全 文 ：摇 核 农 学 报摇 圆园员源袁圆愿渊源冤院园缘缘猿 耀 园缘缘怨允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
收稿日期院圆园员猿鄄园远鄄园猿摇 接受日期院圆园员猿鄄园怨鄄员远
基金项目院国家自然科学基金渊猿员员园员源圆愿冤袁浙江省核农学产业科技创新团队渊圆园员园砸缘园园猿猿冤
作者简介院陈蕾袁女袁主要从事植物分子生物学研究遥 耘鄄皂葬蚤造院糟澡藻灶造藻蚤员怨愿圆赃糟造岳 员远猿援 糟燥皂
通讯作者院金庆生袁男袁研究员袁主要从事水稻育种研究遥 耘鄄皂葬蚤造院躁蚤灶择泽岳 皂葬蚤造援 澡扎援 扎躁援 糟灶
文章编号院员园园园鄄愿缘缘员渊圆园员源冤园源鄄园缘缘猿鄄园苑
大豆 郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻基因的克隆与分析
及植物表达载体构建
陈摇 蕾员袁圆 摇 董德坤员 摇 袁凤杰员 摇 朱丹华员 摇 金庆生员
渊员 浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所袁浙江 杭州摇 猿员园园圆员曰圆 南京野生植物综合利用研究院袁江苏 南京摇 圆员园园源圆冤
摘摇 要院在大豆渊郧造赠糟蚤灶藻 皂葬曾 蕴援 酝藻则则援 冤中克隆了一个 员园园愿遭责 的表皮毛相关基因 郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻渊郧造赠糟蚤灶藻
皂葬曾 栽则葬灶泽责葬则藻灶贼 栽藻泽贼葬 郧造葬遭则葬 员 原 造蚤噪藻冤曰生物信息学分析表明袁郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻蛋白在结构上具有 源 个宰阅源园
重复渊宰阅源园 原 则藻责藻葬贼冤结构域袁与烟草中 晕贼栽栽郧圆渊晕蚤糟燥贼蚤葬灶葬 贼葬遭葬糟怎皂 栽藻泽贼葬 郧造葬遭则葬 圆冤具有较高同源性遥 推
测 郧皂栽栽郧员 原 造蚤噪藻与大豆表皮毛的生物学功能有关袁并可能作用于大豆发育和防卫反应过程遥 采用 砸栽鄄
孕悦砸和 择鄄砸栽鄄孕悦砸两种方法检测 郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻 在植物根尧茎尧叶尧花和种子中的表达遥 构建 郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻
植物表达载体并获得可以侵染的农杆菌阳性克隆遥
关键词院大豆曰表皮毛曰郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻曰宰阅源园 重复
阅韵陨院员园郾 员员愿远怨 辕 躁援 蚤泽泽灶援 员园园鄄愿缘缘员郾 圆园员源郾 园源援 园缘缘猿
摇 摇 植物表皮毛是覆盖于植物组织表面尧由表皮细胞
层分化出的单细胞或者多细胞的毛状结构遥 表皮毛具
有多种不同的生理功能袁例如增加植物表皮保护组织
的厚度袁减少植物热量和水分的丧失遥 当植物遇到紫
外线尧干旱尧辐射和毒性物质等非生物胁迫时袁表皮毛
可以作为植物最外层的天然屏障对植物起到保护作
用咱员 原 圆暂 遥 有些表皮毛还具有重要的经济价值袁例如棉
纤维遥 拟南芥渊粤则葬遭蚤凿燥责泽蚤泽 贼澡葬造蚤葬灶葬冤的表皮毛被认为
是一种物理防卫结构袁可以通过增加表皮毛的密度来
避免昆虫和病原菌的侵害咱猿 原 源暂 袁而烟草则具有分泌型
表皮毛袁其分泌的物质含有具防御功能的化学成
份咱缘暂 遥 因此袁植物表皮毛在植物抗击虫害和抵御病原
物侵染过程中起着至关重要的作用咱远暂 遥
模式植物拟南芥的表皮毛发育分子遗传研究已经
