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The Comparision on the Antioxidant Activities of Methanol Crude Extracts From Three Tropical Fruit Tree Leaves

3种热带果树叶子甲醇粗提物的抗氧化活性比较


为了研究热带果树的抗氧化活性,以木菠萝、人心果和龙眼叶为原料,经75%甲醇超声辅助提取,得到3种提取物。分别采用Folin-Ciocalteau 法和分光光度法测定总酚和类黄酮含量;以维生素C 为对照,分别测定各提取物对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·)、自由基阳离子(ABTS+·)、铁离子和钼离子的还原能力及金属螯合能力。结果表明:人心果叶、木菠萝叶和龙眼叶都具有较强的清除DPPH和ABTS自由基能力、对铁离子和钼离子还原能力和金属螯合能力,其中人心果叶活性最强,龙眼叶最弱,且抗氧化活性与总酚含量存在显著的相关性。人心果叶、木菠萝叶和龙眼叶是较好的抗氧化原料,将具有广阔的应用价值和利用前景。


全 文 :  核 农 学 报  2015,29(1):0095 ~ 0100
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
收稿日期:2014⁃05⁃14  接受日期:2014⁃10⁃21
基金项目:中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(1630062013002),农业生态环境保护项目(No:1251216305015)
作者简介:张秀梅,女,副研究员,主要从事功能成分的研究。 E⁃mail:asiazhang1975@ 163. com
通讯作者:同第一作者。
文章编号:1000⁃8551(2015)01⁃0095⁃06
3 种热带果树叶子甲醇粗提物的抗氧化活性比较
张秀梅  骆党委  朱祝英  刘玉革  杜丽清
(中国热带农业科学院南亚热带作物研究所 /农业部热带果树生物学重点实验室,广东 湛江  524091)
摘  要:为了研究热带果树的抗氧化活性,以木菠萝、人心果和龙眼叶为原料,经 75%甲醇超声辅助提
取,得到 3 种提取物。 分别采用 Folin⁃Ciocalteau 法和分光光度法测定总酚和类黄酮含量;以维生素 C 为
对照,分别测定各提取物对 1,1⁃二苯基⁃2⁃三硝基苯肼自由基(DPPH·)、自由基阳离子(ABTS +·)、铁离
子和钼离子的还原能力及金属螯合能力。 结果表明:人心果叶、木菠萝叶和龙眼叶都具有较强的清除
DPPH和 ABTS自由基能力、对铁离子和钼离子还原能力和金属螯合能力,其中人心果叶活性最强,龙眼
叶最弱,且抗氧化活性与总酚含量存在显著的相关性。 人心果叶、木菠萝叶和龙眼叶是较好的抗氧化原
料,将具有广阔的应用价值和利用前景。
关键词:叶片;多酚;类黄酮;抗氧化活性
DOI:10􀆰 11869 / j. issn. 100⁃8551􀆰 2015􀆰 01. 0095
    自由基及其诱导的氧化反应是导致生物衰老和人
体多种疾病的主要起因之一[1]。 随着自由基和抗氧
化理论研究的深入,其中一些合成抗氧化剂的副作用
暴露后,天然抗氧化剂的开发和应用越来越受到人们
的重视。 植物多酚主要包括酚酸类、黄酮类、花青素
类,这些次生代谢产物具有抗炎抗菌、清除自由基等活
性[2],还可通过抑制氧化酶和络合过渡金属离子等起
到抗氧化作用[3],许多酚类物质的抗氧化性甚至强于
天然抗氧化剂 -维生素[4 - 5]。 近年来,多种果蔬等植
物材料[6 - 9]的抗氧化活性研究受到国内外研究者的广
泛关注。 齐高强等[10]和房玉林等[11]采用超声波辅助
技术分别提取山杏种皮和石榴皮中的多酚物质;Pan
等[12]采用微波辅助技术提取苹果渣中的多酚物质;艾
志录等[13]研究微波辅助提取苹果渣多酚的工艺;彭芍
单等[14]研究对木菠萝果实不同部位的抗氧化性;覃伟
权等[15 - 17]报道了菠萝蜜乙醇提取物对小菜蛾的产卵
