全 文 ：核 农 学 报 2011，25(2):0231 ～ 0236
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
收稿日期:2010-07-27 接受日期:2010-11-16
基金项目:北京市重点实验室“果树逆境生理与分子生物学实验室”项目
作者简介:张玉刚(1973-)，男，山东枣庄人，博士，副教授，研究方向为园艺植物育种与分子生物学。Tel:0532-86080752;E-mail:zyg4458 @
163. com
文章编号:1000-8551(2011)02-0231-06
苹果 MxNas1 基因正反义表达载体
构建及转化烟草的研究
张玉刚1 韩振海2
(1. 青岛农业大学园林园艺学院，山东 青岛 266109;2. 中国农业大学农学与生物技术学院，北京 100193)
摘 要:为研究笔者前期克隆的 MxNas1 基因功能，构建了苹果属植物小金海棠 MxNas1 基因正义和反义
两种表达载体，并用农杆菌介导的叶盘转化法转化了烟草。对转基因烟草分别进行 0 和 1μmol /L Fe 处
理 14d 后，转正义载体烟草在缺 Fe 情况下叶片没有黄化，表现出较强的抗缺 Fe 能力;转反义载体植株
比对照烟草幼叶提前出现黄化现象，表现了更加不耐缺 Fe。对分别经 0、1、40 和 100μmol /L 浓度 Fe-
EDTA 处理 14d 后转基因烟草的 Fe、Mn、Cu、Zn 含量测定，结果表明:无论哪种浓度 Fe 处理，转正义载体
烟草叶中 Fe、Mn、Cu、Zn 含量比对照提高 1. 2 ～ 1. 5 倍，根中则提高不明显;转反义烟草叶中除了 Mn 的
含量有所降低外，Fe、Cu、Zn 含量与对照相比无明显差异。
关键词:小金海棠;MxNas1 基因;表达载体;遗传转化;烟草
CONSTRUCTION OF SENSE AND ANTISENSE EXPRESSION VECTORS OF
Mxnas1 GENE IN Malus xiaojinensis AND TRANSFORMATION TO TOBACCO PLANTS
ZHANG Yu-gang1 HAN Zhen-hai2
(1. College of Landscape and Horticulture，Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shandong 266109;
2. Institute for Horticultural Plants，China Agricultural University，Beijing 100193)
Abstract:To characterize the function of MxNas1 gene that was isolated from Malus xiaojinensis，sense and antisense
constructs were generated and transformed into tobacco (Nicotiana tabacum)plants by using Agrobacterium-mediated
method. After 14 days of treatment with 0 or 1μmol /L Fe-EDTA，the transgenic and wild-type tobacco plants showed
different tolerances to Fe deficiency. Chlorosis did not occur in young leaves of transgenic tobacco plants overexpressing
MxNas1，which had more tolerance to Fe deficiency than wild type plants. Under Fe deficiency conditions，antisense
tobacco plants exhibited intercostal chlorosis earlier than wild type in young leaves. After 14 days of Fe treatment，
regardless of Fe level (0，1，40，or 100μmol /L Fe-EDTA)，the concentrations of 4 mineral elements (Fe，Mn，Cu，
and Zn)in leaves of MxNas1 sense plants were 1. 2 ～ 1. 5 times higher than those in leaves of wild-type plants. Although
the concentrations of Fe，Cu and Zn in the leaves of MxNas1 antisense plants were similar to those in wild-type plants，
the concentration of Mn decreased in the leaves of antisense plants under all the 4 Fe-levels treatments. No significant
differences in Fe，Mn，Cu or Zn concentrations were detected in the roots among plants tested at the same Fe-level under
the 4 Fe treatment conditions.