发现了多个直接参与表皮毛形成的基因袁他们都编码
转录因子袁包括含有 宰阅源园 重复渊宰阅源园 则藻责藻葬贼冤序列的
转录因子渊栽则葬灶泽责葬则藻灶贼 栽藻泽贼葬 郧造葬遭则葬 员渊栽栽郧员冤 咱苑暂 袁酝再月
类 转 录 因 子 咱 郧蕴粤月砸韵哉杂员 渊 郧蕴员 冤 咱愿 原 怨暂 尧
栽砸陨孕栽再悦匀韵晕咱员园暂 尧悦粤孕孕陨悦耘咱员员暂 暂袁 月匀蕴匀 类转录因子
郧蕴粤月砸韵哉杂猿 渊 郧蕴猿 冤 咱员圆暂 袁 含 匀阅在陨孕 的 转 录 因 子
郧蕴粤月砸韵哉杂圆渊郧蕴圆冤等咱员猿 原 员源暂 遥 拟南芥突变体 贼贼早员 表现
为叶片表皮毛发育几乎完全丧失袁同时种皮因缺乏丹
宁的分泌而变得透明咱员缘暂 遥 因此袁栽栽郧 被界定为野调节
表皮毛与种子发育的蛋白质冶 咱员远 原 员愿暂 袁它参与调控的生
理与分子机理 陆续被阐释咱员怨 原 圆员暂 院栽栽郧 通过影响花青
素生物合成途径袁改变花和种皮的颜色咱圆园 原 圆员暂 曰通过蛋
白质 原蛋白质互作袁调控表皮毛发育咱圆圆暂 遥 最近在烟草
中的研究发现袁晕贼栽栽郧 参与植物抗病及抗逆防卫反应
的调控咱圆圆 原 圆缘暂 遥 本试验利用 砸栽鄄孕悦砸 在大豆 渊郧造赠糟蚤灶藻
皂葬曾 蕴援 酝藻则则援 冤中克隆了一个编码 宰阅源园 重复的基因
郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻袁运用生物信息学方法对该基因进行相关
分析袁检测不同组织中 郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻 的表达情况袁构建
了植物过量表达载体并获得可供侵染的农杆菌菌株袁
为获得转基因大豆及深入研究 郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻 对大豆表
皮毛和种子发育或其他性状的调控奠定基础遥
员摇 材料与方法
员郾 员摇 材料与试剂
员郾 员郾 员摇 植物材料摇 大豆渊郧造赠糟蚤灶藻 皂葬曾 蕴援 酝藻则则援 冤品种
猿缘缘
核摇 农摇 学摇 报 圆愿 卷
浙春 猿 号的种子由浙江省杭州国家大豆改良分中心提
供遥 本试验将大豆种子在室温下浸种 员圆澡后置于培养
皿中 圆缘益恒温培养 圆源 耀 源愿澡 至萌发袁移至营养钵中袁
取六复叶期的大豆叶片袁液氮速冻存于 原愿园益备用遥
员郾 员郾 圆摇 菌株和载体摇 大肠杆菌渊耘泽糟澡藻则蚤糟澡蚤葬 糟燥造蚤冤菌株
阅匀缘琢 和 农 杆 菌 渊 粤早则燥遭葬糟贼藻则蚤怎皂 贼怎皂藻枣葬糟蚤藻灶泽 冤 菌 株
耘匀粤员园缘 由浙江省农科院作物与核技术利用研究所水
稻育种实验室保存袁栽葬则早藻贼 悦造燥灶藻鄄孕造怎泽购自东洋纺生物
科技有限公司 渊中国上海冤袁植物表达载体 责月粤园园圆
灾藻糟贼燥则由浙江省杭州国家大豆改良分中心提供遥
员郾 员郾 猿摇 主要生化试剂摇 用于 砸栽鄄孕悦砸 实验的反转录
试剂盒购于 栽葬运葬砸葬公司袁引物合成渊表 员冤尧测序均由
陨灶增蚤贼则燥早藻灶公司渊中国上海冤完成袁其它试剂如 砸晕粤蚤泽燥
砸藻葬早藻灶贼尧则栽葬择 酶尧凿晕栽孕泽尧阅晕粤 皂葬则噪藻则袁质粒提取试剂
盒尧阅晕粤纯化及回收试剂盒等均购自于 栽葬运葬砸葬 生物
公司渊中国大连冤遥
员郾 圆摇 方法
员郾 圆郾 员摇 大豆基因组总 砸晕粤 的提取纯化和 糟阅晕粤 第一
链的合成 摇 采用 栽则蚤扎燥造 试剂渊 陨灶增蚤贼则燥早藻灶袁哉杂粤冤提取大
豆不同组织 渊根尧茎尧叶尧花和种子冤总 砸晕粤袁经过
阅晕葬泽藻 陨渊栽葬运葬砸葬 公司冤处理后进行 糟阅晕粤 第一链的合
成渊孕则燥皂藻早葬袁 哉杂粤冤袁 原 圆园益保存备用遥