和拒食作用,及活性分离物对小菜蛾自然种群的控制
作用;李安平等[18]对人心果果实的抗氧化活性进行初
步研究。 但鲜见对热带果树人心果叶、木菠萝叶和龙
眼叶的体外抗氧化活性的研究报道。 本研究以多酚含
量较高的热带果树木菠萝 ( Artocarpus heterophyllus
Lam. )、人 心 果 ( Manilkara zapota Linn. ) 和 龙 眼
(Dimocarpus longan Lour. )叶为原料,经 75%甲醇超声
提取,旋蒸、冷冻干燥后得到不同提取物,比较其多酚、
类黄酮含量及其抗氧化活性,为抗氧化成分的分离、鉴
定及抗氧化产品的开发利用提供一定的理论依据,也
为医学、营养学和食品加工合理取材提供参考。
1  材料与方法
1􀆰 1  材料与仪器
1􀆰 1􀆰 1  材料  克里斯特人心果、马来一号木菠萝和石
峡龙眼的成熟叶片均采自广东湛江南亚热带作物研究
所,采后用自来水冲洗干净,自然风干,粉碎后备用。
甲醇、正己烷、丙酮、乙腈、乙酸乙酯等有机溶剂均
为色谱级试剂。 福林 - 乔卡试剂 ( Folin⁃Ciocalteau
reagent)、1,1 - 二苯基苦基笨肼 ( DPPH)、生育酚
(Trolox)等购自美国 sigma 公司;没食子酸、维生素 C
(Vc)、醋酸钾、七水合硫酸亚铁等常规试剂均为国产
分析纯试剂。
1􀆰 1􀆰 2  设备  SpectraMax Plus384 紫外可见分光光度
计(美国 Molecular Devices 公司),CP225 型电子天平
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核  农  学  报 29 卷
(德国 sartorius 公司);7890 气相色谱仪(美国 Agilent
公司);MICROMAX型离心机(美国 Thermo 公司);多
转子的磁力搅拌器(意大利 VELP 公司);E⁃2000 型旋
转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)。
1􀆰 2  方法
1􀆰 2􀆰 1  提取物的制备  将粉碎后的木菠萝、人心果和
龙眼叶,用 75%甲醇溶液,以料液比 1 ∶ 9于 40℃超声
辅助提取 2 次,每次 1h。 水浴后 60 000r·min - 1离心
10 min,合并上清液,减压浓缩冷冻干燥 (美国
Labconco公司),得到粗提物后,进行抗氧化性与抗氧
化物质含量的测定,每份样品重复测定 3 次。
1􀆰 2􀆰 2  总酚的测定  参照 Jang 等[19]的方法,样品粗
提物用 75%的甲醇溶解,得到粗提液,取 0􀆰 1 mL 提取
液于试管中,与稀释 10 倍的福林 -乔卡试剂(Folin⁃
ciocalteu)混合,在黑暗处反应 5 min,然后再加入 0􀆰 75
mL的碳酸氢钠,在 25℃下放置 90 min,以提取剂为对
照,在波长 750 nm处测定吸光度值。
1􀆰 2􀆰 3  类黄酮的测定  参照 Kim等[20]的方法,取 0􀆰 1
mL 提取液于试管中,先后加入 0􀆰 3 mL 5% NaNO2 溶液
和 4 mL的蒸馏水,反应 6 min,0􀆰 3 mL 10% AlCl3 溶液,
反应 6 min,2􀆰 0 mL 1 mol·L -1 NaOH 溶液,用蒸馏水定
容到 10 mL,混匀静置 10 min后,60 000r·min -1离心 10
min,收集上清液,以提取试剂为对照,用紫外分光光度
计测定 506 nm波长处的吸光度,计算类黄酮含量。
1􀆰 2􀆰 4  DPPH法测定抗氧化能力  参照 Ma 等[21]的方
法,不同质量浓度[1、2􀆰 5、5 g·(100 L) -1]的粗提液 0􀆰 1
mL分别加入 2 mL 6􀆰 25 ×10 -5mol·L -1 DPPH甲醇溶液
中,暗处反应 30 min,以甲醇溶剂做空白对照,测量其在
波长 517 nm 处的吸光度(Ai)。 测定 2 mL DPPH 甲醇
溶液与 0􀆰 1 mL 甲醇混合后在波长 517 nm 处的吸光度
(A0);测定 2 mL甲醇溶液与 0􀆰 1 mL 样品液在波长 517
