全 文 ：核 农 学 报 2015，29 ( 2 ) : 0221 ～ 0228
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
收稿日期: 2014-07-16 接受日期: 2014-11-10
基金项目:国家自然科学基金( 31301319 ) ，教育部重点项目( 211164 )
作者简介:杨宇凤，女，主要从事小麦遗传育种研究。E-mail: yufeng0650@ 126． com
通讯作者:彭正松，男，教授，主要从事小麦遗传育种研究。E-mail: pzs8833@ 163． com
文章编号: 1000-8551 ( 2015 ) 02-0221-08
小麦 B类 MADS-box基因 WPI1 和 WPI2 的
克隆及表达分析
杨宇凤 彭正松 杨在君 魏淑红 廖明莉 王育伟 王清海 杨 会
( 西华师范大学 /西南野生动植物资源保护省部共建教育部重点实验室，四川 南充 637009 )
摘 要:为探究小麦雌蕊化现象的分子遗传机制，本文从 CSTP 和 HTS-1 2 个小麦品系的幼穗中克隆得到
了 2 个 B 类 MADS-box 基因 WPI1 和 WPI2。WPI1 基因 cDNA 序列长 816 bp，OＲF 长 627 bp，编码 208
个氨基酸残基 ; WPI2 基因 cDNA 序列长 983 bp，OＲF 长 630 bp，编码 209 个氨基酸残基。WPI1 和 WPI2
基因均含有典型的 MADS-MEF2-like 和 K-box 结构域，C 端均具有 PI 结构基序。系统进化树分析表明
WPI1 和 WPI2 基因属于 PI /GLO 亚家族成员。Ｒeal-time PCＲ 分析表明 WPI1 和 WPI2 基因在 CSTP 和
HTS-1 小穗中的表达模式明显不同。雌雄蕊原基形成期，WPI1 和 WPI2 基因在 HTS-1 中的表达量较高，
而在 CSTP 中表达量较低，接近为 0 ;药隔期，WPI1 和 WPI2 基因在 HTS-1 中的表达水平明显低于 CSTP
中的表达。WPI1 和 WPI2 基因表达模式的改变与 HTS-1 雌蕊化表型有关。本研究结果为进一步探讨 B
类基因 WPI1 和 WPI2 在 HTS-1 雌蕊化中的作用奠定了基础。
关键词:小麦 ;花器官发育; MADS-box 基因 ;基因克隆 ;基因表达
DOI: 10. 11869 / j． issn． 100-8551. 2015. 02． 0221
生殖生长是高等植物生活史的一个重要阶段，开
花植物生殖生长的主要执行器官—花器官的形成发育
机理一直倍受研究者的关注［1］。花器官的发育由特
定的基因控制，把这些相关基因称为同源异型基因。
1991 年 Coen 等［2］提出花器官发育的“ABC 模型”，认
为花器官的发育由 3 类基因控制，分别是控制萼片和
花瓣发育的 A 功能基因，控制花瓣和雄蕊发育的 B 功
能基因，以及控制雄蕊和心皮发育的 C 功能基因，其
中 A、C 功能基因相互抑制，B 功能基因的表达则与 A、
C 功能基因的表达相互独立。随后在矮牵牛花和拟南
芥中又发现了发现了控制胚珠发育的 D 功能基因，以
及几乎参与所有花器官发育的 E 功能基因［3 － 5］，至此
“ABC 模型”扩展为“ABCDE 模型”［6］。由于 E 类基
因功能的复杂多样性，Theiβen 等［7］在 2001 年又提出
了“四因子模型 ( floral quartet model ) ”。ABCDE 模型
中大部分基因属于 MADS-box 基因，它们编码的转录
因子调控不同基因的表达［8 － 9］。在植物中已知功能的
MADS-box 基因均属于 Type II 类型。该类型的基因由
保守程度各不相同的 MADS-box、I、K 和 C 结构域构
成，因而又叫做 MIKC-type MADS-box 基因［10 － 11］，并且
这些基因在花器官发育过程中起着调控作用［12 － 15］。
目前，在小麦中已经克隆得到的 MADS-box 基因
包括 13 个 MIKCc型 MADS-box 亚家族基因。其中 B
功能基因包括 3 支 : AP3 /DEF 亚家族 ( TaMADS 51、
TaMADS 82 和 TaAP3 ) ，PI /GLO 亚家族 ( WPI1、WPI2、
TaPI-1 和 TaPI-2 ) ，以及 GGM13 亚家族，又称 为