Key words:Malus xiaojinensis;MxNas1gene;expression vectors;transformation;tobacco
132
核 农 学 报 25 卷
在高等植物中，尼克烟酰胺(NA)是一种较强的金
属离子螯合剂，不但螯合 Fe (Ⅱ)，而且螯合 Fe
(Ⅲ)［1］，被认为在植物体内铁的运输及内源平衡中起
重要作用［2］。NAS(尼克胭酰胺合成酶)是在高等植
物中普遍存在的一种酶，能催化 3 分子的 S-腺苷甲硫
氨酸(SAM)缩合形成尼克烟酰胺(NA)［3］。在单子叶
禾本科植物(机理Ⅱ)中，NA 作为高 Fe 载体麦根酸
(MAs)合成的前体物质，参与这一途径的重要酶类是
尼克烟酰胺合成酶(NAS)［4］。在双子叶植物和非禾
本科单子叶植物(机理Ⅰ)中，不存在麦根酸(MAs)合
成途径，NAS 在这类植物中的作用机理目前还不清
楚。
近年来，NAS 基因相继从大麦［5］、水稻［6］、玉
米［7］、拟南芥［8］、番茄［9］中被克隆。笔者前期以苹果
属小金海棠为试材，构建了缺 Fe 胁迫条件下小金海棠
消减 cDNA 文库［10］，并从文库中克隆得到了小金海棠
尼克 胭 酰 胺 合 成 酶 基 因 MxNas1 (登 录 号 为
DQ403256)［11］。小金海棠属于双子叶植物(机理Ⅰ)，
为了研究 MxNas1 基因在机理Ⅰ植物中的功能，本文
构建了小金海棠 MxNas1 基因正义和反义两种表达载
体，并用农杆菌介导的叶盘转化法转化了烟草［12］，初
步证明了 MxNas1 基因在 Fe 代谢中的功能。
1 材料与方法
1. 1 材料
烟草无菌苗、大肠杆菌 DH5α、pBI121、农杆菌
EHA105 等由本实验室保存。苹果 MxNas1 基因为笔
者前期克隆［10，11］。
1. 2 试剂
Taq DNA 聚合酶、限制性内切酶为 TaKaRa 产品;
卡那霉素(Kan)为 Gibico 产品;羧苄青霉素(Carb)、头
孢霉素(Cef)、利福平(Rif)等试剂购自北京江晨生物
公司;DNA Marker 购自天根生化科技(北京)有限公
司。
1. 3 方法
1. 3. 1 引物设计 根据小金海棠 MxNas1 基因的
ORF 序列和 pBI121 载体上的酶切位点，利用 Primer
Premier 5. 0 软件在目的基因的上游和下游设计合适
的引物，由上海生工生物工程技术服务公司合成。同
时分别在其 5’和 3’端引入 XbaI 和 SacI 酶切位点。
正义表达载体:
上游引物 ExF5P
5’-AGGATCTAGAGTCGACATGTGTTGCCAGGGA-3’
下游引物 ExF3P
5’-GCCAGAGCTCAGGATGTTTTAAGAAAGCTGCTC-3’
反义表达载体:
上游引物 ExR5P
5’-AAAAGAGCTCGTCGACATGTGTTGCCAGG-3’
下游引物 ExR3P
5’-GGGGGTCTAGACAAGGATGTTTTAAGAAAGCTGC-3’
下划线区域分别为 XbaI 和 SacI 酶切位点，下划
线前为保护碱基。
1. 3. 2 目的基因的 PCR 扩增及纯化 用含有
MxNas1 基因全长的质粒为模板，用设计好的引物进行
PCR 扩增，反应体系如下:25μl 扩增体系中含 10 ×
PCR buffer 2. 5μl，10mmol /L dNTP mix 0. 5μl，正、反向
引物(10μmol /L)各 0. 5μl，模板 0. 5μl，Pfu (2U /μl)
0. 5μl，剩余体积用 ddH2O 补足。 PCR 扩增程序为
94℃ 1min;94℃ 20s，65℃ 40s，72℃ 2min，30 个循环;
72℃ 5min;4℃保温。扩增产物用 1. 4%琼脂糖凝胶电
泳，用天根公司琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化 DNA
片断。
1. 3. 3 载体及基因片段的酶切与连接 将用碱裂解
法提取的 pBI121 质粒载体以及 PCR 扩增、纯化后的
目的片段，同时用 XbaI 和 SacI 在 37℃下酶切 2h，电泳
检测后，再纯化回收目的片段进行连接。20μl 连接体
系中含目的片段回收产物 12μl，载体回收产物 3μl，T4
DNA 连接酶缓冲液 2μl，T4 DNA 连接酶(3U /μl)1μl，
ddH2O 2μl，于 16℃ 连接过夜。将连接产物转化 E.
