全 文 ：核 农 学 报　 ２０１４，２８（６）：１０９２ ～ １０９８
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
收稿日期：２０１４⁃０２⁃２１　 接受日期：２０１４⁃０４⁃３０
基金项目：中国博士后科学基金项目（２０１２Ｍ５２０６０１， ２０１３Ｔ６０２６７），山西农业大学博士后基金（９２４６２），山西省科技攻关项目（２０１３０３１１０２８ － ３）
作者简介：陈剑杰，男，主要从事兽医公共卫生研究。 Ｅ⁃ｍａｉｌ：７１０４２５６４９＠ ｑｑ． ｃｏｍ
通讯作者：曹谨玲， 女， 副教授，主要从事水生生理与毒理学研究。 Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｃａｏｊｉｎｌｉｎｇ７９２８＠ ａｌｉｙｕｎ． ｃｏｍ
文章编号：１０００⁃８５５１（２０１４）０６⁃１０９２⁃０７
氟对鲤鱼鳃组织免疫相关酶及 ＩＬ － １β表达影响
陈剑杰　 曹谨玲１ 　 罗永巨２ 　 古少鹏１
（ １山西农业大学动物科技学院 ／山西省生态畜牧与环境兽医学重点实验室， 山西 太谷　 ０３０８０１；
２ 广西水产科学研究院，广西 南宁　 ５３００２１）
摘　 要：以鲤鱼为受试材料，研究水环境中氟对其血液和鳃组织免疫相关酶 ＡＣＰ、ＡＫＰ、ＳＯＤ、ＣＡＴ 的活
性，ＮＢＴ阳性细胞数量及白细胞介素 － １β（ ＩＬ － １β）蛋白表达的影响。 结果显示，在不同浓度氟化钠（０、
４０、８０、１２０ ｍｇ·Ｌ － １）暴露 ３０ ｄ后，与对照组比较，鲤鱼血液中、鳃组织中的氟含量都有增加，且呈一定的
剂量效应关系；鲤鱼血清中免疫相关酶 ＡＣＰ和 ＡＫＰ活性低于对照组，且在 ８０、１２０ｍｇ·Ｌ － １显著低于对照
组，ＳＯＤ、ＣＡＴ活性在 １２０ｍｇ·Ｌ － １显著低于对照组；鲤鱼鳃中免疫相关酶 ＡＣＰ、ＡＫＰ、ＳＯＤ、ＣＡＴ低浓度组
活性较高，而高浓度组较低，且均在 １２０ ｍｇ·Ｌ － １显著低于对照组；随着水环境氟暴露浓度的升高，鲤鱼
ＮＢＴ阳性细胞数量均较对照组低、鲤鱼鳃组织中的 ＩＬ － １β蛋白表达也均较对照组低。 ＣＯＲＲＥＬ相关分
析结果显示，水氟暴露浓度与鲤鱼免疫相关酶活性 ＡＣＰ、ＡＫＰ、ＳＯＤ、ＣＡＴ 活性和 ＩＬ － １β 蛋白表达呈一
定的剂量效应关系。 实验结果表明：水环境中氟可在一定程度上对鲤鱼鳃免疫能力产生抑制作用。
关键词：鲤鱼；血清；鳃；免疫；ＩＬ － １β蛋白表达
ＤＯＩ：１０􀆰 １１８６９ ／ ｊ． ｉｓｓｎ． １００⁃８５５１􀆰 ２０１４􀆰 ０６． １０９２
　 　 水体中的污染物对鱼类免疫机制影响的研究是鱼
类健康养殖研究的重要领域之一。 早在 ８０ 年代初，
Ｚｅｅｍａｎ等［１］就阐述了水体中有毒物质对鱼类免疫系
统的影响。 氟作为机体生命活动必需的微量元素，具
有多方面的生理功能，但是如果摄氟量过高，将对机体
产生一系列毒副作用［２ － ３］。 水中氟含量过高对人类的
毒性效应研究已经受到高度重视，迄今为止已有大量
的研究报道［４ － ５］，为深入研究氟中毒奠定了理论基础。
而鱼类终生生活在水中，可以直接从水中吸收氟，是较
易受到氟毒害的靶生物，Ｂｈａｔｎａｇａｒ 等［６］研究了氟对水
生生物包括鱼类存在的毒害效应。 虽然氟对鱼类的毒
性作用国内外已经有了一些研究［６ － ９］，但氟对鱼鳃免
疫功能方面的毒性作用却鲜有报道。 鳃作为鱼类重要
的呼吸器官，参与气体交换、酸碱平衡、离子运输和含
氮废物的排泄等生理活动，鳃与水环境直接接触，容易
因水体污染而受到损伤，其结构和生理变化可以有效
指示水体受污染的程度，可直接反映污染物对鱼的毒
害程度，因而是评估污染物对鱼类毒性效应的主要靶
器官之一［１０］。
本研究选择中国淡水水体中常见的鲤鱼作为受试
生物，研究氟对鲤鱼鳃免疫相关酶及 ＩＬ － １β蛋白表达
的影响。 以期为进一步研究氟化物对鱼类的免疫毒性
