全 文 ：核 农 学 报 2015，29 ( 2 ) : 0321 ～ 0326
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
收稿日期: 2013-11-29 接受日期: 2014-11-10
基金项目:吉首大学植物资源保护与利用湖南省高校重点实验室开放基金项目( 13jdzb094 )
作者简介:欧阳玉祝，男，教授，主要从事天然产物开发和食品添加剂研究; E-mail: ouyanghxhg@ 163． com
通讯作者:同第一作者。
文章编号: 1000-8551 ( 2015 ) 02-0321-06
响应面优化倍花水解制备没食子酸的工艺条件
欧阳玉祝 李雪峰 符智荣 张小凤
( 吉首大学植物资源保护与利用湖南省高校重点实验室，湖南 吉首 416000 )
摘 要:为了开发倍花深加工产品，本文以倍花为原料，用浓硫酸催化水解制备没食子酸。在单因素试验
基础上，采用响应面优化试验考察了水解温度、水解时间和硫酸用量对没食子酸得率的影响。结果表
明，在 50mL 倍花提取液中，用 2. 47mL 98% 浓硫酸催化，97℃ 温度下水解 315min，没食子酸得率为
36. 01%，试验结果与试验模型预测值相吻合。分离产物用高效液相色谱结合没食子酸标样进行定性分
析，结果与标准品一致。本研究能为倍花的开发利用提供理论依据。
关键词:倍花 ;没食子酸 ; 响应面优化法
DOI: 10. 11869 / j． issn． 100-8551. 2015. 02． 0321
倍花( Chinese gall Beihua) 是产于我国西南山区各
省的特色资源之一，是五倍子的一种，单宁酸含量为
20%左右［1 － 2］。没食子酸是单宁酸的水解产物，具有
独特的生理活性和优良的抗氧化活性与自由基清除能
力［3 － 6］，广泛应用于食品、日化、医药和分析检测等领
域［7 － 12］。在天然资源加工利用中，没食子酸主要由倍
子单宁、塔拉单宁和一些含单宁酸的果皮水解制
备［13 － 17］。响应面法是一种常用的工艺优化方法，在天
然产物分离和食品工艺研究方面有广泛的应用［18 － 21］。
本试验以倍花为原料，用响应面法优化酸催化水解倍
花制备没食子酸的工艺条件，并用高效液相色谱对分
离产物进行定性鉴定。研究结果能为倍花的深加工提
供试验数据。
1 材料与方法
1. 1 试剂与仪器
倍花由湘西自治州保靖县林力科技有限公司提
供，材料购回后经选料、真空干燥后，用植物粉碎机打
碎成 30 目粉末，备用; 没食子酸标准品，含量≥99%，
由上海江莱生物科技有限公司提供 ; 硫酸、无水乙醇、
铬皮粉等均为国产分析纯试剂。
UV-2450 型紫外可见分光光度计 ( 日本岛津公
司) ; LC-2010 型高效液相色谱仪 ( 日本岛津公司 ) ;
ＲE-85Z 型旋转蒸发器 ( 上海青沪仪器厂 ) ; SHB-III 循
环水式多用真空泵 ( 郑州长城科工贸有限公司 ) ; DF-
101S 集热式恒温磁力搅拌器( 郑州长城科工贸有限公
司) ; JA2003N 型电子天平( 上海精密仪器厂) 。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 倍花提取液的制备方法 取 5g 倍花粉末和
500mL 水于 1 000mL 烧杯中，30℃浸泡 12h。过滤，定
容于 1 000mL 容量瓶中。取该溶液 25mL 稀释并定容
于 1 000mL 容量瓶中，得倍花提取液，备用。
1. 2. 2 没食子酸的制备方法 取 50mL 倍花提取液
于 150mL 圆底烧瓶中，缓慢加入试验量的浓硫酸，在
一定温度下水解一定时间，水解液加一定量铬皮粉，振
荡 15min，抽滤，滤液用紫外可见分光光度计测吸光
度，计算没食子酸含量。
1. 3 分析方法
1. 3. 1 标准曲线的绘制 按参考文献［22］配置梯度
浓度的没食子酸标准溶液，用紫外可见分光光度计测
标准溶液在 270nm 处的吸光度，绘制标准曲线，并经
线性回归得回归方程和相关系数为 :
C = 0. 0225A， Ｒ = 0. 9997
式中 C 为标准溶液浓度( mg·L － 1 ) ; A 为标准溶液的吸
光度。
123
核 农 学 报 29 卷
1. 3. 2 没食子酸含量分析 取 10mL 水解液稀释成
200mL 溶液，加一定量的铬皮粉吸收单宁酸，取上层清