coli DH5α 感受态细胞，挑单克隆摇菌、提质粒，依次进
行菌液 PCR 和质粒酶切鉴定(用 XbaI 和 SacI)。取构
建好的表达载体质粒用冻融法转化农杆菌 EHA105 感
受态细胞，挑取单菌落摇菌进行菌液 PCR 鉴定，阳性
克隆在 － 70℃保存备用。
1. 3. 4 农杆菌介导的叶盘法转化烟草 无菌的烟草
叶片切去边缘和主要叶脉，切成 0. 4cm × 0. 6cm 大小，
切好的外植体在农杆菌菌液中浸泡 10min，用无菌滤
纸吸干植物材料表面的菌液，转入上铺 1 层滤纸的 MS
基本培养基，28℃暗培养。3d 后将材料转到含有抗生
素的分化培养基(MS + 3mg /L 6-BA + 0. 2mg /L NAA +
200mg /L Kan + 250mg /L Cef)中进行筛选培养。待抗
性芽生长至 2 ～ 3cm 高时，切下小芽转入生根培养基
中诱导生根，生根培养基配方:MS 基本培养基 +
200mg /L Kan + 250mg /L Cef。
1. 3. 5 转基因烟草的 PCR 检测及耐缺铁试验 取转
基因植株幼嫩叶片用 CTAB 法提取 DNA 后，以 35S 启
动子内部序列及 MxNas1 基因内部相对非保守区域序
232
2 期 苹果 MxNas1 基因正反义表达载体构建及转化烟草的研究
列设计引物进行 PCR 鉴定，上游引物序列:5’-
CCAAGAAGGTTAAAGATG-3’;下 游 引 物 序 列:5’-
GCCGAAGCATTGATGTCA-3’。鉴定为阳性的转化植
株首先在半营养液［13］中水培适应 14d，然后转至全营
养液中水培 21d，21d 后对转化植株各自进行 0、1、40、
100μmol /L Fe-EDTA 处理并观察表型，处理 14d 后采
收其新叶与新根。
1. 3. 6 转基因烟草金属含量的测定 取处理后转基
因烟草的新叶与新根，用去离子水洗净并用吸水纸吸
干表面水分，105℃烘箱中杀青 20min 后，70℃烘至恒
重。取烘干的材料 100mg 放于坩埚中，马孚炉内
500℃灰化 10h 后取出坩埚，冷却至室温，加 1 ～ 2 滴浓
硝酸溶解灰分，去离子水定容至 10ml，用原子吸收法
测 Fe、Mn、Cu、Zn 的含量［14］。
图 1 MxNas1 PCR 产物双酶切
Fig. 1 PCR products of MxNas1 digested
by XbaI and SacI
2 结果与分析
2. 1 正义和反义表达载体的构建
为了研究 MxNas1 基因的功能，构建了正义和反
义两种植物表达载体，并采用花椰菜花叶病毒 35S 启
动子驱动 MxNas1 基因在烟草中组成型表达。首先利
用 PCR 扩增了 MxNas1 基因，并连接至 pGEM-T Easy
载体，为了方便与 pBI121 载体连接，在引物中引入了
XbaI 和 SacI 酶切位点，将 PCR 扩增产物和 pBI121 载
体分别用 XbaI 和 SacI 双酶切(图 1、图 2)，质粒
pBI121 切去 GUS 片段，酶切后的基因片段分别正向和
反向插入 35S 启动子和 NOS 终止子之间，分别得到正
义表达载体 pBI121-FMxNas1 (图 3)和反义表达载体
pBI121-RMxNas1(图 4)。转化农杆菌 EHA105 后，对
正义和反义表达载体质粒用 XbaI 和 SacI 双酶切鉴
定，琼脂糖凝胶电泳检测后都能得到 13kb 和 1kb 的 2
条带，用 PCR 扩增也能得到 1kb 的条带，证明表达载
体构建成功(图 5)。
图 2 pBI121 质粒双酶切
Fig. 2 Plasmid of pBI121 digested
by XbaI and SacI
图 3 正义表达载体 pBI121-FMxNas1 的构建
Fig. 3 Construction of the sense
vector pBI121-FMxNas1
图 4 反义表达载体 pBI121-RMxNas1 的构建
Fig. 4 Construction of the antisense
vector pBI121-RMxNas1
2. 2 农杆菌转化烟草
将构建的正义和反义两种表达载体，采用叶盘法
转化了烟草。以无菌苗叶片为转化外植体，经过 3d 共
培养后，转移至含有抗生素(Kan 200mg /L，Cef 250mg /
L)的分化培养基上筛选培养(图 6 － A)，约 14d 后可
以看到愈伤组织产生(图 6 － B)，继而分化出抗性芽
(图 6 － C)。待抗性芽长至 2cm 时，转到生根培养基
332
核 农 学 报 25 卷