作用及水环境污染监测提供理论依据。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 试验动物
试验用鱼购自无污染源的渔场，所购鲤鱼均来自
同一鱼池，平均体重为（３８􀆰 ７３ ± ５􀆰 ０９） ｇ，经 ５％食盐
水消毒后进入实验室。
１􀆰 ２　 主要仪器与试剂
氟化钠（天津市科密欧化学试剂有限公司）；氯化
硝基四氮唑兰（ＮＢＴ）（南京探求生物技术）；兔抗鱼 ＩＬ
－ １β多克隆抗体（上海研拓生物科技有限公司）；辣
根过氧化物酶标羊抗兔 ＩｇＧ（天津百浩生物科技有限
公司）；ＤＡＢ显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公
２９０１
　 ６ 期 氟对鲤鱼鳃组织免疫相关酶及 ＩＬ － １β表达影响
司）；ＡＵＹ１２０ 型电子分析天平 （日本岛津公司）；ＰＸＳ
－ ２１５ 型氟离子计检测仪（上海越磁电子科技有限公
司）；ＪＹ３００Ｃ型通用型电泳仪（北京君意东方）；ＪＹＯ４Ｓ
－ ３Ｃ型凝胶成像分析系统（北京君意东方）；ＴＹ － ８０Ｓ
型脱色摇床（金坛良友实验仪器厂）；ＴＧＬ － １６Ｒ 台式
高速冷冻离心机（珠海黑马医学仪器有限公司）；酸性
磷酸酶（ＡＣＰ）、碱性磷酸酶（ＡＫＰ）、超氧化物歧化酶
（ＳＯＤ）、过氧化氢酶（ＣＡＴ）试剂盒购自南京建成生物
工程研究所； ＴＢＳＴ（Ｔｒｉｓ⁃Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ ａｎｄ Ｔｗｅｅｎ ２０）
购自北京九州天瑞科技有限公司；其余试剂均为分析
纯级。
１􀆰 ３　 试验分组与染毒
鱼类染毒采用静态水质接触染毒法。 试验所用水
为曝气的自来水，通过水化学成分分析，水体中的重金
属浓度几乎为零或者不能被检出，水质能够满足渔业
水质标准。 根据文献［７，１１］且在保证受试鱼体不死
亡为前提下，故试验浓度的选择在 ９６ｈ⁃ＬＣ５０ 值的 １ ／ ２
以下，配制的终浓度分别为 ０、４０、８０、１２０ ｍｇ·Ｌ － １，每
个浓度设 ２ 个平行，每个平行放入 ３０ 尾鲤鱼，在体积
为 ３００ Ｌ 的水族箱中分别配制上述各浓度的试验液
２００ Ｌ。 试验时每天更换试验用水 １ ／ ２，以使试验期间
浓度基本一致。 期间用充气泵连续充气，每天定时投
喂饵料，水温控制在（２３ ± １）℃，自然光照，试验连续
进行 ３０ ｄ，期间每 ５ ｄ 换一次水，并彻底清洗水族箱，
每天定期用离子选择电极法监测氟浓度［１２］，并保持水
体中氟化浓度的恒定。
１􀆰 ４　 测定指标及方法
１􀆰 ４􀆰 １　 血清及血细胞的收集　 试验结束后，每个平行
组取 ３ 尾鱼，将 ６ 次测定的平均值作为最终结果。 将
取出待测的鱼用清水冲洗，擦干其表面后，尾静脉采
血，一部分直接加入到灭菌 １􀆰 ５ ｍＬ离心管中以制备血
清，用于免疫相关酶活性及氟含量的测定，为避免酶失
活，全部过程置于 ０℃冰水浴中进行。 另一部分用肝
素抗凝，取血细胞用于 ＮＢＴ阳性细胞的测定。
１􀆰 ４􀆰 ２　 鳃样品的收集 　 采血后分离鱼鳃，一部分用
４℃的生理盐水冲洗干净后用吸水纸吸干水分，称取 １
ｇ组织块，加入 ９ 倍体积的生理盐水冰浴匀浆，３０００
ｒ ／ ｍｉｎ － １离心 １０ ｍｉｎ，取上清液 ４℃保存备用。 用于测
定免疫相关酶活性及氟的含量，另一部分研磨后马上
放入液氮中速冻，然后 － ８０℃暂存，用于 ＩＬ － １β 的检
测。
１􀆰 ４􀆰 ３　 免疫相关酶活性的测定 　 把 １􀆰 ４􀆰 １ 和 １􀆰 ４􀆰 ２
制备的用于免疫相关酶活性检测的血清和鳃组织样
品，使用南京建成生物试剂盒进行测定，方法是可见分
光光度法［１３］。
超氧化物歧化酶（ＳＯＤ） 活性测定：通过黄嘌呤及
黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，后者
氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂作用下呈现紫色。