液，以水为参比用紫外可见分光光度计测 270nm 处吸
光度。将吸光度带入回归方程计算水解液中没食子酸
质量，按下式计算得率 :
没食子酸得率 = 水解液中没食子酸的质量
倍花粉末质量
× 100%
1. 3. 3 色谱分析 色谱条件 : 色谱柱为 Wondasil
C18-WＲ 柱 ( 250mm × 4. 6mm，5μm ) ; 流 动 相 为
100%。
甲醇 － 0. 05% 磷酸水溶液 = 10 ∶ 90，流速为
1. 0mL·min － 1 ;检测波长为 273nm; 柱温为 30℃ ; 进样
量为 20μL。
试验数据经色谱工作站处理，并与标准品对照，确
定分离产品与标准品的一致性。
2 结果与分析
2. 1 水解反应单因素试验
2. 1. 1 水解温度 温度不同水解程度不同，没食子酸
的得率将不同。取 50mL 倍花提取液，按 1. 2. 2 方法缓
慢加入 2mL 浓硫酸，在不同温度下加热水解 120min，考
察水解温度对没食子酸得率的影响( 表 1) 。
由表 1 可知，随水解温度升高，没食子酸得率增
大，在 100℃时没食子酸的得率最大为 34. 26%。由于
水解反应在水中进行，水的沸点为 100℃，最佳反应温
度选择 100℃。
2. 1. 2 水解时间 倍花中没食子酸的羧基可通过与
自身的酚羟基或与糖羟基通过酯键结合成单宁，酯键
水解生成没食子酸 ; 水解时间不同，酯键的水解程度不
同。为了考察水解时间对没食子酸得率的影响，取
50mL 倍花提取液，按 1. 2. 2 方法缓慢加入 2mL 浓硫
酸，在 90℃下加热水解不同时间，结果见表 1。由表 1
可知，没食子酸的得率随水解时间增加而增大，到
300min 时基本恒定，得率为 34. 31%。由此说明反应
300min 后，倍花中的酯键已经完全水解，没食子酸得
率基本恒定。因此最佳水解时间选择 300min。
2. 1. 3 硫酸用量 倍花中酯键在不同酸度下水解程度
不同，因此，硫酸用量直接影响没食子酸得率。取 50mL
倍花提取液，按 1. 2. 2 方法缓慢加入不同体积的浓硫
酸，在 90℃下加热水解 120min( 表 1) 。由表 1 可知，随
着浓硫酸用量的增加，没食子酸得率先增加后减少，
2. 5mL 时达到最大值 33. 35%。这是由于浓硫酸用量太
少，反应速度慢，反应不完全; 浓硫酸用量太大则会
表 1 试验条件对没食子酸得率的影响
Table 1 Influence of experiment condition on
extraction ratio of the gallic acid
试验条件
Experiment condition
没食子酸得率
Extraction ratio of the gallic acid /%
水解温度 50 12． 75
Hydrolysis 60 14． 73
temperature /℃ 70 17． 73
80 23． 49
90 30． 37
100 34． 26
水解时间 60 23． 14
Hydrolysis 120 24． 97
times /min 180 28． 12
240 28． 63
300 34． 31
360 34． 70
420 34． 79
硫酸用量 0． 5 18． 54
Sulfuric acid 1． 0 20． 99
dosage /mL 1． 5 21． 97
2． 0 25． 43
2． 5 33． 35
3． 0 33． 20
3． 5 32． 69
加速产物氧化。因此硫酸最佳用量 2. 5mL。
2. 2 响应面优化试验
2. 2. 1 Box-behnken 试验设计与结果 在单因素试验
结果基础上，采用 Box-behnken 中心组合设计原理［21］，
选择水解温度( X1 ) 、水解时间( X2 ) 和浓硫酸用量( X3 ) 3
个因素为影响因素，以没食子酸得率为响应值设计三因
素三水平试验，其中在水解温度的设计中，考虑单因素
中 100℃得率最高，水浴的最高温度为 100℃，因此选择
将温度设置为 80、90、100℃ 3 个水平; 水解时间设置为
240、300、362min; H2SO4 用量设置为 2. 0、2. 5、3. 0mL。
根据 Box-Behnken 设计的因素和水平，按 1. 2. 2 方法进
行试验，试验因素水平表和试验结果见表 2、表 3。