上诱导生根，21d 后即可生出细嫩小根，逐渐成苗(图
6 － D)。
图 5 正反义表达载体的双酶切及 PCR 鉴定
Fig. 5 Identification of sense and antisense constructs
by restriction digestion and PCR
1:正义载体双酶切;2:反义载体双酶切;
3:正义载体 PCR;4:反义载体 PCR
1:plasmid of pBI121 － FMxNas1 digested by XbaI and SacI;
2:plasmid of pBI121 － RMxNas1 digested by XbaI and SacI;
3:PCR of pBI121 － FMxNas1;
4:PCR of pBI121 － RMxNas1
图 6 烟草抗性愈伤、抗性芽的筛选和转化苗再生
Fig. 6 Selection of tobacco resistant calli，
resistant shoots and regeneration
of tobacco plants
A、B:烟草抗性愈伤组织;C:烟草抗性芽;
D:转基因烟草植株
A，B:selection of resistant calli formation;
C:selection of resistant shoots;
D:regeneration of tobacco plants
2. 3 转基因烟草的 PCR 鉴定
提取转基因烟草植株叶片的基因组 DNA，采用以
35S 及 MxNas1 基因内部序列设计的引物进行 PCR 扩
增。结果表明，转基因烟草可以扩增出与质粒扩增产
图 7 部分转正义载体烟草的 PCR 鉴定
Fig. 7 PCR analysis of some tobacco plants
transformed with sense vector
1 ～ 9:转化植株;10:正对照;11:负对照
1 ～ 9:transformed plants;10:positive control;
11:untransformed control
图 8 部分转反义载体烟草的 PCR 鉴定
Fig. 8 PCR analysis of some
tobacco plants transformed
with antisense vector
1 ～ 5:转化植株;6:正对照;7:负对照
1 ～ 5:transformed plants;6:positive control;
7:untransformed control
图 9 转基因烟草 1μmol /L Fe-EDTA
处理 14d 后表型分析
Fig. 9 Phenotype of transgenic tobacco
plants treated by 1μmol /L
Fe-EDTA for 14 days
A:转正义载体植株;B:转反义载植株;C:未转化的对照
A:plant of transformed sense construct;
B:plant of transformed antisense construct;
C:nontransformed control plant (CK)
物大小一致的目的条带，而未转化烟草植株则没有相
应大小的产物(图 7、图 8)。
432
2 期 苹果 MxNas1 基因正反义表达载体构建及转化烟草的研究
2. 4 转基因烟草的耐缺 Fe 试验及形态学观察
图 10 不同浓度 Fe 处理转基因烟草 14d 后根和叶中金属离子含量
Fig. 10 Metal content in young leaves and roots of transgenic tobacco plants after treatment 14 days
A ～ D:0，1，40，100μmol / L Fe-EDTA 处理的根;E ～ F:0，1，40，100μmol / L Fe-EDTA 处理的叶
A ～ D:roots treated by 0，1，40，100μmol / L Fe-EDTA;E ～ F:leaves treated by 0，1，40，100μmol / L Fe-EDTA
经 PCR 鉴定后生根的转基因烟草，经过锻炼后转
入水培，首先在半营养液中适应性水培 14d，再转入全
营养液中培养 21d，然后用不同浓度 Fe(0、1、40、
100μmol /L Fe-EDTA)营养液进行处理，期间观察烟草
表型变化。当处理 14d 后，可以明显看到，转反义载体
和对照烟草植株在缺铁(1μmol /L Fe-EDTA)情况下出
现了叶脉和脉间黄化现象，转反义载体株系黄化现象