在 ５５０ｎｍ处测吸光度值后通过公式计算出样品中的
ＳＯＤ 活力。
过氧化氢酶（ＣＡＴ）活性测定：ＣＡＴ 分解 Ｈ２Ｏ２ 的
反应通过加入钼酸铵反应中止，剩余的 Ｈ２Ｏ２ 与钼酸
铵作用产生一种淡黄色的络合物，在 ４０５ ｎｍ 处测定其
生成量，可计算出 ＣＡＴ 活力。
酸性磷酸酶（ＡＣＰ）活性测定：酸性磷酸酶分解磷
酸苯二钠，产生游离酚和磷酸，酚在酸性溶液中与 ４ －
氨基安替吡啉作用经铁氰化钾氧化生成红色醌衍生
物，在 ５２０ｎｍ处测吸光度值，可计算出酶活力。
碱性磷酸酶（ＡＫＰ）活性测定：碱性磷酸酶分解磷
酸苯二钠，产生游离酚和磷酸，酚在碱性溶液中与 ４ －
氨基安替吡啉作用经铁氰化钾氧化生成红色醌衍生
物，在 ５２０ｎｍ处测吸光度值，可计算出酶活力。
１􀆰 ４􀆰 ４　 ＮＢＴ阳细胞的检测［１４］ 　 取 ５０ μＬ血细胞滴于
盖玻片上，在湿盒中 ２０℃温育 ３０ ｍｉｎ，然后用 ０􀆰 ０６７
ｍｏｌ·Ｌ － １ ＰＢＳ（ｐＨ６􀆰 ４）轻轻地洗涤盖玻片以完全去除
红细胞。 在载玻片上滴加 ５０ μＬ ０􀆰 ２ ｇ·Ｌ － １ ＮＢＴ 溶液
（无菌生理盐水配置），将盖玻片反扣在 ＮＢＴ 溶液上，
湿盒中孵育 ３０ ｍｉｎ，１０ × ４０ 倍显微镜下观察结果，细
胞染成浅黑色的为 ＮＢＴ阳性细胞。
１􀆰 ４􀆰 ５　 氟含量的测定［１２］ 　 血清中的氟的测定采用离
子选择电极法。 鱼鳃灰化后，用离子计测定鳃氟含量。
１􀆰 ４􀆰 ６　 鳃 ＩＬ － １β蛋白表达的测定［１５］ 　 ＩＬ － １β 蛋白
的检测采用蛋白质印迹法（ＷＢ）分析。 取 ０􀆰 １ ｇ 鳃组
织，按组织净重∶裂解液 ＝ １∶ １０ 的比例，加入相应体积
的裂解液并匀浆，移入离心管 ４℃、１００００ ｒ·ｍｉｎ － １离心
１０ ｍｉｎ，收集上清液分装于小试管中 － ２０℃保存，并测
定蛋白质浓度。 取相同质量的细胞裂解液，加入等体
积的 ２ ×电泳加样缓冲液，沸水浴中 ３ ｍｉｎ，然后进行
ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ电泳，电泳结束后，进行蛋白质转膜。 将硝
酸纤维膜移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床
上摇动封闭 １ ｈ，将一抗用封闭液稀释 ５００ 倍加到膜上
放入封闭袋。 ４℃孵育过夜，用 ＴＢＳＴ 缓冲液在室温下
脱色摇床上洗 ２ 次，每次 ５ ｍｉｎ，再用 ＴＢＳ缓冲液洗 １０
ｍｉｎ。 在培养皿内加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔
ＩｇＧ １０ ｍＬ（１∶ ５ ０００，ＴＢＳＴ 缓冲液稀释），室温摇床上
孵育 ４５ ｍｉｎ，最后进行 ＤＡＢ显色和成像显影。 拍照后
用凝胶图像处理系统分析 ＩＬ － １β 和 β － ａｃｔｉｎ 的灰度
值，以 ＩＬ － １β ／ β － ａｃｔｉｎ作为 ＩＬ － １β的相对表达水平。
３９０１
核　 农　 学　 报 ２８ 卷
１􀆰 ５　 数据处理
试验数据用 ＳＰＳＳ １３􀆰 ０ 版软件进行单因素方差分
析处理，并用 ＣＯＲＲＥＬ进行相关性分析。
２　 结果与分析
２􀆰 １　 鲤鱼血液和鳃中的氟含量比较
不同浓度氟暴露 ３０ｄ后鲤鱼血清和鳃中氟含量见
图 １。 由图 １ 可见，不同浓度氟化钠水溶液中暴露 ３０
ｄ后，鲤鱼血氟、鳃氟含量均高于对照组。 血氟含量除
４０ ｍｇ·Ｌ － １浓度组外，其余两组与对照组比较差异显著
（Ｐ ＜ ０􀆰 ０５），４０、８０、１２０ ｍｇ·Ｌ － １浓度组分别比对照组
高 ４􀆰 １ ％ 、６０􀆰 ９ ％ 、２１４ 􀆰 ４％ 。 鳃氟含量与对照组比较
差异均显著（Ｐ ＜ ０􀆰 ０５），４０、８０、１２０ ｍｇ·Ｌ － １浓度组分
别比对照组高 ２４􀆰 ３ ％ 、４９􀆰 ８％ 、１６７􀆰 ４ ％ 。
注：ｎ ＝６； ∗ 表示（Ｐ ＜０􀆰 ０）差异明显；
∗∗表示（Ｐ ＜０􀆰 ０１）差异有显著。 下同。