2. 2. 2 模型的显著性检验 以没食子酸得率为响应
值，用 Design Expert 8. 00 软件对实验结果进行拟合，
得出二次多项式数学模型为 : Y = － 552. 17 + 7. 55X1 +
0. 71X2 + 64. 75X3 － 1. 42 × 10
－ 3 X1X2 － 0. 20X1X3 －
03X2X3 － 0. 03X1
2 － 7. 83X2
2 － 7. 07X3
2。同时，对表 3
数据用 Design Expert 8. 00 软件进行回归和方差分析，
结果见表 4。
223
2 期 响应面优化倍花水解制备没食子酸的工艺条件
表 2 Box-behnken 因素水平表
Table 2 Factor level of Box-behnken experimental
编码值
Coded value
X1 水解温度
Hydrolysis temperature /℃
X2 水解时间
Hydrolysis times /min
X3 硫酸用量
Sulfuric acid dosage /mL
－ 1 80 240 2. 0
0 90 300 2. 5
1 100 360 3. 0
表 3 Box-behnken 试验结果
Table 3 Ｒesults of Box-behnken experimental
试验号
Number
X1 水解温度
Hydrolysis temperature /℃
X2 水解时间
Hydrolysis times /min
X3 硫酸用量
Sulfuric acid dosage /mL
没食子酸得率
Extraction ratio of the gallic acid /%
1 － 1 1 0 26. 46
2 1 0 1 34. 39
3 1 － 1 0 32. 35
4 － 1 0 － 1 22. 78
5 0 0 0 34. 75
6 0 0 0 34. 40
7 － 1 0 1 25. 53
8 0 0 0 34. 74
9 0 － 1 － 1 25. 90
10 0 0 0 35. 10
11 0 － 1 1 30. 13
12 0 1 1 32. 55
13 0 0 0 34. 82
14 0 1 － 1 32. 12
15 － 1 － 1 0 21. 07
16 1 1 0 34. 34
17 1 0 － 1 35. 72
由表 4 可知，试验所选模型的相关系数 Ｒ2 =
0. 9928，P ＜ 0. 0001，表明模型极显著 ;模拟调整相关系
数 ＲAdj
2 = 0. 9835，表明响应值 ( 得率 ) 变化的 98. 35%
来自于所选变量。表 4 中，X1、X2 和 X1
2、X2
2 表现为
极显著 ( P ＜ 0. 0001 ) ; X3、X1X2、X1X3、X2X3 和 X3
2 表
现为显著 ( P ＜ 0. 05 ) 。结合表 4 中各系数项的估计
值，本试验各因素的影响大小顺序依次为 : 水解温度 ＞
水解时间 ＞硫酸用量。
2. 2. 3 响应面分析 根据回归模型作出相应的响应
曲面图，考察拟合响应曲面的形状，分析各因素对没食
子酸得率的影响( 图 1 ) 。
利用 Design expert 8. 00 软件结合回归模型，预测
倍花水解制备没食子酸的最佳工艺条件为 : 水解温度
97. 33℃，水解时间 315. 38min，浓硫酸用量 2. 47mL，
模型对没食子酸得率的预测值为 36. 87%。
2. 2. 4 模型验证 为了检验响应面法所得结果的可
靠性，同时考虑试验条件的可操作性，将提取工艺参数
调整为 : 水解温度 97℃，水解时间 315min，98%浓硫酸
用量 2. 47mL。在此条件下进行组合验证试验，平行试
验 5 次 得 率 分 别 为 35. 96%、36. 07%、35. 93%、
36. 03%和 36. 05%，取平均值 36. 01%，比模型的预测
值 36. 87%小 0. 86%，表明基于响应曲面法所得的优
化水解条件准确可靠，进一步验证了数学模型的可靠
性。
2. 3 分离产物的表征
为了验证分离产物是目标产物，将分离产物按
323
核 农 学 报 29 卷
表 4 回归模型系数显著性检验及方差分析
Table 4 Significance testing and variance analysis of model regression coefficient
系数来源