nm 处的吸光度(Aj)。 计算自由基清除率。
1􀆰 2􀆰 5  自由基阳离子(ABTS +·)法测定抗氧化能力
  参照 Re 等[22]的方法,将等量的 7 mmol·L - 1 ABTS
[2,2⁃联氮⁃双⁃(3⁃乙基苯并噻唑啉⁃6⁃磺酸)]溶液与
2􀆰 45 mmol·L - 1过硫酸钾混合使之反应并置于暗处 12
~ 16 h 以制备 ABTS +·。用甲醇将 ABTS +·溶液稀释直
至其在波长734 nm 处吸光度为 0􀆰 70 ± 0􀆰 02。 将 25
μL样品液加入 2 mL ABTS +·溶液中以稀释,6 min 后
测量其在波长 734 nm 处的吸光度(Ai)。 测定 2 mL
ABTS +·溶液与25 μL 甲醇混合后在波长 517 nm 处的
吸光度(A0);测定 2 mL 甲醇溶液与 25 μL 样品液在
波长 517 nm处的吸光度(Aj)。 计算自由基清除率。
1􀆰 2􀆰 6  以铁离子还原法(FRAP)测定抗氧化能力  参
照 Benzie 等[23]的方法,取 10 μL 上清液,加入 1􀆰 8 mL
TPTZ(2,4,6⁃三吡啶基三嗪)工作液(由 0􀆰 3 mol·L -1醋
酸盐缓冲液,10 mmol·L -1 TPTZ 溶液,20 mmol·L -1
FeCl3 溶液组成),混匀后 37℃反应 10 min,测定 593 nm
波长处的吸光度。 另以不同浓度(0、100、200、400、800、
1 200、2 000 mmol·L -1)的 FeSO4做标准曲线。 样品抗
氧化活性(FRAP 值)以每克干质量达到同样吸光度所
需的 FeSO4毫摩尔数表示(mmolFeSO4·g -1)。
1􀆰 2􀆰 7  以金属螯合能力法(MCC)测定抗氧化能力 
参照 Dinis 等[24]的方法,将 1 mL 的提取液加入 2􀆰 8
mL 蒸 馏 水 中, 再 与 50 μL 的 2 mmol·L - 1 的
FeCl2·4H2O 和 150 μL 的 2 mmol·L - 1 Ferrozine,振荡
混合。 10 min 后,在波长 562 nm 处测量亚铁离子⁃
Ferrozine 联合体的生成量以确定 Fe2 +的量。 同时以
0􀆰 1 mg·mL - 1 EDTA 做对照。
1􀆰 2􀆰 8  钼酸铵体系法(PMC)测定抗氧化活性  参照
Prieto等[25]方法,将 1 mL的提取液(100 μg·mL - 1)加
入 1 mL反应液(由 0􀆰 6 mL 98%的硫酸,28 mM 磷酸
钠,4 mM 钼酸铵组成),混合后于 95℃水浴反应 90
min,待样品冷却至室温后测定 695 nm处的吸光度值。
1􀆰 3  数据分析
所有数据采用 Excel 2003 软件进行处理。 用 SAS
9􀆰 2 系统进行差异显著性分析和相关性分析。
2  结果与分析
2􀆰 1  不同提取物的总酚和类黄酮含量
由表 1 可知,人心果叶的总酚含量最高,为
11􀆰 97% ,显著高于木菠萝叶和龙眼叶,龙眼叶最低
(4􀆰 95% )。 类黄酮含量由高到低依次为木菠萝叶、人
心果叶和龙眼叶,但人心果叶和龙眼叶之间的差异不
显著。
表 1  不同样品的总酚和类黄酮含量
Table 1  The total polyphenol and flavonoid contents
in the extract of different samples (􀭵x ± se)
含量
Content / %
木菠萝叶
Jackfruit leaf
人心果叶
Naseberry leaf
龙眼叶
Longan leaf
总酚
Total polyphenol 6􀆰 63 ± 0􀆰 43b 11􀆰 97 ± 0􀆰 11a 4􀆰 95 ± 0􀆰 15c
总黄酮
Total flavonoid 18􀆰 25 ± 0􀆰 74a 11􀆰 51 ± 0􀆰 12b 10􀆰 82 ± 1􀆰 23b
    注:不同字母表示差异显著(P < 0􀆰 05)。
Note: Different letters MEAN significant difference of 0􀆰 05 level. The
same as following.