Bsister( Bs) 亚家族基因［16］。Hama 等［17］从山羊草属
异质小麦［( cr ) -CSdt7BS］中克隆得到 WPI1 和 WPI2
基因，认为 WPI1 和 WPI2 基因表达模式的改变会导致
［( cr ) -CSdt7BS］小麦雌蕊化。此外，研究报道认为
WPI1 和 WPI2 基因分别与水稻 OsMADS4 和 OsMADS2
基因同源，抑制 OsMADS2 和 OsMADS4 基因的表达会
导致水稻雄蕊同源转化为雌蕊［18］。
普通小麦雄蕊雌蕊化突变体 HTS-1 是在中国春
三雌蕊近等基因系 CSTP 群体中发现的雄蕊同源转化
为雌蕊的小麦花发育突变体［19］，它同时具有三雌蕊和
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雄蕊同源转化为雌蕊 2 种突变性状。HTS-1 不含外源
细胞质，雄蕊同源转化与核质互作无关［20 － 21］，它与早
期核质互作雄蕊同源转化为雌蕊的小麦完全不
同［22 － 23］，这方便单独研究细胞核基因对雄蕊雌蕊化的
作用。
本研究从小麦雄蕊同源转化为雌蕊突变体 HTS-1
和其姊妹系 CSTP 的幼穗中分别克隆得到了 WPI1 和
WPI2 2 个基因的 cDNA 序列，并进行了生物信息学分
析。通过实时荧光定量 PCＲ 技术初步检测了这 2 个
基因的表达模式。研究结果为进一步探讨 WPI1、
WPI2 基因在花器官发育过程中的作用以及深入研究
小麦雄蕊同源转化为雌蕊的分子机制提供了参考依
据。
1 材料和方法
1. 1 材料
本试验以中国春三雌蕊近等基因系 CSTP［19］和雄
蕊雌蕊化突变体 HTS-1 作为研究材料。分别于孕穗
期取上述 CSTP 和 HTS-1 的幼穗 ( 穗长小于 10 mm ) ，
浸入 ＲNA 保存液中，液氮速冻后，－ 70℃保存，供克隆
WPI1、WPI2 基因所用。分 3 个时期选取上述 2 种材
料的幼穗 : 二棱期至小花分化期 ( 幼穗长约 2 ～ 5
mm) ，雌雄蕊原基分化期 ( 幼穗长约 5 ～ 7 mm ) ，药隔
时期( 幼穗长约 7 ～ 10 mm) ［24］，处理方法同上，供实时
荧光定量 PCＲ 所用。
1. 2 方法
1. 2. 1 总 ＲNA 的提取和 cDNA 的制备 总 ＲNA 的
提取按照 EZgeneTM Plant Easy Spin ＲNA Miniprep Kit
( Biomiga 公司，美国) 试剂盒说明书进行，将所得 ＲNA
溶解在 DEPC-treated ddH2O 中。然后用 1%琼脂糖凝
胶电泳和 NANODＲOP 2 000c 检测 ＲNA 的浓度和纯
度，－ 70℃保存备用。
分别以 CSTP 和 HTS-1 幼穗的 ＲNA 为模板，按
PrimeScriptTM ＲT Ｒeagent Kit ( perfect real time )
( TaKaＲa 公司，中国) 试剂盒说明书进行反转录，得到
CSTP 和 HTS-1 幼穗的 cDNA。
1. 2. 2 cDNA 克隆测序 基于 GenBank 登录号为
AB107991 和 AB107992 的序列，通过 Premier5. 0 软件
设计扩增 WPI1、WPI2 基因完整 OＲF 的引物 WPI1-1
和 WPI2-1，其序列如表 1。
采用 20 μL 反应体系进行 PCＲ 扩增，成分分别
是 : 2 × Taq PCＲ MasterMix 10 μL，上下游引物各 1 μL，
cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL。反应条件是 : 94℃ 预变性
5 min; 94℃变性 30 s，52℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，
40 个循环 ; 72℃ 继续延伸 10 min; 4℃ 保存。用含有
0. 5 × TBE 缓冲液的 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测克隆
产物。切胶回收，与 pMD19-T 载体连接。将重组质粒
导入 DH5α 感受态细胞，涂布于含 100 μg·mL － 1
Amp +，24μg·mL － 1 IPTG 和 40μg·mL － 1 X-gal 的 LB 固