Source of coeffcient
平方和
SS
自由度
df
均方
MS
F 值
F value
P 值
P value
显著性
Significance
模型 362. 26 9 40. 250 107. 09 ＜ 0. 0001 极显著
X1 209. 72 1 209. 720 557. 94 ＜ 0. 0001 极显著
X2 32. 08 1 32. 080 85. 35 ＜ 0. 0001 极显著
X3 4. 62 1 4. 620 12. 29 0. 0099 显著
X1 X2 2. 89 1 2. 890 7. 69 0. 0276 显著
X1 X3 4. 16 1 4. 160 11. 07 0. 0126 显著
X2 X3 3. 61 1 3. 610 9. 60 0. 0173 显著
X1
2 48. 34 1 48. 340 128. 62 ＜ 0. 0001 极显著
X2
2 33. 45 1 33. 450 88. 99 ＜ 0. 0001 极显著
X3
2 13. 17 1 13. 170 35. 04 0. 0006 显著
失拟 2. 38 3 0. 790 12. 74 0. 0160
净误差 0. 25 4 0. 062
残差 2. 63 7 0. 380
总离差 364. 89 16
相关系数 Ｒ2 0. 9928
调整相关系数 ＲAdj
2 0. 9835
注 : A: 硫酸用量与水解温度的交互影响 ; B: 硫酸用量与水解时间的交互影响 ; C: 水解时间与水解温度的交互影响。
Note: A: Interaction influence of sulfuric acid dosage and hydrolysis temperation; B: Informaction influence of
sulfric acid dosage and hydrolysis time; C: IN teraction influence of hydrolysis time and lydrolysis temperature．
图 1 响应曲面图
Fig． 1 Ｒesponse surface graphs
423
2 期 响应面优化倍花水解制备没食子酸的工艺条件
1. 3. 3 方法做高效液相色谱分析，并与没食子酸标准
品的高效液相色谱图对比，结果见图 2。
图 2 结果表明，试验制得的没食子酸产品的
HPLC 图与没食子酸标准品的 HPLC 图吻合，说明本
试验制得的产品是目标产物。
注 : A，标准品，B，产品。
Note: A: standard substance，B: product．
图 2 没食子酸标准品和产品的高效液相色谱图
Fig． 2 HPLC chart of standard substance and product
3 讨论
没食子酸的生产主要用五倍子单宁水解制得。随
着没食子酸应用领域不断拓展，需求量不断增加，造成
倍子原料短缺，价格上涨。倍花是一种价格低廉的没
食子酸生产原料，具有很大的开发利用空间，但因没食
子酸含量低，杂质多，深加工难度大，研究较少。熊国
华等［23］用硫酸水解倍花提取液一步制备没食子酸，收
率为 23% ;陈方平等［24］研究了倍花酸催化一步水解
制工业没食子酸，并进行了工业化生产，产品得率为
24. 7% ;陈茜文等［25］用碱性水解倍花制备没食子酸，
结果表明，在 n单宁酸 ∶ n氢氧化钠为1 ∶ 38，水解时间为 100
min，水解温度为 106℃，没食子酸得率达 48. 3%。在
上述生产方法中，酸催化时催化剂用量小，但没食子酸
得率低 ;而碱催化时碱的用量大、时设备要求高、三废
多。本试验在上述研究的基础上进行改进，在催化剂
的选择上，由于碱催化水解工艺碱用量大，时设备要求
高，产生的废水多，本法采用浓硫酸催化一步水解工
艺，浓硫酸用量少，大大改善了水解条件，减少了废水
量。在工艺优化方法上，采用先进的 Design Expert 设
计法优化工艺条件。响应面法就是把多因素试验中因
素与指标的相互关系用多元二次回归多项式方程进行
拟合，在关注点附近拟合真实的功能函数，形成因素与
响应值之间的函数关系，建立数学模型和立体响应面，
通过模型回归分析、方差分析和响应面分析得到最优
工艺条件。本法在单因素基础上，以水解温度、水解时
间和催化剂用量为因素，以没食子酸提取率为响应值