Ｎｏｔｅ： ｎ ＝ ６， ∗ Ｐ ＜ ０􀆰 ０５， ∗∗Ｐ ＜ ０􀆰 ０１． Ｔｈｅ ｓａｍｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ．
图 １　 不同浓度氟暴露 ３０ｄ后鲤鱼血清和鳃中氟含量
Ｆｉｇ． １　 Ｔｈｅ ｆｌｕｏｒｉｄｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｇｉｌｌ ｏｆ
ｔｈｅ ｃａｒｐｓ ａｆｔｅｒ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｆｌｕｏｒｉｄｅ ｆｏｒ ３０ ｄ
２􀆰 ２　 氟对鲤鱼 ＮＢＴ阳性细胞的影响
不同浓度氟暴露 ３０ ｄ 后鲤鱼血清中 ＮＢＴ 阳性细
胞数量见图 ２。 从图 ２ 中可知，鲤鱼在 ０、４０、８０、１２０
ｍｇ·Ｌ － １氟中暴露 ３０ ｄ 后，４０ｍｇ·Ｌ － １氟浓度暴露组与
对照组比较，ＮＢＴ阳性细胞数无显著差异，８０、１２０ ｍｇ·
Ｌ － １浓度组 ＮＢＴ 阳性细胞数显著低于对照组 （Ｐ <
０􀆰 ０５），４０、８０、１２０ ｍｇ·Ｌ － １浓度组分别比对照组低
５􀆰 ４４ ％ 、２６􀆰 ５ ％ 、５８􀆰 ５ ％ 。
２􀆰 ３　 氟对鲤鱼血液和鳃中免疫相关酶的活性影响
不同浓度氟暴露 ３０ ｄ后，鲤鱼血液中免疫相关酶
的活性见图 ３。 由图 ３（Ａ⁃Ｄ）可见，鲤鱼在不同浓度氟
图 ２　 不同氟暴露 ３０ｄ后鲤鱼血清中 ＮＢＴ阳性细胞数
Ｆｉｇ． ２　 ＮＢＴ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｒｐｓ ａｆｔｅｒ
ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｆｌｕｏｒｉｄｅ ｆｏｒ ３０ ｄ
化钠水溶液中暴露 ３０ ｄ 后，８０ 和 １２０ ｍｇ·Ｌ － １浓度组
血液中免疫相关酶 ＡＣＰ 和 ＡＫＰ 活性显著低于对照
组，其中 ＡＫＰ 活性分别低于对照组 ２􀆰 ２ ％ 、５􀆰 ９ ％ 、
２５􀆰 ２ ％ ，ＡＣＰ 活性分别低于对照组 ３􀆰 ５％ 、１１􀆰 １ ％ 、
１８􀆰 ９ ％ 。 ４０ 和 ８０ ｍｇ·Ｌ － １浓度组血液中的 ＳＯＤ、ＣＡＴ
活性高于对照组，在 １２０ ｍｇ·Ｌ － １显著低于对照组，其
中 ＳＯＤ低于对照组 ８􀆰 ６％ ，ＣＡＴ低于对照组 ７􀆰 ８％ 。
不同浓度氟暴露 ３０ ｄ后，鲤鱼鳃中免疫相关酶的活性
见图 ４。 由图 ４（Ａ⁃Ｄ）可见，鲤鱼在不同浓度氟化钠水
溶液中暴露 ３０ ｄ 后，鱼鳃中免疫相关酶 ＡＣＰ、ＡＫＰ 活
性，４０ ｍｇ·Ｌ － １浓度组略高于对照组，８０ 和 １２０ ｍｇ·Ｌ － １
浓度组低于对照组，其中各浓度组 ＡＣＰ活性与对照组
比较分别高 ２􀆰 ４ ％ 、低 ４􀆰 ８ ％ 、低 ２３􀆰 ２ ％ ，ＡＫＰ活性在
分别高 ３􀆰 ８ ％ 、低 ２􀆰 ４ ％ 、低 ２０􀆰 ０ ％ 。 其中 １２０ ｍｇ·
Ｌ － １浓度组 ＡＣＰ、ＡＫＰ活性与对照组相比差异极显著，
活性最低。 各浓度组 ＳＯＤ、ＣＡＴ 活性则均显著高于对
照组，ＳＯＤ 活性分别高于对照组 ６􀆰 ９ ％ 、２９􀆰 ２ ％ 、７􀆰 ９
％ ，ＣＡＴ 活性分别高于对照组 ９􀆰 ９％ 、４７􀆰 ３ ％ 、１２􀆰 ０
％ 。 其中 ８０ ｍｇ·Ｌ － １浓度组 ＳＯＤ、ＣＡＴ 活性与对照组
相比差异极显著，活性最高。
２􀆰 ４　 氟对鲤鱼鳃中 ＩＬ －１β蛋白表达的影响
由图 ５ 可见，提取 ０、４０、８０、１２０ ｍｇ·Ｌ － １浓度氟暴
露组鲤鱼鳃的蛋白，经 ＳＤＳ －聚丙烯酰胺凝胶电泳分
离并转膜后，以 β － ａｃｔｉｎ作为上样量的内参，蛋白质免
疫印迹（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ，ＷＢ）结果显示，不同浓度氟暴露
组，鲤鱼鳃中 ＩＬ － １β 蛋白的表达均低于对照组，较对