体培养基上，37℃培养。每个材料挑取 10 个阳性克隆
培养，菌液送至中国北京中美泰和生物技术公司测序。
1. 2. 3 序列分析与系统发育的构建 获得的 cDNA
序列利用 NCBI 在线软件 OＲF Finder ( http: / /www．
ncbi． nlm． nih． gov / gorf / gorf． html) 进行开放阅读框的
分析。使用 DNAMAN 软件进行氨基酸序列比对。运
用 BLAST 搜索同源基因，使用 ClustalX 1. 83 软件进行
多重序列比对，再使用 MEGA5. 0 软件中的邻近相连
法构建系统发育树，并进行 Bootstrap 检测。
1. 2. 4 实时荧光定量 PCＲ ( Ｒeal-time PCＲ) 检测 应
用 Primer Express 2. 0 软件设计定量引物 WPI1-2、
WPI2-2，以及作为内参基因的 Actin ( AB181991 ) 和
Ubiq ( DQ086482 ) ［25 － 26］引物，引物序列如表 1。
表 1 用于 cDNA 克隆和荧光定量的引物序列
Table 1 Sequences of primer for cDNA cloning
and real-time PCＲ /bp
名称
Name
序列
Sequence
片段长度
Length / bp
WPI1-1F 5-GCTCCTGGGT CCTCTTTC-3 816
WPI1-1Ｒ 5-CAACTAGCGG TGTTAAGTTC AT-3
WPI2-1F 5-GGGATGAGAA ACACAAGAGC CT-3 983
WPI2-1Ｒ 5-CAAACTATTC ACCGTCCAGC AA-3
WPI1-2F 5-TCCTGTGGGACGAGAAGCA-3 109
WPI1-2Ｒ 5-TTCACATCCTCGCCTTTCATA-3
WPI2-2F 5-CAGGCTCGTGAAACATGGTAA-3 112
WPI2-2Ｒ 5-CCCAAGCTCAAGATCCCTCAT-3
Actin-F 5-ACGCTTCCTCATGCTATCCTTC-3 121
Actin － Ｒ 5-ATGTCTCTGACAATTTCCCGCT-3
Ubiq － F 5-AAGGCGAAGATCCAGGACAAG-3 107
Ubiq-Ｒ 5-TGGATGTTGTAGTCCGCCAAG-3
采用荧光染料法进行实时荧光定量表达分析，具
体按照 SsoFastTM EvaGreen Supermix ( BIO-ＲAD公司，
美国) 试剂盒操作说明，在 Bio-Ｒad 公司 BIO-ＲAD
CFX96BIO-ＲAD CFX96 Ｒeal-Time PCＲ 仪上完成，每
个试验重复 3 次。通过溶解曲线和扩增曲线确定各引
物的退火温度 ;根据不同浓度的 cDNA 在引物最适 Tm
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2 期 小麦 B 类 MADS-box 基因 WPI1 和 WPI2 的克隆及表达分析
值下的扩增结果构建标准曲线，确定每个引物的扩增
效率( E) 和相关系数 ( Ｒ2 ) ; 最后检测基因在小穗不同
发育阶段的表达量。使用 BIO-ＲAD CFX- 96 Ｒeal-
Time PCＲ 软件，输入各引物 E 值，选定 Actin 和 Ubiq
为内参基因，采用 2 － ΔΔCt法计算 WPI1 和 WPI2 的相对
表达量［27］。
2 结果与分析
2. 1 WPI1、WPI2 基因序列分析
以 CSTP 和 HTS-1 幼穗( 穗长小于 10 mm) ＲNA 为
模板进行反转录，再以反转录产物为模板进行 PCＲ 扩
增，克隆得到 WPI1 和 WPI2 基因序列 ( 图 1 ) 。WPI1
和 WPI2 基因在 CSTP 和 HTS-1 共 2 个材料中分别挑
取 10 个克隆进行测序，测序后比较发现 10 个序列相
似性达到 100%，所以在 2 个材料中各取 1 个序列进
行分析。
将克隆得到的 WPI1 和 WPI2 的一致性序列分别
与 GenBank 中报道的小麦基因 WPI1 ( AB107991 ) 和
WPI2 ( AB107992 ) 进行比较，结果表明相似性达到
99. 36%和 99. 68%，认为克隆得到的序列即为 WPI1