员郾 圆郾 圆摇 砸栽鄄孕悦砸 扩增 郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻 全长 糟阅晕粤摇 根据
拟南芥发育相关基因 粤贼栽栽郧员渊郧耘晕月粤晕运登录号院晕酝赃
员愿园苑猿怨冤和烟草同源基因 晕贼栽栽郧员渊郧耘晕月粤晕运 登录号院
云允苑怨缘园圆圆冤序列搜索 郧藻灶月葬灶噪渊澡贼贼责院 辕 辕 憎憎憎援 灶糟遭蚤援 灶造皂援
灶蚤澡援 早燥增 辕 遭造葬泽贼冤袁搜索得到一段预测的与 粤贼栽栽郧员 和
晕贼栽栽郧员 有相似性的大豆序列 郧造赠糟蚤灶藻 皂葬曾 责则燥贼藻蚤灶
栽砸粤晕杂孕粤砸耘晕栽 栽耘杂栽粤 郧蕴粤月砸粤 员 原 造蚤噪藻 渊 蕴韵悦
员园园苑愿圆苑愿缘冤遥 根据该序列设计引物 孕园员 原 云和 孕园圆 原 砸
渊表 员冤袁以大豆叶片 糟阅晕粤 作为模板袁使用 运韵阅 酶进
行 孕悦砸 扩增遥 孕悦砸 反应体系为 圆缘滋造袁反应条件为
怨源益预变性 圆皂蚤灶袁怨源益变性 员缘泽袁缘愿益复性 猿园泽袁远愿益延
伸 员皂蚤灶袁猿园 个循环袁孕悦砸 产物经 员豫琼脂糖凝胶电泳
分离袁切胶并用 粤早葬则燥泽藻 郧藻造 阅晕粤 孕怎则蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 运蚤贼 回收
连入 责栽粤圆 载体袁送 陨灶增蚤贼则燥早藻灶 公司渊中国上海冤测序袁
所得到的序列用 晕悦月陨 网站上的 月蕴粤杂栽 进行比对验
证袁并用 阅晕粤杂贼葬则软件进行拼接获得全长 糟阅晕粤序列遥
员郾 圆郾 猿摇 生物信息学分析 摇 所得序列用 晕悦月陨 网站
渊憎憎憎援 灶糟遭蚤援 灶造皂援 灶蚤澡援 早燥增冤的 月蕴粤杂栽 工具进行同源性
比对袁并用 阅晕粤杂贼葬则软件翻译成氨基酸序列袁经在线软
件 悦燥皂责怎贼藻 责陨 辕 酝憎 贼燥燥造袁 耘曾孕粤杂赠 渊 澡贼贼责院 辕 辕 藻曾责葬泽赠援 燥则早 辕
贼燥燥造泽 辕 责蚤赃 贼燥燥造援 澡贼皂造冤预测蛋白分子量和等电点遥 用
杂皂葬则贼工具渊澡贼贼责院 辕 辕 泽皂葬则贼援 藻皂遭造鄄澡藻蚤凿藻造遭藻则早援 凿藻 辕 泽皂葬则贼 辕 躁燥遭
赃 泽贼葬贼怎泽援 责造钥 躁燥遭蚤凿 越 圆员怨愿圆苑源圆猿圆缘苑猿猿员猿远苑猿愿苑苑源园澡藻躁在宰
灶哉皂月葬冤进行氨基酸序列分析遥 多序列比对由 悦造怎泽贼鄄
葬造载 程序渊灾藻则援 员郾 愿猿冤 渊澡贼贼责院 辕 辕 憎憎憎援 蚤遭蚤燥燥援 糟燥皂 辕 泽燥枣贼 辕 遭蚤燥鄄
泽燥枣贼 辕 圆园园怨 辕 苑源园园援 澡贼皂造冤和 郧藻灶藻阅韵悦 程序渊灾藻则援 圆郾 远冤渊澡贼鄄
贼责院 辕 辕 憎憎憎援 责泽糟援 藻凿怎 辕 遭蚤燥皂藻凿 辕 早藻灶藻凿燥糟冤进行曰酝耘郧粤 程序
渊灾藻则援 缘郾 圆冤 渊澡贼贼责院 辕 辕 憎憎憎援 皂藻早葬泽燥枣贼憎葬则藻援 灶藻贼 辕 冤用于系统
发生分析遥
员郾 圆郾 源摇 砸栽鄄孕悦砸 检测摇 郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻 在大豆不同组织
中的表达分别以来源于浙春 猿 号根尧茎尧叶尧花和种子
的 糟阅晕粤为模板袁砸栽鄄孕悦砸 检测 郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻 在大豆不
同组织中的表达情况遥 试验以真核生物高度保守的看
家基因 粤糟贼蚤灶作为内参基因调节初始模板加入量袁扩增
粤糟贼蚤灶时使用的引物 孕园猿 原 云 辕 孕园源 原 砸序列见表 员遥 孕悦砸
反应体系为 圆缘滋造袁反应条件为 怨缘益预变性 缘皂蚤灶曰怨缘益
变性 猿园泽袁缘远益复性 猿园泽袁苑圆益延伸 员皂蚤灶袁圆缘 个循环曰
苑圆益延伸 员皂蚤灶遥 孕悦砸 产物经 员豫琼脂糖凝胶电泳分