进行优化试验。回归模型系数的显著性分析表明，数
学模型表现为极显著，X1X2，X1X3，X2X3 3 个立体曲面
的交互性影响也表现为显著，说明选择的 3 个试验因
素相互之间对没食子酸提取率都有较大的影响。分析
响应面图的坡度陡峭程度，相应面坡度越陡峭、等高线
越密集，且呈椭圆形表示两因素相互影响较大［26］。本
试验得到的 3 个响应面图的坡度都较陡峭，等高线呈
椭圆，说明选择的 3 个试验因素交互性影响较大，与试
验模型分析吻合。试验结果表明，没食子酸提取率的
模型优化值比验证组合试验值只高出 0. 86%，表明了
优化条件和试验结果的合理性。
4 结论
本试验以倍花为原料，以没食子酸得率为响应值，
以水解温度、水解时间和浓硫酸用量为影响因素，用响
应面法优化了酸催化水解倍花制备没食子酸的工艺条
件。结果表明，在 50mL 倍花提取液中，用 2. 47mL
98%的浓硫酸催化，97℃水解 315min，没食子酸的得
率为 36. 01%。组合后的试验结果与模型预测值吻
合。分离产物用高效液相色谱结合标样进行定性分
析，结果与标准品一致。
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Optimization on Preparation Technological of Gallic Acid From Hydrolysis
Chinese Gall Beihua With Ｒesponse Surface Methodology
OU YANG Yuzhu LI Xuefeng FU Zhirong ZHANG Xiaofeng
( Key Laboratory of Plant Ｒesources Conservation and Utilization of Hunan Province，Jishou University，Jishou，Hunan 416000 )
Abstract: In order to exploitation deep processing products of Chinese gall beihua，gallic acid was prepared with
concentrated sulfuric acid catalytic hydrolysis of Chinese gall beihua in this paper． The influences of hydrolysis
temperature，times and sulfuric acid dosage on the extraction ratio of gallic acid were studied by response surface
methodology ( ＲSM) based on single-factor experiment． The results showed that the extraction ratio of gallic acid from
Chinese gall beihua is 36. 01% with 50mL extraction solution under catalyzed with 2. 47mL 98% concentrated sulfuric
acid at 97℃ for 315min． Experiment results were well matched with the model predicted value． Employed with high
performance liquid chromatography ( HPLC) analysis，the results of the separation product are consistent in the standard
substance． Theoretical basis was provided for the development and utilization of the Chinese gall beihua with the study．
Keywords: Chinese gall beihua，gallic acid，response surface methodology
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