和 WPI2 基因。本试验从 CSTP 和 HTS-1 中克隆得到
WPI1 和 WPI2 基因共 4 条序列，其中 2 条 WPI1 基因
cDNA 序列长度均为 816 bp，2 条 WPI2 基因 cDNA 序
列长度均为 983 bp。WPI1 基因开放阅读框 ( OＲF ) 长
为 627 bp，含有 49 bp 的 5非翻译区和 40 bp 的 3非翻
译区。WPI2 基因开放阅读框( OＲF) 长为 630 bp，含有
46 bp 的 5非翻译区和 107 bp 的 3非翻译区。对
CSTP 和 HTS-1 中克隆得到的 2 个基因序列分别进行
相似性分析，结果表明 WPI1、WPI2 基因在 2 种材料中
序列相似性均达到 100%。
2. 2 WPI1、WPI2 氨基酸序列同源性比较
在 CSTP 和 HTS-1 中克隆得到的 WPI1 基因的开放
阅读框( OＲF) 627 bp，编码 208 个氨基酸残基，WPI2 基
因的开放阅读框( OＲF) 长为 630 bp，编码 209 个氨基酸
残基。将 WPI1 和 WPI2 基因推测的氨基酸序列与其它
来源于不同物种的 PI /GLO 亚家族基因氨基酸序列进
行多序列比对，结果表明，WPI1 和 WPI2 基因氨基酸序
列具有植物 MADS-box 蛋白典型的 MIKC 结构域; 1 个
保守的 MADS-MEF2-like 结构域，1 个半保守 K 结构域
( K-box) 和 1 个可变的 C 区。C 端还发现了确定 B 类
PI /GLO 家 族 MADS-box 基 因 的 PI 结 构 基 序，即
MPFxFＲVPxQPNLQE［28］，说明 WPI1 和 WPI2 基因属于
MADS-Box 基因家族的 PI /GLO 亚家族基因( 图 2) 。
Note: M． DL2000 DNA marker，1． WPI1-CSTP，
2． WPI1-HTS-1，3． WPI2-CSTP，4． WPI2-HTS-1．
图 1 WPI1 和 WPI2 基因扩增
Fig． 1 Amplification profile of the putative
fragment of WPI1 and WPI2 genes
运用 DNAMAN 软件，将 WPI1 和 WPI2 基因推测
的氨基酸序列分别与水稻、玉米的氨基酸序列进行同
源性比较，结果表明 WPI1 和 WPI2 编码的蛋白分别与
水稻和玉米的 2 个 PI 类基因 OsMADS4、OsMADS2 和
ZMM18、ZMM16 的同源性分别是 82. 55%、85. 85%和
77. 83%、86. 32%。
2. 3 WPI1、WPI2 基因的系统进化分析
为了了解克隆得到的 WPI1、WPI2 基因与 B 类基
因家族中其它类型基因的关系，本试验重建了系统发
育树 ( 图 3 ) 。结果表明 B 类基因分为 AP3 /DEF 和
PI /GLO 2 个分支，每个分支又通过进化形成单子叶和
双子叶植物 2 个亚支。WPI1 和 WPI2 聚集在 B 功能
基因的 PI /GLO 分支，与水稻、玉米单子叶植物聚在一
起，构成了单子叶植物亚支。结果表明，WPI1、WPI2
蛋白属于 MADS-Box 蛋白家族的单子叶植物 PI /GLO
亚家族，分别与水稻的 OsMADS4 和 OsMADS2 以及玉
米的 ZMM18 /29 和 ZMM16 亲缘关系相近。这与氨基
酸序列同源性分析结果相同。
2. 4 WPI1、WPI2 基因实时荧光定量 PCＲ( Ｒeal-time
PCＲ) 分析
利用表 1 的引物，通过实时荧光定量 PCＲ 方法，
采用 2一 △△CT计算方法，本试验研究了 WPI1、WPI2 基
因在 CSTP 和 HTS-1 小穗各发育时期的表达模式。
如图 4 所示，WPI1 基因和 WPI2 基因在 CSTP 和
HTS-1 中均有一定的表达量。WPI1 基因在正常小麦
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图 2 WPI1、WPI2 氨基酸序列比对
Fig． 2 The amino acid sequences alignment of WPI1，WPI2 genes
CSTP 和雌蕊化小麦 HTS-1 中的表达量差异明显。
WPI1 基因在 HTS-1 幼穗的各时期均有表达，且表达量