离遥
员郾 圆郾 缘摇 择砸栽鄄孕悦砸 检测 摇 根据半定量 孕悦砸 结果袁对
郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻基因在水稻各个组织中的表达进行 择砸栽鄄
孕悦砸检测遥 试验采用 孕则藻皂蚤曾 耘曾 栽葬早栽酝 渊栽葬噪葬则葬 公司冤
试剂盒袁在 月蚤燥砸葬凿 悦云载怨远 孕悦砸 上运行遥 圆园滋造 反应体
系为院杂再月砸 孕则藻皂蚤曾 耘曾 栽葬早栽酝 陨陨渊圆载冤员园滋造袁择砸栽鄄孕悦砸 基
因检测引物 孕园缘 原 云 辕 孕园远 原 砸 或 孕园苑 原 云 辕 孕园愿 原 砸渊圆
怎酝冤上下游各 员滋造袁员园载稀释的 砸栽反应液 员滋造袁灭菌蒸
馏水 苑滋造遥 择孕悦砸 反应条件为 怨缘益预变性 猿皂蚤灶曰怨缘益
变性 圆园泽袁缘远益复性 圆园泽袁苑圆益延伸 圆园泽袁源园 个循环曰扩增
融解曲线遥 孕悦砸 产物送生工测序验证扩增产物为靶
基因遥
员郾 圆郾 远摇 植物过量表达载体构建 摇 根据 郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻
基因序列设计分别含有 载遭葬 陨和 杂葬糟 陨的引物 孕园怨 原 云 辕
孕员园 原 砸袁扩增其编码区 员园园愿遭责袁用于 郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻 基
因过表达载体的构建遥 以 孕粤栽圆院院郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻质粒为
模板袁进行 孕悦砸 扩增遥 产物经过酶切尧纯化后袁用 栽源
阅晕粤连接酶连接至 责月粤园园圆 载体上构建 责月粤园园圆院院
郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻载体袁转化至大肠杆菌 阅匀缘琢遥 涂 蕴月渊含
壮观霉素 员园园滋早窑皂蕴 原员冤平板袁猿苑益培养 员远 耀 圆园澡 后挑
取若干克隆提取质粒袁经 载遭葬 陨 和 杂葬糟 陨双酶切验证后
送公司测序遥 测序验证正确后袁提取质粒转化农杆菌
耘匀粤员园缘袁提取 耘匀粤员园缘 质粒转化 阅匀缘琢 完成进一步酶
切验证遥
源缘缘
摇 源 期 大豆 郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻基因的克隆与分析及植物表达载体构建
表 员摇 引物序列
栽葬遭造藻 员摇 杂藻择怎藻灶糟藻泽 燥枣 责则蚤皂藻则泽
编号
杂藻则蚤葬造 灶怎皂遭藻则
序列渊缘忆 原 猿忆冤
杂藻择怎灶糟渊缘忆 原 猿忆冤
用途
哉泽藻
片段大小
云则葬早皂藻灶贼 泽蚤扎藻 辕 遭责
孕园员 原 云 粤栽郧郧粤郧粤粤栽栽悦郧粤悦悦悦粤粤郧粤粤栽悦悦 基因克隆及 砸栽鄄孕悦砸检测 员园园愿
孕园圆 原 砸 栽悦粤粤粤悦悦栽栽悦粤粤粤粤郧悦栽郧悦粤栽悦栽栽郧 基因克隆及 砸栽鄄孕悦砸检测 员园园愿
孕园猿 原 云 栽郧粤栽郧郧栽郧栽郧粤郧栽悦粤悦粤悦栽郧栽粤悦悦 砸栽鄄孕悦砸内参 远源源
孕园源 原 砸 郧郧粤悦粤粤栽郧郧粤栽郧郧郧悦悦粤郧粤悦栽悦 砸栽鄄孕悦砸内参 远源源
孕园缘 原 云 悦粤粤悦悦悦粤粤粤郧郧栽悦粤粤悦粤郧 择砸栽鄄孕悦砸内参 圆源员
孕园远 原 砸 悦粤郧悦郧粤郧粤栽悦悦粤粤粤悦郧粤粤 择砸栽鄄孕悦砸内参 圆源员
孕园苑 原 云 粤粤栽悦悦悦悦悦栽粤悦悦悦粤粤栽悦栽粤悦郧郧 择孕悦砸基因检测 员苑圆
孕园愿 原 砸 郧郧粤郧郧郧栽粤粤郧郧郧栽郧郧栽悦粤粤粤郧郧 择孕悦砸基因检测 员苑圆
孕园怨 原 云 郧悦栽悦栽粤郧粤粤栽郧郧粤郧粤粤栽栽悦郧粤悦悦悦粤粤郧粤粤栽悦悦 过量表达载体构建 员园园愿