更为严重(图 9 － B)，而转正义载体的株系生长正常
(图 9 － A)，表现出了较强的抗缺 Fe 能力。在
0μmol /L Fe-EDTA 的营养液中也有同样的表型(图片
未展示)，说明 MxNas1 基因在 Fe 的代谢中起了重要
的作用。
2. 5 转基因烟草金属离子含量的测定
不同铁浓度处理 14d 后转基因烟草的幼叶和根，
经过灰化处理后用原子吸收法测其 Fe、Mn、Cu、Zn 的
含量。结果表明(图 10)，转正义载体烟草在不同浓度
Fe 处理情况下，叶中 Fe、Mn、Cu、Zn 含量比对照植株
提高了 1. 2 ～ 1. 5 倍，根中提高不明显;转反义载体烟
草叶中除了 Mn 含量有所降低外，Fe、Cu、Zn 含量与对
532
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2010，25(2):0231 ～ 0236
照相比无明显差异。
3 讨论
NA 在所有植物铁的代谢中都起到了十分重要的
作用。在机理 II 植物中，NA 是麦根酸(MA)合成的关
键前提，然而在机理Ⅰ植物中目前研究的还不是很深
入。苹果属于机理Ⅰ植物，为了进一步阐明 NAS 在机
理Ⅰ植物中的作用，本文构建了 MxNas1 基因的正义
和反义两种表达载体，并转化了烟草。结果表明转正
义载体的烟草表现了较强的抗缺 Fe 能力(图 9)。在
缺 Fe(0. 1μmol /L Fe-EDTA)情况下，转反义载体植株
出现了更为黄化的现象。原因可能是反义载体的导
入，在一定程度上干扰了烟草本身 NAS 基因的表达，
使植物体内的 NA 含量降低。无论正义还是反义株系
以及对照，在正常供铁(40μmol /L Fe-EDTA)和高浓度
Fe (100μmol /L Fe-EDTA)胁迫下，表型均没有很大的
差异，转反义烟草也没有出现黄化现象，原因可能是
Fe 的充足供应，即使 NA 的降低也不足以影响到 Fe 在
植物 体 内 的 代 谢，所 以 表 型 没 有 太 大 的 差 异。
Takahashi 等研究认为，NA 在 Fe 从叶脉到脉间的运输
中起重要作用［2］，这与本试验转化烟草的结果一致。
用 100μmol /L Fe-EDTA 处理的转基因株系，没有
出现高 Fe 中毒现象。原因可能是 NA 螯合了相对稳
定的 Fe(Ⅱ)，降低了 Fe 的毒害，为了阻止细胞受到伤
害以及高 pH 值的冲击，Fe 在韧皮部必须以一种螯合
物形式参与运输。另外 NA 也被认为参与了部分解毒
的功能，提高了植株对高离子浓度的忍受能力［1］。
通过对转基因烟草 Fe、Mn、Cu、Zn 等金属含量的
测定表明，转正义载体烟草提高了植株对 Fe、Mn、Cu、
Zn 的运输能力，这与前人的研究结果基本一致［15］。
在本试验中，对同一株系来说，随着铁处理浓度的提
高，其他金属离子的含量出现了下降的趋势，这大概与
离子之间的拮抗有关，Fe 吸收的增加导致了其他离子
吸收的降低。另外，在同一处理中，根中金属离子的含
量要远远大于叶中的含量，这可能与金属离子首先在
根部吸收然后运输到地上部有关。
以上的试验结果为 NA 在机理Ⅰ植物中的作用提
供了一个初步的证据，可以推测在非禾本科植物(机
理Ⅰ)中，NA 在与金属离子的螯合、Fe 向地上叶片等
器官的运输、解除细胞内过量 Fe 的毒害中起了重要作
用。但是，NA 与金属离子螯合的具体机制、通过哪种
途径向上运输以及如何解除细胞内过量铁的毒害等方
面还需要进一步的研究。
参考文献:
［1 ］ Von Wirén N，Klair S，Bansal S，Briat J F，Khodr H，Shioiri T，
Leigh R A，Hider R C. Nicotianamine chelates both Fe(Ⅲ)and Fe
Ⅱ)implications for metal transport in plants［J］. Plant Physiology，
1999，119:1107 － 1114
［2 ］ Takahashi M，TeradaY，Nakai I，Nakanishi H，Yoshimura E，Mori
S，Nishizawa N K. Role of nicotianamine in the intracellular delivery
of metals and plant reproductive development ［J］. Plant Cell，
2003，15 (6):1263 － 1280
［3 ］ Higuchi K，Nishizawa N K，Romheld V，Marschner H，Mori S.