相近，但是从雌雄蕊原基发育时期 ( 穗长 2 ～ 5 mm ) 至
药隔时期( 穗长 7 ～ 10 mm ) ，其表达量总体呈现下降
趋势。而在 CSTP 幼穗各时期 WPI1 基因的表达量差
异很大，在二棱期至小花分化期( 穗长 2 ～ 5 mm ) WPI1
基因表达量较高;但是在雌雄蕊原基发育时期 ( 穗长 5
～ 7 mm) WPI1 基因的表达量明显下降，其表达水平接
近为零，远远低于其在 HTS-1 中的表达量 ; 药隔时期
( 穗长 7 ～ 10 mm ) WPI1 基因的表达量迅速升高达到
最高水平，且此时期 CSTP 中 WPI1 基因的表达水平约
为 HTS-1 中的 2 倍。
WPI2 基因在 CSTP 和 HTS-1 的表达模式类似于
WPI1 基因，但其整体的表达量要低于 WPI1 基因。
WPI2 基因在 HTS-1 幼穗各时期中的表达水平差异不
大，随着小穗穗长的加长，表达量呈上升趋势。进一步
分析发现，在 CSTP 中 WPI2 基因的表达水平随着小穗
穗长的增加，表达量呈现出先下降后升高的趋势，并且
在雄蕊原基发育时期没有检测到表达量，但是 HTS-1
幼穗的同一阶段 WPI2 基因却有较高的表达量。在药
隔时期，WPI2 基因的表达水平达到最高，几乎是 HTS-
1 中 WPI2 基因表达量的 2 倍。
3 讨论
近年来已经从拟南芥、金鱼草和矮牵牛花等模式
植物中克隆得到大量 MADS-Box 基因，在植物花发育
过程中这些基因具有重要的调节作用［29 － 30］。本试验
克隆得到了 2 个 MADS-Box 基因 WPI1 和 WPI2。氨基
酸序列比对、蛋白结构域比对以及系统进化树分析均
显示这 2 个基因都属于 ABCDE 模型中的 B 功能基
因，为 MADS-Box 基因中的 PI /GLO 亚家族成员。基
于拟南芥、金鱼草建立起来的 ABC 模型认为 : B 类基
因在花的第 2、3 轮发育中表达。在拟南芥中控制花瓣
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2 期 小麦 B 类 MADS-box 基因 WPI1 和 WPI2 的克隆及表达分析
注 : 各节点处数值表示 Bootstrap 值 ( 重复 1000 次 ) 。涉及的基因序列有 : 小麦 TaMADS51，TaMADS82 ( BAA33459. 1，BAD15367. 1 ) ; 水稻的
OsMADS2，OsMADS4，OsMADS16 ( AAB52709. 1，AAC05723. 1，AAD19872. 1 ) ; 玉米 SILKY1，ZMM16，ZMM18，ZMM29 ( AAF59838. 1，Q9AＲ51，
Q9AＲ50，Q9AＲ49 ) ; 拟南芥 PI，AP3 ( BAA06465. 1，BAA04665. 1 ) ; 金鱼草 GLO，DEF ( Q03378，P23706 ) ; 矮牵牛花 pMADS2 ( Q07474 ) ; 洋葱
AcPI( AFX61409. 1 ) ; 风信子 HoMADS2 ( AAD22493. 2 ) ; 郁金香 TGGLO ( BAC75972. 1 ) ; 蝴蝶兰 PeMADS6 ( AAV83997. 1 ) ; 藏红花 CsatPIC1
( ABB22780. 1 ) ; 芥菜 BjPI( AAY63867. 1 ) ; 番茄 TPI( ABG73411. 1 ) ; 辣椒 PPI( ADＲ83606. 1 ) 。
Note : The numbers next to the nodes give bootstrap values of 1000 replicates． The B group MADS-box genes listed in the tree are as follows: Triticum
aestivum L． ( TaMADS51， BAA33459. 1． TaMADS82， BAD15367. 1 ) ． Oryza sativa ( OsMADS2， AAB52709. 1． OsMADS4， AAC05723. 1．
OsMADS16，AAD19872. 1 ) ． Zea mays ( SILKY1，AAF59838. 1． ZMM16，Q9AＲ51． ZMM18，Q9AＲ50． ZMM29，Q9AＲ49 ) ． Arabidopsis thaliana