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  1 期 三种热带果树叶子甲醇粗提物的抗氧化活性比较
2􀆰 2  不同提取物清除 DPPH·能力
DPPH 自由基是一种很稳定的以氮为中心的紫色
自由基,在 517 nm 处有最大吸收,且其浓度与吸光度
呈线性关系[26]。 该检测方法简单、快速、灵敏,目前被
广泛应用于测定天然植物及食品等体外抗氧化能力。
由图 1 可知,不同提取物的清除能力都随着浓度的增
加而不断增强,清除能力由高到低的顺序为 Vc、人心
果叶、木菠萝叶和龙眼叶。 对照维生素 C的 IC50值(清
除率达到 50%时的样品浓度)为 0􀆰 01005 mg·mL - 1,
而人心果叶提取物 IC50值为 0􀆰 058 9 mg·mL - 1,木菠萝
叶提取物的 IC50值为 0􀆰 1058 mg·mL - 1,龙眼叶的 IC50
值为 0􀆰 139 mg·mL - 1。 说明人心果叶具有极强的清除
DPPH自由基能力。
图 1  不同种类提取物对 DPPH自由基的清除能力
Fig. 1  DPPH radical scavenging activity from
the different extracts
2􀆰 3  不同提取物清除 ABTS +·的能力
在有过氧化物或过硫化物存在的情况下,ABTS
能够被氧化成绿色的 ABTS +自由基,在 734 nm 处有
吸收,当有抗氧化物质存在的时候,能够提供氢供体,
使之吸光值下降,下降程度与抗氧化物质的抗氧化活
性相关,从而判断抗氧化活性的强弱[27]。 由图 2 可
知,不同提取物都有较强的清除 ABTS 自由基的能力,
且随着浓度的增加逐渐增强。 其中,人心果提取物的
活性最强( IC50 5􀆰 8730 μg·mL - 1 ),当浓度达到 17􀆰 5
μg·mL - 1时,清除率已达到 100% ,其次为木菠萝叶
(IC50 13􀆰 029 4 μg·mL - 1),龙眼叶( IC50 16􀆰 222 2 μg·
mL - 1)。
2􀆰 4  不同提取物的总抗氧化能力
在一定的条件下, 抗氧化剂能够将 Fe3 +还原为
Fe2 + ,Fe2 + 与 TPTZ 结合生成蓝色化合物,在波长
593nm处有最大光吸收。 根据吸光度大小计算样品抗
氧化活性的强弱,吸光度越大,表明抗氧化剂有越强的
图 2  不同种类提取物对 ABTS自由基的清除能力
Fig. 2  ABTS radical scavenging activity from
the different extracts
还原能力,因而具有越高的抗氧化活性[28]。 由表 2 可
知,不同提取物的铁离子还原能力由高到低依次是人
心果、木菠萝叶和龙眼叶,且人心果的还原能力接近
Vc,说明人心果叶子有很强的供电子能力,是一种很
好的抗氧化剂原料。
表 2  不同种类提取物的抗氧化能力 /金属螯合能力
Table 2  Total antioxidant activity and ferrous ions
chealting capacity from the
different extracts(􀭵x ± s)
材料
Material
FRAP 值
FRAP Value /
(mmol
FeSO4·g - 1)
金属螯合能力
MCC / %
钼酸铵体系
PMC / %