孕园员园 原 砸 郧悦郧粤郧悦栽悦栽悦粤粤粤悦悦栽栽悦粤粤粤粤郧悦栽郧悦粤栽悦栽栽郧 过量表达载体构建 员园园愿
摇 摇 注院含有下划线的序列为引入的酶切位点院栽悦栽粤郧粤为 载遭葬 陨袁郧粤郧悦栽悦为 杂葬糟 陨遥 在酶切位点前分别加入保护碱基遥
晕燥贼藻院 杂藻择怎藻灶糟藻 燥枣 则藻泽贼则蚤糟贼蚤燥灶 泽蚤贼藻泽 葬则藻 怎灶凿藻则造蚤灶藻凿 遭藻造燥憎院 载遭葬 陨院 栽悦栽粤郧粤曰 杂葬糟 陨院 郧粤郧悦栽悦援 孕则燥贼藻糟贼蚤增藻 遭葬泽藻泽 憎藻则藻 葬凿凿藻凿 遭藻枣燥则藻 则藻泽贼则蚤糟贼蚤燥灶 泽蚤贼藻泽援
圆摇 结果与分析
圆郾 员摇 郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻全长序列的获得
以大豆浙春 猿 号 糟阅晕粤 为模板袁用特异性引物进
行 砸栽鄄孕悦砸 扩增袁得到了长约 员园园园遭责 的片段渊图 员冤尧
切胶回收后连接 责栽粤圆 载体并测序袁利用 晕悦月陨 网站上
的 月蕴粤杂栽 工具和 阅晕粤杂贼葬则 软件进行拼接获得
郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻全长序列遥
圆郾 圆摇 郧皂栽栽郧员 基因序列分析
用 晕悦月陨 工具软件 渊 澡贼贼责院 辕 辕 憎憎憎援 灶糟遭蚤援 灶造皂援 灶蚤澡援
早燥增 辕 早燥则枣 辕 早燥则枣援 澡贼皂造冤分析 郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻 基因序列袁结果
表明袁该序列开放阅读框渊韵砸云冤为 员园园愿遭责袁与已经预
测的基因 郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻渊蕴韵悦员园园苑愿圆苑愿缘冤序列 员园园豫同
源遥 用 阅晕粤杂贼葬则软件将 郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻 翻译成氨基酸序
列袁经在线软件 悦燥皂责怎贼藻 责陨 辕 酝憎 贼燥燥造袁 耘曾孕粤杂赠渊澡贼贼责院 辕 辕
藻曾责葬泽赠援 燥则早 辕 贼燥燥造泽 辕 责蚤赃贼燥燥造援 澡贼皂造冤预测蛋白分子量和等电
点用 阅晕粤 杂贼葬则软件对该阅读框编码的蛋白质序列进
行基本性质分析得出其理论分子量为 猿苑郾 苑 运阅袁共编
码 猿猿缘 个氨基酸袁等电点为 源郾 怨苑遥 将氨基酸序列递交
至 杂酝粤砸栽渊澡贼贼责院 辕 辕 泽皂葬则贼援 藻皂遭造鄄澡藻蚤凿藻造遭藻则早援 凿藻 辕 泽皂葬则贼 辕 躁燥遭
赃泽贼葬贼怎泽援 责造钥 躁燥遭蚤凿 越 圆员怨愿圆苑源圆猿圆缘苑猿猿员猿远苑猿愿苑苑源园澡藻 躁在宰
灶哉皂月葬冤网站进行序列分析遥 结果表明袁该序列在第
远猿 原 员园缘尧员员远 原 员缘缘尧员缘愿 原 员怨远 和 圆源苑 原 圆愿苑 四个位置分
别编码一个宰阅源园 重复的结构域遥 由于宰阅源园 结构域
可以增强蛋白与其它蛋白之间的互作袁由此我们推测
郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻具有与其它蛋白结合的能力遥
注院酝院 阅蕴圆园园园 皂葬则噪藻则渊栽葬噪葬则葬冤袁 员院 郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻全长 糟阅晕粤扩增产物
晕燥贼藻院酝院 阅蕴圆园园园 皂葬则噪藻则渊栽葬噪葬则葬冤袁 员院 贼葬则早藻贼 责则燥凿怎糟贼
图 员摇 郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻全长 糟阅晕粤的扩增