( PI，BAA06465. 1． AP3，BAA04665. 1 ) ． Antirrhinum majus L． ( GLO，Q03378． DEF，P23706 ) ． Petunia hybrida Vilm ( pMADS2，Q07474 ) ．
Allium cepa ( AcPI，AFX61409. 1 ) ． Hyacinthus orientalis ( HoMADS2，AAD22493. 2 ) ． Tulipa gesneriana ( TGGLO，BAC75972. 1 ) ． Phalaenopsis
equestris ( PeMADS6，AAV83997. 1 ) ． Crocus sativus ( CsatPIC1，ABB22780. 1 ) ． Brassica juncea ( BjPI; AAY63867. 1 ) ． Solanum lycopersicum
( TPI，ABG73411. 1 ) ; Capsicum annuum ( PPI，ADＲ83606. 1 ) ．
图 3 不同植物 AP3 /DEF 类和 PI /GLO 类 MADS-box 基因系统进化树
Fig． 3 Phylogenetic analysis of AP3 /DEF-like and PI /GLO-like MADS-box genes in plant species
和雄蕊发育的 B 功能基因为 APETALA3 ( AP3 ) 和
PISTILLATA( PI) ［31 － 32］，AP3 或者 PI 基因的突变均会
导致花瓣萼片化，雄蕊心皮化［33］。迄今为止，已经从
拟南芥［Arabidopsis thaliana ( L． ) Heynh．］、金鱼草
( Antirrhinum majus L． ) 、矮牵牛花 ( Petunia hybrida
Vilm) 、洋葱( Allium cepa L． ) 、水稻( Oryza stativa L． ) 、
玉米 ( Zea mays L． ) 、小麦 ( Triticum aestivum L． ) 等植
物中克隆得到了 B 功能基因。
本试验中克隆得到的 WPI1、WPI2 基因 cDNA 和
开放阅读框 ( OＲF ) 序列比对结果表明，在 CSTP 和
HTS-1 中克隆得到的 2 条 WPI1 基因 OＲF 序列及推导
氨基酸序列完全相同，对 WPI2 基因比对也得到相同
的结果。这表明，HTS-1 的雌蕊化表型并不是由于
WPI1 和 WPI2 基因在 2 个材料中序列上的差异所致。
氨基酸序列比对结果表明 WPI1 蛋白和 WPI2 蛋
白与其他禾本科单子叶植物的 PI /GLO 亚家族蛋白具
有较高的同源性，与拟南芥 PI、金鱼草 GLO、矮牵牛花
pMADS2 蛋白的同源性分别为 48. 2% 和 48. 2%、
50. 9%和 53. 15%、45. 95% 和 46. 85%。聚类分析结
果表明，WPI1 和 WPI2 聚集在 B 功能基因 PI /GLO 分
支，与水稻、玉米的 PI /GLO 亚家族基因聚在一起，形
成单子叶植物 PI /GLO 亚支。WPI1 基因与水稻
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注 : 2 ～ 5 mm: 二棱期至小花分化期 ; 5 ～ 7 mm: 雌雄蕊原基形成
期 : 7 ～ 10 mm． 药隔期。
Note: 2 ～ 5 mm: Double ridge stage to floret differentiation stage． 5 ～
7 mm: Pistil and stamen primordiuxn formation stage． 7 ～ 10 mm:
Anther seperation stage．
图 4 WPI1 和 WPI2 基因在小穗
不同发育阶段的表达模式
Fig． 4 Ｒelative expression levels of
WPI1 and WPI2 genes
OsMADS4 和玉米 ZMM18 /29 基因聚为一支，WPI2 分
别与水稻 OsMADS2 和玉米 ZMM16 基因聚为一支，推
测 WPI1 与 OsMADS4 和 ZMM18 /29，WPI2 与 OsMADS2
和 ZMM16 为直系同源基因，这与 Hama 等［17］的研究