照组分别低 ４􀆰 ７ ％ 、９􀆰 ３％ 、３０􀆰 ８ ％ 。
２􀆰 ５　 氟与免疫相关酶活性和 ＩＬ －１β表达的关系
Ｅｘｃｅｌ软件 ＣＯＲＲＥＬ 函数相关性分析表明，暴露
３０ ｄ后，氟暴露浓度与血氟含量（ ｒ ＝ ０􀆰 ９４）、鱼鳃氟含
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　 ６ 期 氟对鲤鱼鳃组织免疫相关酶及 ＩＬ － １β表达影响
图 ３　 不同浓度氟暴露 ３０ｄ后对鲤鱼血液中免疫相关酶的活性影响
Ｆｉｇ． ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｆｌｕｏｒｉｄｅ ｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ⁃ｒｅｌａｔｅｄ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｒｐｓ ａｆｔｅｒ
ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｆｌｕｏｒｉｄｅ ｆｏｒ ３０ ｄ
图 ４　 不同浓度氟暴露 ３０ｄ对鲤鱼鳃中免疫相关酶的活性影响
Ｆｉｇ． ４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｆｌｕｏｒｉｄｅ ｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ⁃ｒｅｌａｔｅｄ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇｉｌｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｒｐｓ ａｆｔｅｒ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｆｌｕｏｒｉｄｅ ｆｏｒ ３０ ｄ
量（ ｒ ＝ ０􀆰 ９９）均呈正相关，与血液中 ＮＢＴ 阳性细胞（ ｒ
＝ － ０􀆰 ９６）呈负相关，与鳃中 ＩＬ － １β 蛋白的表达（ ｒ ＝
－ ０􀆰 ８７）呈负相关，且鲤鱼鳃 ＩＬ － １β 蛋白的表达与血
氟含量（ ｒ ＝ － ０􀆰 ９７）、鱼鳃氟含量（ ｒ ＝ － ０􀆰 ９２）均呈负
相关。 氟暴露浓度与血液 ＡＣＰ（ ｒ ＝ － ０􀆰 ９８）、ＡＫＰ（ ｒ ＝
－ ０􀆰 ８９）、ＳＯＤ（ ｒ ＝ － ０􀆰 ６６）、ＣＡＴ 活性（ ｒ ＝ － ０􀆰 ５５）均
呈负相关；与鳃组织中 ＡＣＰ（ ｒ ＝ － ０􀆰 ８６）、ＡＫＰ（ ｒ ＝ －
０􀆰 ８１）呈负相关，与 ＳＯＤ（ ｒ ＝ ０􀆰 ４７）、ＣＡＴ 活性 （ ｒ ＝
０􀆰 ４６）呈正相关。
５９０１
核　 农　 学　 报 ２８ 卷
图 ５　 不同氟暴露组鲤鱼鳃组织中 ＩＬ －１β蛋白的表达
Ｆｉｇ． ５　 Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ ＩＬ －１β ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｇｉｌｌｓ ｏｆ ｃａｒｐ ａｆｔｅｒ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｆｌｕｏｒｉｄｅ
３　 讨论
鱼类作为低等脊椎动物，其免疫系统包括先天性
的或非特异性的防御系统，以及获得性的或特异性的
防御系统。 与哺乳动物不同，鱼类主要依靠非特异性
免疫系统来抵抗病原的入侵，非特异性免疫防御机制
是其抵抗病原的第一道屏障［１６］。
磷酸酶又称磷酸单酯水解酶，是可以催化各种含
磷化合物水解的酶类，根据它们催化作用的最适 ｐＨ
特性，可分为酸性磷酸酶 （ ＡＣＰ） 和碱性磷酸酶
（ＡＫＰ）。 ＡＣＰ 在体内直接参与磷酸基团的转移和代
谢，有利于其参与机体细胞中的物质代谢，为 ＡＤＰ 磷
酸化提供更多所需的无机磷酸，促进其生长，从而提高