云蚤早援 员摇 粤皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 贼澡藻 郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻 早藻灶藻
为了推测 郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻 的功能袁我们选择了 晕悦月陨
中已发表的 源 个相关基因院从拟南芥表皮毛克隆到的
基因袁粤贼栽栽郧员袁 郧耘晕月粤晕运登录号院晕酝赃员愿园苑猿怨曰从烟草
渊晕蚤糟燥贼蚤葬灶葬 贼葬遭葬糟怎皂 冤 中克隆到的基因 晕贼栽栽郧员 和
晕贼栽栽郧圆袁 其 中袁 晕贼栽栽郧员 的 郧耘晕月粤晕运 登 录 号院
云允猿源远缘苑愿袁晕贼栽栽郧圆 的 郧耘晕月粤晕运 登录号院云允苑怨缘园圆圆郾 员曰
以及在大豆中预测到的另外一个 郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻 基因袁
郧耘晕月粤晕运 登录号院 蕴韵悦员园园愿园源怨圆猿遥 其中袁 粤贼栽栽郧员尧
晕贼栽栽郧员 和 晕贼栽栽郧圆 基因的功能已见报道袁但 郧皂栽栽郧员鄄
造蚤噪藻基因仅为电子预测序列遥 将 缘 个基因的 韵砸云 用
阅晕粤杂贼葬则翻译成氨基酸序列后袁用 灾藻糟贼燥则晕栽陨 对它们进
缘缘缘
核摇 农摇 学摇 报 圆愿 卷
注院黑色背景表示一致的氨基酸遥
晕燥贼藻院 栽澡藻 遭造葬糟噪 遭葬糟噪早则燥怎灶凿 蚤灶凿蚤糟葬贼藻泽 贼澡葬贼 贼澡藻 葬皂蚤灶燥 葬糟蚤凿泽 葬则藻 贼澡藻 泽葬皂藻援
图 圆摇 不同宰阅源园 重复结构域基因氨基酸序列同源性的比较
云蚤早援 圆摇 杂藻择怎藻灶糟藻 泽蚤皂蚤造葬则蚤贼赠 糟燥皂责葬则蚤泽燥灶 燥枣 凿藻凿怎糟藻凿 葬皂蚤灶燥 葬糟蚤凿 泽藻择怎藻灶糟藻 燥枣 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 宰阅源园 原 则藻责藻葬贼 凿燥皂葬蚤灶
图 猿摇 大豆 郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻与其他包含宰阅源园 结构域基因的氨基酸序列聚类分析
云蚤早援 猿摇 孕澡赠造燥早藻灶藻贼蚤糟 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻 憎蚤贼澡 燥贼澡藻则 早藻灶藻泽爷 葬皂蚤灶燥 葬糟蚤凿泽 憎澡蚤糟澡 蚤灶糟造怎凿蚤灶早 宰阅源园 原 则藻责藻葬贼 凿燥皂葬蚤灶
行多重比较 渊图 圆 冤遥 蕴韵悦员园园苑愿圆苑愿缘 与 粤贼栽栽郧员尧
晕贼栽栽郧员尧晕贼栽栽郧圆 和 蕴韵悦员园园愿园源怨圆猿 同源性分别为院
苑缘豫 尧苑源豫 尧苑苑豫和 怨苑豫 遥
用 悦造怎泽贼葬造 软件和 酝藻早葬 缘郾 圆 软件对克隆所得的
郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻编码的氨基酸序列和所选的四个基因的
氨基酸序列进行聚类分析袁分析结果表明院实验获得的
郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻渊蕴韵悦员园园苑愿圆苑愿缘冤与大豆中预测的另外一
个基因 郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻 渊 蕴韵悦员园园愿园源怨圆猿 冤袁 均 与 烟 草
晕贼栽栽郧圆 同源性较高袁而与烟草 晕贼栽栽郧员 和拟南芥
粤贼栽栽郧员 同源性较低渊图 猿冤遥