结果一致。Hong-Guy 等［34］研究认为，OsMADS4 主要
在浆片和雄蕊原基中表达，而 OsMADS2 在浆片原基中
的表达量高于在雄蕊原基中的表达 ; Northern 杂交和
原位杂交结果表明，ZMM18 /16 /29 在玉米小穗整个发
育过程中都在浆片、雄蕊和心皮中表达。在拟南芥中，
AP3 和 PI 编码的蛋白质还能形成异质二聚体，共同控
制花瓣和雄蕊的发育［35］。水稻中酵母双杂交分析表
明，SPW1 与 OsMADS2 和 OsMADS4 都能形成异质二聚
体［36］，并且 SPW1 功能缺失和双重抑制 OsMADS2 和
OsMADS4 都会导致雄蕊心皮化，说明在水稻中 SPW1
与 OsMADS2、OsMADS4 在决定雄蕊发育过程中起着同
等重要的作用。玉米中，DEF /AP3 类基因 Silky1 突变
体也会导致雄蕊心皮化。本研究中，WPI1 和 WPI2 基
因在花发育过程中的作用; 与水稻、玉米的 PI /GLO 基
因的表达模式是否相似 ; 它们在参与雄蕊发育的过程
中是否与小麦中的 DEF /AP3 类基因 TaAP3 有关 ; 这 2
个基因在中国春三雌蕊近等基因系 CSTP 和 HTS-1 中
的表达模式有何异同 ; 它们与 HTS-1 雌蕊化的产生相
互关系等问题都有待于进一步研究。
本研究中采用 Ｒeal-time PCＲ 探讨了 WPI1、WPI2
在 CSTP 和 HTS-1 花发育过程中的表达模式。WPI1
基因在 CSTP 和 HTS-1 幼穗不同发育时期均有一定水
平的表达，WPI1 基因在正常小麦 CSTP 中的表达量呈
现先增再减再增加的趋势，而在雌蕊化的 HTS-1 中，
WPI1 基因在幼穗发育不同时期的表达量趋于平衡。
在雌雄蕊原基形成期，CSTP 幼穗中 WPI1 基因呈现极
低水平的表达量，但在雌蕊化材料 HTS-1 中 WPI1 基
因的表达量相对较高，约是 CSTP 的 7 倍，这说明 WPI1
基因在 CSTP 和 HTS-1 中的表达模式发生了改变。
Meguro 等［37］研究表明基因表达模式的改变会导致雄
蕊心皮化。由此推测，HTS-1 雌蕊化现象与 WPI1 基因
表达模式的改变有一定关系，WPI1 基因在 HTS-1 雌雄
蕊原基形成过程中起重要作用，可能在这一时期导致
雄蕊同源转变为雌蕊。Hama 等［17］对雌蕊化的异质小
麦研究表明，雌蕊化的出现是由于 WPI1 基因在第 3
轮器官发育中表达缺陷所导致。这些结果说明，WPI1
基因的表达水平与小麦雌蕊化有关，只是在不同遗传
背景的雌蕊化小麦中表达模式不同。在药隔时期，
WPI1 基因在 CSTP 中的表达量相对较高，约为 HTS-1
中表达量的 2 倍。已有研究结果表明，HTS-1 在雄蕊
同源转化为雌蕊后，其花药发育受到影响，花粉粒少，
或者出现发育不正常的花粉粒，且花粉育性远远低于
CSTP 花粉育性［38］，这可能与 WPI1 基因在 HTS-1 药隔
期幼穗表达量相对较低有直接关系。
WPI2 基因在 CSTP 和 HTS-1 中的表达模式与
WPI1 基因相似，因此推测 WPI2 基因表达模式的改变
也与 HTS-1 雌蕊化表型有关。
HTS-1 是一个新颖的小麦花发育突变体。本研究
结果表明，WPI1 和 WPI2 表达模式的改变与 HTS-1 雌
蕊化表型有关。WPI1 和 WPI2 基因在 HTS-1 花发育
中的具体功能，还有待于进一步研究，并最终为阐明
HTS-1 雄蕊同源转化为雌蕊的分子调控机理奠定基
础。
4 结论
本研究以中国春三粒近等基因系 ( CSTP ) 和其姊
妹系 HTS-1 为材料，从中克隆得到了 2 个 MADS-box
基因 WPI1 和 WPI2 完整的开放阅读框，其蛋白序列均
具有典型的植物 MADS-box 蛋白结构域。序列比对和
系统进化树分析表明，WPI1 和 WPI2 基因与禾本科植
物 B 类 PI /GLO 同源基因亲缘关系较近，聚为单子叶
植物亚支。实时荧光定量 PCＲ 表明，在 HTS-1 幼穗雌
622
2 期 小麦 B 类 MADS-box 基因 WPI1 和 WPI2 的克隆及表达分析
雄蕊原基形成期和药隔时期，WPI1 和 WPI2 基因的表
达模式都与其在 CSTP 中的表达明显不同，WPI1 和
WPI2 在 HTS-1 中表达模式的改变与其雌蕊化现象有
关。