龙眼叶
Longan leaf 0􀆰 90 ± 0􀆰 02c 9􀆰 42 ± 1􀆰 02a 41􀆰 3584 ± 1􀆰 87d
木菠萝叶
Jackfruit leaf 0􀆰 93 ± 0􀆰 09c 10􀆰 86 ± 1􀆰 02a 49􀆰 9433 ± 1􀆰 73c
人心果叶
Naseberry leaf 2􀆰 40 ± 0􀆰 05b 12􀆰 31 ± 1􀆰 02a 82􀆰 9622 ± 2􀆰 27b
维生素 C Vc 2􀆰 49 ± 0􀆰 02a 13􀆰 04 ± 1􀆰 44a 105􀆰 3081 ± 0􀆰 07a
2􀆰 5  不同提取物的金属螯合能力
Ferrozine 能够与 Fe2 +形成紫红色的螯合物,当其
他有竞争力的螯合剂存在时,紫红色会变浅。 因此,通
过螯合物颜色的变化,可以评价物质对 Fe2 +的螯合能
力。 由表 2 可知,提取液浓度为 0􀆰 02 g·mL - 1时,人心
果叶、木菠萝叶和龙眼叶对 Fe2 + 的螯合率分别为
12􀆰 31% 、10􀆰 86%和 9􀆰 42% ,而 0􀆰 01 mg·mL - 1的维生
素 C 的金属螯合率为 13􀆰 04% ,表明不同提取物均有
较强的金属螯合能力。
2􀆰 6  不同提取物在钼酸铵体系中的抗氧化能力
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核  农  学  报 29 卷
在一定的条件下, 抗氧化剂能够将 Mo3 +还原为
Mo2 + , Mo2 +与磷酸盐结合生成绿色化合物,在波长
695nm处有最大光吸收[29]。 由表 2 可见,对照及提取
物的钼离子还原能力由强至弱依次为:维生素 C、人心
果叶、木菠萝叶和龙眼叶。 人心果叶的还原能力显著
高于木菠萝叶和龙眼叶,说明人心果叶的还原能力最
强。
表 3  不同活性成分与抗氧化能力及不同抗氧化性方法之间的相关性分析
Table 3  Correlation coefficients between composition and antioxidant capacity and correlation coefficients
amongst the different methods in different extracts
指标 Index TP TF DPPH ABTS FRAP MCC PMC
TP 1􀆰 00
TF - 0􀆰 1928 1􀆰 00
DPPH -0􀆰 9886∗∗ 0􀆰 1012 1􀆰 00
ABTS - 0􀆰 9939∗∗ 0􀆰 1100 0􀆰 9899∗∗ 1􀆰 00
FRAP 0􀆰 9638∗∗ - 0􀆰 4270 - 0􀆰 9334∗∗ - 0􀆰 9443∗∗ 1􀆰 00
MCC 0􀆰 8449∗ 0􀆰 1482 - 0􀆰 8263∗ - 0􀆰 9773∗ 0􀆰 7338 1􀆰 00
PMC 0􀆰 9886∗∗ - 0􀆰 2668 - 0􀆰 9806∗∗ - 0􀆰 9829∗∗ 0􀆰 9832∗∗ 0􀆰 7960 1􀆰 00
    注:∗代表相关性显著(p < 0􀆰 05),∗∗代表相关性极显著(p < 0􀆰 01)。
Note:∗Correlation is significant at the 0􀆰 05 level. ∗∗Correlation is significant at the 0􀆰 01 level.