圆郾 猿摇 郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻在大豆中不同组织的表达
为了明确 郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻在大豆不同组织中的表达
情况袁提取浙春 猿 号根尧茎尧叶尧花和种子的 砸晕粤袁经过
反转录获得 糟阅晕粤袁作为 砸栽鄄孕悦砸 的模板遥 砸栽鄄孕悦砸 结
远缘缘
摇 源 期 大豆 郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻基因的克隆与分析及植物表达载体构建
果如图 源 所示袁郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻 在根尧茎尧叶尧花和种子中
均表达遥
注院粤糟贼蚤灶院内参基因遥
晕燥贼藻院 粤糟贼蚤灶 蚤泽 怎泽藻凿 葬泽 葬 泽贼葬灶凿葬则凿援
图 源摇 砸栽鄄孕悦砸检测大豆中 郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻
表达的组织部位
云蚤早援 源摇 砸栽鄄孕悦砸 凿藻贼藻糟贼蚤燥灶 燥枣 郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻
蚤灶 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 贼蚤泽泽怎藻泽 蚤灶 泽燥赠遭藻葬灶
进一步用 择砸栽鄄孕悦砸方法对 郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻在大豆各
个组织中的表达模式进行精细分析袁结果表明渊图 缘冤袁
郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻在检测的组织中均表达袁在营养组织
渊根尧茎和叶冤中表达较低袁在繁殖组织渊花和种子冤中
表达量较高遥 其中袁郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻在花和种子中的表达
量分别是在根中的 怨 倍和 远 倍遥
图 缘摇 郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻在大豆各组织中表达的 择孕悦砸分析
云蚤早援 缘摇 择砸栽鄄孕悦砸 凿藻贼藻糟贼蚤燥灶 燥枣 郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻 蚤灶 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 贼蚤泽泽怎藻泽 蚤灶 泽燥赠遭藻葬灶
圆郾 源摇 郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻植物表达载体构建和农杆菌侵染
菌株获得
以 责粤栽圆院院郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻质粒为模板袁通过 孕悦砸 扩
增得到大小为 员园园愿遭责 的 郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻 基因袁连接至
责月粤园园圆 载体上的组成型表达启动子 猿缘杂 之后袁转化
耘援 糟燥造蚤 阅匀缘琢袁挑选克隆提取质粒后用 载遭葬 陨和 杂葬糟 陨双
酶切进行验证渊图 远冤遥 阳性克隆送 栽葬噪葬则葬 公司测序袁
证明 员园园豫 同源遥 继续将正确的质粒转化农杆菌
耘匀粤员园缘袁挑取阳性克隆袁酶切验证并测序袁获得了含有