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Cloning and Expression Analysis of Class-B MADS-box Genes
WPI1 and WPI2 in Wheat
YANG Yufeng PENG Zhengsong YANG Zaijun WEI Shuhong LIAO Mingli
WANG Yuwei WANG Qinghai YANG Hui
( Key Laboratory of Southwest China Wildlife Ｒesources Conservation Ministry of Education /
China West Normal University，Nanchong，Sichuan 637009 )
Abstract: To study the molecular and genetic mechanisms of pistillody in wheat，two B-class genes，WPI1 and WPI2
were cloned from CSTP and HTS-1 in this study． Sequence alignment results showed that the cloned cDNA of WPI1 and
WPI2 was 816 bp and 983 bp in length，respectively． WPI1 gene contains a 627 bp open reading frame ( OＲF) which
encodes 208 amino acids． WPI2 gene contains a 630 bp open reading frame ( OＲF ) which encodes 209 amino acids．
Alignment of the predicted amino acid sequences from WPI1 and WPI2 genes，as well as with that from previously
published subfamily members，revealed the MADS-MEF2-like and K-box domains． In the two WPI genes，the consensus
PI motif was found in the C-terminal region． Phylogenetic tree reconstructed clearly showed that these proteins were
classed into PI /GLO subgroup of B class MADS-box protein family． Ｒeal-time PCＲ analysis indicated that the expression
patterns of WPI1 and WPI2 genes are significantly different in spikelet of CSTP and HTS-1． In pistil and stamen
primordiuxn formation stage the expression levels of WPI1 and WPI2 are higher in HTS-1 than CSTP，the latter is close
to zero． In contrast，in anther seperation stage the expression levels of WPI1 and WPI2 are lower in HTS-1 than CSTP，
obviously． WPI1 and WPI2 genes may be bound up with pistillody of HTS-1． The study provides more insights for future
research the functions of B-class genes WPI1 and WPI2．
Keywords: wheat，floral organ development，MADS-box gene，gene cloning，gene expression
822