其免疫力［１７］。 ＡＫＰ是一种重要的水解酶，能催化磷酸
单脂的水解及磷酸基团的转移反应，对细菌等异物在
溶酶体内的消化降解具有重要作用，并在免疫反应中
发挥作用，对动物的生存具有重要的意义，一直以来
ＡＫＰ都被作为一个重要的免疫指标在动物免疫学中
被广泛研究［１８ － ２０］。 本试验中，血清 ＡＣＰ、ＡＫＰ 活性在
低浓度组与对照组相比无显著性变化，说明血液中的
ＡＣＰ、ＡＫＰ对低浓度氟暴露具有一定的耐受能力。 中、
高浓度氟暴露组血清 ＡＣＰ、ＡＫＰ 活性与对照组相比受
到显著抑制，这可能是中、高浓度的氟暴露对血清产生
较大毒性而导致的，且相关分析发现两者之间存在明
显的剂量效应关系。 鳃组织中的 ＡＣＰ、ＡＫＰ 活性在低
浓度时增加说明鲤鱼的抗应激水平得以提升，是免疫
能力增强的表现之一。 而中、高浓度氟暴露组则可能
使组织细胞受损且超过了鳃的免疫能力，从而抑制了
ＡＣＰ、ＡＫＰ的活性且两者之剂量效应关系明显。
超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）是存在生物体内的非常重
要的抗氧化防御性功能酶，在抗氧化系统中属一线氧
化酶，对清除活性氧起着重要作用［２１ － ２２］。 过氧化氢酶
（ＣＡＴ）是细胞内起清除 Ｈ２Ｏ２ 作用的一种活性酶，它
参与清除过氧化氢的积累来维持细胞内 Ｈ２Ｏ２ 的正常
水平［２３ － ２４］，两者都可以保护机体免受其伤害等。
ＳＯＤ、ＣＡＴ活性与生物体的免疫水平密切相关，对增强
吞噬细胞的防御能力和机体的免疫功能具有重要作
用［２５ － ２７］。 许多研究结果表明，在抗氧化系统中，对污
染物反应敏感的酶的活力或活性物质的含量在低浓度
污染物胁迫表现为诱导升高，随着污染物浓度不断提
高，则形成了毒害，酶的活力或活性物质的含量也随之
下降，导致机体免疫水平下降［２８ － ３０］。 本试验结果显
示，氟暴露浓度较低时，血液和鳃中 ＳＯＤ、ＣＡＴ 活性高
于对照组；氟暴露浓度较高时，血液和鳃中 ＳＯＤ、ＣＡＴ
活性低于对照组；这与已有的研究结果基本一
致［３１ － ３２］。 这可能是机体在一定氟暴露浓度范围内，体
内的抗氧化酶被激活或抗氧化物大量产生，从而促使
机体的抗氧化防御系统处于活跃状态，能够清除体内
产生的大量自由基，以保护自身不受氧化损伤；但当氟
胁迫程度增高时，酶活力降低，机体清除活性氧的能力
减弱，其抗氧化水平的下降可能造成活性氧自由基的
积累和对细胞膜的损伤，降低机体的适应能力和健康
水平，从而出现损伤反应。
在鱼类血细胞中，吞噬细胞、中性粒细胞、巨噬细
胞都具有吞噬异物的能力，是鱼类非特异性免疫的主
要指标之一，它们的数量和吞噬能力的高低可直接反
映出鱼类非特异性免疫能力的大小，在鱼类的非特异
性免疫中起着至关重要的作用。 本试验结果表明，４０
ｍｇ·Ｌ － １的氟暴露组鲤鱼的 ＮＢＴ 阳性细胞（吞噬细胞、
６９０１
　 ６ 期 氟对鲤鱼鳃组织免疫相关酶及 ＩＬ － １β表达影响
中性粒细胞和巨噬细胞）略为减少，而 ８０ 和 １２０ ｍｇ·
Ｌ － １的氟暴露组，ＮＢＴ阳性细胞数明显减少，且呈明显
的剂量效应关系。 这可能是因为污染物可使鱼类巨噬
细胞群的大小、数量和着色显著下降，引起吞噬细胞的
密度梯度下降，从而导致吞噬细胞、中性粒细胞和巨噬
细胞的吞噬率和趋化性下降［３２］。 这说明水氟能够影
响鲤鱼的吞噬细胞、中性粒细胞和巨噬细胞的吞噬能
力，从而降低了鲤鱼的非特异性免疫功能以及对病原
菌的抵抗力。
白细胞介素 ＩＬ － １β 由 Ｔ 细胞和巨噬细胞激活后
由巨噬细胞分泌，能够诱导淋巴细胞的生长和发育，刺
激免疫和炎症应答效应细胞，增强细胞介导的免疫应
答作用，促进细胞调控免疫［３４］。 ＩＬ － １β 是一种具有
多种免疫调节功能并诱发炎症反应以及机体防御反应
的炎性细胞因子，在多种脏器损伤中具有重要作用，适
量的 ＩＬ － １β可以活化巨噬细胞、杀灭病原微生物，是
