， ２７（３ － ４）： １４９ －
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Ｃ Ｙ， Ｆａｎｇ Ｍ Ｃ， Ｃｈｏｕ Ｊ Ｙ， Ｈｓｉｅｈ Ｓ Ｃ， Ｗａｎ Ｃ Ｈ． Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆｍｉｎｕｔｅ ｖｉｒｕｓ ｏｆ
ｍｉｃｅ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍｉｃｅ ［ Ｊ ］ ．
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Ｓｉｎｇｌｅ⁃ｓｔｅｐ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＲＴ⁃ＰＣＲ ｆｏｒ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ａｎｄ ｃｏｌｏｕｒｉｍｅｔｒｉｃ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｘ ＲＮＡ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ ｏｌｉｖｅ ｔｒｅｅｓ［Ｊ］ ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ
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检测体系的建立［Ｊ］ ． 福建农业学报，２０１２，２７（４）：３６３ － ３６６
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｕｒ ｖｉｒｕｓｅｓ（ＳＭｏＶ、ＳＶＢＶ、ＳＭＹＥＶ ａｎｄ ＳＣＶ）
ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ ｂｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＲＴ⁃ＰＣＲ
ＺＨＵ Ｈａｉ⁃ｓｈｅｎｇ１，２，３ 　 ＨＵＡ Ｘｉｕ⁃ｆｅｎｇ４ 　 ＣＨＥＮ Ｍｉｎ⁃ｄｏｎｇ５ 　 ＷＥＮ Ｑｉｎｇ⁃ｆａｎｇ１，２，３
（ １Ｃｒｏｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｆｕｊｉａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｆｕｚｈｏｕ， Ｆｕｊｉａｎ　 ３５００１３；
２ Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｆｕｊｉａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｆｕｚｈｏｕ， Ｆｕｊｉａｎ　 ３５００１３；
３ Ｆｕｊｉａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ， Ｆｕｚｈｏｕ， Ｆｕｊｉａｎ　 ３５００１３；
４Ｆｕｚｈｏｕ Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｆｕｚｈｏｕ， Ｆｕｊｉａｎ　 ３５００１２；
５Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ， Ｆｕｊｉａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｆｕｚｈｏｕ， Ｆｕｊｉａｎ　 ３５０００２）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ ｐｌａｎｔｓ ａｒｅ ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ Ｍｏｔｔｌｅ Ｖｉｒｕｓ（ＳＭｏＶ）、Ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ Ｖｅｉｎ Ｂａｎｄｉｎｇ Ｖｉｒｕｓ
（ＳＶＢＶ）、Ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ Ｃｒｉｎｋｌｅ Ｖｉｒｕｓ（ＳＣＶ） ａｎｄ Ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ Ｍｉｌｄ Ｙｅｌｌｏｗ Ｅｄｇｅ Ｖｉｒｕｓ（ＳＭＹＥＶ），ａｎｄ ｓｏｍｅｔｉｍｅｓ ｃｏｍｐｌｅｘｌｙ
ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｉｎ Ｃｈｉｎａ． Ｆｏｕｒ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｐａｒｔｉａｌ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ
ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｖｉｒｕｓｅｓ． Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ＳＭｏＶ、ＳＶＢＶ、ＳＣＶ ａｎｄ ＳＭＹＥＶ ｂｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＲＴ⁃ＰＣＲ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ
ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｌｙ ａｄｊｕｓｔｉｎｇ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ＲＴ⁃ＰＣＲ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ． Ｔｈｅ ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ ２７８ ｂｐ （ ＳＶＢＶ）、３９４ ｂｐ
（ＳＭｏＶ）、７３１ ｂｐ（ ＳＣＶ） ａｎｄ ８６１ ｂｐ （ ＳＭＹＥＶ） ｗｅｒｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＲＴ⁃ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ． Ｔｈｅ
ｒｅｓｕｌｔｓ ｖｅｒｉｆｉｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｉｓ ｓｙｓｔｅｍ ｗａｓ ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｆｏｕｒ ｖｉｒｕｓｅｓ ｆｒｏｍ ｍｉｃｒｏｐｌａｎｔ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｔｈｅ
ｓｔｅｍ ｔｉｐ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｌｅａｖｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ；Ｖｉｒｕｓ；Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＲＴ⁃ＰＣＲ；Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
５３６１