责月粤园园圆院院郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻的农杆菌转化子遥
注院酝院阅蕴圆园园园 皂葬则噪藻则渊栽葬噪葬则葬冤袁 员 原 猿院 圆 条带中上方为
载体酶切产物袁下方为插入载体的 郧皂栽栽郧员 原 造蚤噪藻遥
晕燥贼藻院 酝院阅蕴圆园园园 皂葬则噪藻则渊栽葬噪葬则葬冤袁 员 原 猿院 贼澡藻 贼燥责 遭葬灶凿泽
葬则藻 增藻糟贼燥则泽 葬灶凿 贼澡藻 遭燥贼贼燥皂 造葬灶藻泽 葬则藻 郧皂栽栽郧员 原 造蚤噪藻援
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猿摇 讨论
在模式植物拟南芥中袁一大批表皮毛发育的突变
体已经被分离袁圆园 多个基因被证实参与表皮毛生长发
育的建成和调控咱圆缘 原 圆苑暂 袁随着 栽栽郧员 渊 栽则葬灶泽责葬则藻灶贼 栽藻泽贼葬
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隆袁拟南芥中 栽栽郧 蛋白的功能越来越系统的被阐释遥
三元复合体 酝再月鄄遭匀蕴匀鄄宰阅源园 在拟南芥中被认为是
控制表皮毛发育启动的关键因子咱猿园暂 袁控制着表皮毛的
发育等其它一些重要的性状遥 而 栽栽郧 编码 宰阅 原 源园
苑缘缘
核摇 农摇 学摇 报 圆愿 卷
重复蛋白袁参与 酝再月鄄遭匀蕴匀鄄宰阅源园 复合体的形成遥
近年来袁栽栽郧在矮牵牛尧烟草尧百脉根等植物中相
继被克隆袁在大豆中也有预测的基因序列被公布遥 随
着研究的不断深入袁栽栽郧 的功能已经不在局限于野调
节表皮毛与种子发育的蛋白质冶袁他们在调控植物抗
病及抗逆防卫反应过程中的作用相继被揭示出来遥
晕贼栽栽郧员 在烟草中被一种 耘造蚤糟蚤贼蚤灶 激发子 孕葬则粤员 诱导表
达袁且 孕葬则粤员 与 晕贼栽栽郧员 在表皮毛细胞的细胞膜附近
发生互作咱圆源暂 遥 晕贼栽栽郧圆 对烟草抗病性与生长发育交叉
调控有十分重要的作用袁影响生长素与水杨酸信号传
导交叉调控咱圆缘暂 遥 因此袁烟草中 栽栽郧 作为调控植物发
育的蛋白袁同时也参与植物防卫反应的调控遥 而 栽栽郧
在大豆中是否具有与拟南芥尧烟草等植物中的功能还
未见报道遥
我们通过 砸栽鄄孕悦砸 技术克隆到了大豆中编码
宰阅源园 重复的基因 郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻袁并通过生物信息学分
析推测该基因很可能与大豆表皮毛和种子发育等功能
相关遥 由于 宰阅源园 重复蛋白广泛存在于真核生物中袁
其主要功能是加强该蛋白与其它蛋白的互作袁因此袁笔
者推测 郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻很可能通过与其它蛋白互作形成
复合体结构进而调控下游反应遥 砸栽鄄孕悦砸 和 择砸栽鄄孕悦砸
结果显示袁郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻 在大豆的各个组织中都表达袁
因此可能参与大豆生长发育的整个过程遥 而
郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻在花和种子中的高水平表达袁为我们继续
研究该基因对大豆产量是否存在影响提供依据遥 目
前袁用于过量表达的转基因载体已经构建成功袁并且导
入了农杆菌袁转基因大豆组培工作正在开展遥 本研究
为深入研究大豆中 郧皂栽栽郧员鄄造蚤噪藻 基因功能以及其它相
关机制打下了良好基础遥
参考文献院
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