Absence of nicotianamine synthase activity in the tomato mutant
‘Chloronerva’［J］. J Plant Nutrition，1996，19:1235 － 1239
［4 ］ Higuchi K，Suzuki K，Nakanishi H，Yamaguchi H，Nishizawa N K，
Mori S. Cloning of nicotianamine synthase genes， novel genes
involved in the biosynthesis of phytosiderophores ［J］. Plant
Physiology，1999，119(2):471 － 480
［5 ］ Herbik A，Koch G，Mock H P，Dushkov D，Czihal A，Thielmann
J，Stephan U W，Bumlein H. Isolation，characterization and cDNA
cloning of nicotianamine synthase from barley:a key enzyme for iron
homeostasis in plants［J］. Eur J Biochem，1999，265(1):231 －
239
［6 ］ Inoue H， Higuchi K， Takahashi M， Nakanishi H， Mori S，
Nishizawa N K. Three rice nicotianamine synthase genes，OsNAS1，
OsNAS2，and OsNAS3 are expressed in cells involved in long-
distance transport of iron and differentially regulated by iron ［J］.
Plant Journal，2003，36(3):366 － 381
［7 ］ Mizuno D， Higuchi K， Sakamoto T， Nakanishi H， Mori S，
Nishizawa N K. Three nicotianamine synthase genes isolated from
maize are differentially regulated by iron nutritional status［J］. Plant
Physiology，2003，132 (4):1989 － 1997
［8 ］ Suzuki K，Higuchi K，Nakanishi H，Nishizawa N K，Mori S.
Cloning of nicotianamine synthase genes from Arabidopsis thaliana
［J］. Soil Sci Plant Nutr，1999，45(4):993 － 1002
［9 ］ Ling H Q，Koch G，Baumlein H，Ganal M W. Map-based cloning
of‘Chloronerva’，a gene involved in iron uptake of higher plants
encoding nicotianamine synthase ［J］. Proc Natl Acad Sci USA，
1999，96 (12):7098 － 7103
［10］ 张玉刚，韩振海，许雪峰，李天忠 .小金海棠抑制性消减 cDNA 文
库的构建及文库的质量分析［J］. 中国农学通报，2005，21(3):
77 － 80
［11］ 张玉刚，许雪峰，李天忠，王 忆，孔 瑾，韩振海 .抑制性消减杂
交分离苹果缺铁诱导的相关基因［J］. 园艺学报，2007，34(3):
555 － 560
［12］ 张佳琦，朱金启，李 胜，魏兆军 . 埃及伊蚊 TMOF 同源基因表
达载体构建及烟草转化［J］.核农学报，2010，24(5):926 － 931
［13］ Zhang F S，Liu SH J，Mao D R，Han Z H. Genotypic differences in
iron-deficiency stress responses in Malus ［J］. Acta Horticulturae
Sinica，1995，22(1):1 － 6
［14］ Jean M L，Schikora A，Mari M，Briat J F，Curie C. A loss-of
function mutatinn in AtYSL1 reveal its role in iron and nicotianamine
seedloading［J］. Plant Journal，2005，44:769 － 782
［15］ Douchkov D，Gryczka C，Stephan U W，Hell R，Bumlein H.
Ectopic expression of nicotianamine synthase genes results in
improved iron accumulation and increased nickel tolerance in
transgenic tobacco ［J］. Plant Cell and Environment，2005，28:
365 － 374
(责任编辑 王媛媛)
632