2􀆰 7  相关性分析
由表 3 可知,总酚含量与 DPPH、ABTS、FRAP 和
PMC活性之间呈极显著相关性,与 MCC 之间呈显著
相关性,与类黄酮含量没有显著相关性( r = 0􀆰 1928);
类黄酮含量与所分析的任何一种抗氧化方法之间都没
有相关性;DPPH与 ABTS和 FRAP方法之间均表现出
显著或极显著相关性;MCC与 FRAP和 PMC均没有显
著相关性。
3  讨论
前人评价体外抗氧化活性的方法较多,但大多是
针对某一种自由基的清除活性,不同评价体系,反应原
理、评价的侧重点都不同,评价结果有时也会存在很大
差异,不能代表样品其他自由基的清除能力或总抗氧
化活性。 因此,本研究采用 5 种方法来评价不同材料
的抗氧化性更有说服力。
本试验采用 DPPH、ABTS、FRAP、金属螯合能力评
价方法研究不同树种的叶片提取物的抗氧化性发现,3
种提取物均具有较强的抗氧化性,尤其是人心果叶。
清除自由基的能力及金属螯合能力都为 Vc >人心果
叶 >木菠萝叶 >龙眼叶;总酚含量与抗氧化活性方法
之间有显著正相关。 由此可见,多酚在 3 种不同提取
物的抗氧化活性中起着主要作用,这与 Hassimotto
等[30]和 Sun等[31]的结果一致。 李倩等[32]对马铃薯的
研究表明,DPPH 法测得的结果与 FRAP 法、ABTS 法
所得结果不具有相关性。 而本研究结果表明,DPPH、
ABTS和 FRAP方法之间均有极显著相关性,说明不同
材料之间的多酚、维生素 C、黄酮类化合物的种类和含
量有差异。 俞坚[33]对桑叶的研究也发现,芦丁具有较
好的抗亚油酸的氧化能力,且明显强于山奈素,但其清
除 DPPH ·的能力最差,远远低于山奈素; Ferreres
等[34]在研究甘蓝叶中多酚提取物的抗氧化活性时也
有类似的结果。 因为 1 种方法只是针对某一特性及其
机理进行分析,所以在评价某种材料的抗氧化活性时
要使用多种评价体系,才能综合考虑其抗氧化能力。
综上所述,人心果叶、木菠萝叶和龙眼叶是很好的
天然抗氧化剂或天然抗氧化物质的原料,尤其是人心
果叶,将具有广阔的应用价值和开发利用前景。 人心
果叶、木菠萝叶和龙眼叶的抗氧化能力不仅与多酚含
量有关,同时还与多酚种类有关。 但具体作用机理还
有待进一步分析其主要化合物种类及含量并进行系统
研究。
4  结论
本研究表明 3 种叶子提取物的总酚含量由高到低
依次为人心果叶、木菠萝叶和龙眼叶;木菠萝叶的类黄
酮含量最高为 18􀆰 85% ,人心果叶(11􀆰 51% )和龙眼叶
(10􀆰 82% ) 次之。 3 种提取物均具有较强的清除
DPPH和 ABTS自由基的能力,且对铁离子和钼离子的
还原能力也较强。 3 种提取物的总酚含量与抗氧化性
有显著相关性,与类黄酮含量无密切关系。
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  1 期 三种热带果树叶子甲醇粗提物的抗氧化活性比较
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2015,29(1):0095 ~ 0100
The Comparision on the Antioxidant Activities of Methanol Crude
Extracts From Three Tropical Fruit Tree Leaves
ZHANG Xiumei  LUO Dangwei  ZHU Zhuying  LIU Yuge  DU Liqing
(Key Laboratory of Tropical Fruit Biology of Ministry of Agriculture / The South Subtropical
Crop Research Institute,Chinese Academy of Tropical Agricultural Science, Zhanjiang, Guangdong  524091)
Abstract:The aim of this study is to investigate the antioxidant activity of tropical fruits by using the leaves of naseberry,
jackfruit and longan as experimental materials. The three materials were extracted by using 75% methanol to determine
their antioxidant activities and phenolics. The total polyphenol and flavonids contents of the extracts were measured by
Folin⁃Ciocalteu method and a spectrophotometric method, respectively. Their antioxidant activities were determined by
DPPH, ABTS, FRAP, and MCC assays,and PMC system method. The results showed that those extracts had strong free
radical scavenging ability, metal chealting capacity and reducing power. The antioxidant capacities of the extracts in the
order from high to low was naseberry leaves > jackfruit leaves > longan leaves. The antioxidant activity of extracts were
correlated with their total polyphenol contents. In general, the three leaves, especially naseberry leaf, are rich sources
of natural antioxidants, which will has great practical value and utilization prospect.
Keywords:leaf, phenolics, flavonids, antioxidant activity
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