重要的免疫调节因子。 本试验通过 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 分析
了 ＩＬ － １β蛋白水平在对照组和不同氟暴露组鲤鱼鳃
组织的表达，结果显示低浓度氟暴露组鲤鱼鳃中 ＩＬ －
１β的表达较对照组高，而高浓度氟暴露组鲤鱼鳃中 ＩＬ
－ １β的表达较对照组低，相关性分析表明 ＩＬ － １β 蛋
白的表达与血氟和鳃氟含量呈显著负相关。 以上试验
结果表明 ＩＬ － １β参与了鲤鱼血液和鳃中的免疫应答
反应，尤其在机体抗感染防御初期发挥重要作用。 另
外，也表明了 ＩＬ － １β蛋白在鲤鱼鳃中不但有组成型表
达，而且经刺激后表现出诱导型表达，可见 ＩＬ － １β 蛋
白在鲤鱼鳃中的表达为组成型和诱导型并存的模式。
以上的结果表明，水体中一定浓度的氟对鲤鱼鳃
组织的免疫相关酶 ＡＣＰ、ＡＫＰ、ＳＯＤ、ＣＡＴ 活性及 ＩＬ －
１β蛋白表达具有一定的影响，但是其机制还有待进一
步更深入的研究。
４　 结论
本试验研究了水环境中氟对鲤鱼鳃组织免疫相关
酶活性及 ＩＬ － １β 表达影响。 结果表明水体中氟对鲤
鱼鳃组织的免疫相关酶 ＡＣＰ、ＡＫＰ、ＳＯＤ、ＣＡＴ 活性有
一定的影响，对 ＩＬ － １β 蛋白的表达整体呈抑制作用，
且水氟暴露浓度与鲤鱼免疫相关酶活性 ＡＣＰ、ＡＫＰ、
ＳＯＤ、ＣＡＴ活性和 ＩＬ － １β蛋白表达呈一定的剂量效应
关系。
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ＣＨＥＮ Ｊｉａｎ⁃ｊｉｅ１ 　 ＣＡＯ Ｊｉｎ⁃ｌｉｎｇ１ 　 ＬＵＯ Ｙｏｎｇ⁃ｊｕ２ 　 ＧＵ Ｓｈａｏ⁃ｐｅｎｇ１
（ １ Ｋｅｙ Ｌａｂ ｏｆ Ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｏｆ Ｓｈａｎｘｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，
Ｓｈａｎｘｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｔａｉｇｕ， Ｓｈａｎｘｉ　 ０３０８０１；２ Ｇｕａｎｇｘｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｆｉｓｈｅｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｎａｎｎｉｎｇ， Ｇｕａｎｇｘｉ　 ５３００２１）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｆｌｕｏｒｉｄｅ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ⁃ｒｅｌａｔｅｄ ｅｎｚｙｍｅｓ （ＡＣＰ， ＡＫＰ， ＳＯＤ ａｎｄ ＣＡＴ）， ＮＢＴ ｐｏｓｉｔｉｖｅ
ｃｅｌｌｓ， ａｎｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １ ｂｅｔａ （ ＩＬ － １β） ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｃａｒｐ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ａｆｔｅｒ ｔｈｅ
ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｏｄｉｕｍ ｆｌｕｏｒｉｄｅ （０， ４０， ８０ ａｎｄ １２０ ｍｇ·Ｌ － １） ｆｏｒ ３０ ｄａｙｓ， ｆｌｕｏｒｉｄｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｉｎ
ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ｇｉｌｌ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ， ｓｈｏｗｉｎｇ ａ ｃｅｒｔａｉｎ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｄｏｓｅ⁃ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ． Ｔｈｅ
ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ （ ＳＯＤ） ａｎｄ ｃａｔａｌａｓｅ （ ＣＡＴ） ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｓｈ ｉｎ １２０ ｍｇ·Ｌ － １ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ． Ｔｈｅ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ （ ＡＣＰ） ａｎｄ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ （ ＡＫＰ）
ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ， ａｎｄ ｔｈｏｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ８０ ａｎｄ １２０ ｍｇ·Ｌ － １ ｇｒｏｕｐｓ ｗｅｒｅ ｒｅｍａｒｋａｂｌｙ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ｔｈｅ
ｃｏｎｔｒｏｌ． ＮＢＴ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＩＬ － １β ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｇｉｌｌｓ ｒｅｄｕｃｅｄ． ＣＯＲＲＥＬ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ
ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｄｏｓｅ⁃ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｏｄｉｕｍ ｆｌｕｏｒｉｄｅ ａｎｄ ｔｈｅ
ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ＡＣＰ， ＡＫＰ， ＳＯＤ ａｎｄ ＣＡＴ ａｃｔｉｖｉｔｙ， ｔｈｅ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｏｄｉｕｍ ｆｌｕｏｒｉｄｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ
ＩＬ － １β． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｆｌｕｏｒｉｄｅ ｉｎ ｔｈｅ ｗａｔｅｒ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｃａｎ ｉｎｈｉｂｉｔ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｐ ｇｉｌｌｓ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｃａｒｐ （Ｃｙｐｒｉｎｕｓ ｃａｒｐｉｏ）； Ｓｅｒｕｍ； Ｇｉｌｌ ｔｉｓｓｕｅ； Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ； ＩＬ － １β ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
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