全 文 ：苹果属小金海棠的遗传多样性初步研究
周志钦　成明昊　宋洪元　李晓林　杨天秀
(西南农业大学园艺系 , 　重庆　400716)
摘要:用 RAPD技术建立了苹果属小金海棠(Malus x iaojinensis)2 个自然分布区的 3 个群体内随机选取的30 株树
(10 株/每群体)及其相应的子代实生苗共 6个群体 、60 个样本植株的分子标记。通过对 15 个随机引物产生的 81
条 RAPD 带的统计 ,计算了不同群体 RAPD多态性带的数目。用 TREECON 软件分析了不同群体及所有个体间的
遗传关系 , 并用 AMOVA技术分析了物种的遗传变异。结果是 15 个引物在全部分析个体中产生了 58 条多态性
带 ,平均每引物 3.8 条。现有分布 3 个群体及其相应的子代实生苗群体的平均多态性带的数目都为 1.5 条左右。
其中平均多态性带的数目最低的群体仅有 0.7 条 ,最高的群体也只有 2.5 条。遗传关系分析表明 , 2个自然分布区
的不同群体间存在遗传分化现象。 AMOVA 分析显示小金海棠的遗传变异有相当一部分来源于群体间。
关键词:苹果属 , 小金海棠 , 遗传多样性
中图分类号:　　　文献标识码:A　　　文章编号:1005-0094(2001)02-0145-06
A preliminary study on the genetic diversity of Malus xiaojinensis
ZHOU Zhi-Qin , CHENG Ming-Hao , SONG Hong-Yuan , LI Xiao-Lin , YANG Tian-Xiu
Department of Horticulture , Southwest Agricultural University , Chongqing 400716
Abstract:Thirty trees of Malus xiaojinensis randomly sampled f rom three natural populations in tw o
distribution areas(about 50 kilometers apart), i.e.Dengcun of Mopo and Lianghe tow nships , Xiaojin
County , Sichuan Province , and thirty corresponding seedlings were analyzed using random amplified
polymo rphic DNA (RAPD)techniques.Based on stat istical analysis of the 81 RAPD bands produced
by 15 decamer primers in polymerase chain reactions(PCR)w ith all of the DNA samples studied , the
number of polymo rphic RAPD bands among all the individuals and different populations w ere counted.
The genetic relat ionship among all the individual t rees and betw een different populat ions w ere analyzed
using Nei and Li(1979)genetic distance and neighbo r-joining methods in the TREECON sof tw are
package.Genetic variance analy sis w as carried out using the AMOVA method in Arlequin Ver.2.000
sof tw are package.From 15 random decamers , 81 polymo rphic bands w ere produced in all the DNA
samples studied , average 3.8 bands per primer.The average polymorphic RAPD bands of both three
existing populations and their corresponding descendent seedling populations w ere about 1.5 per
primer.Among them , the highest average polymorphic RAPD bands per population is 2.5 and the
lowest is 0.7.The genetic relationship t rees const ructed by the TREECON computer program fo r all
the individuals and dif ferent populat ions show that there is genetic dif ferentiation among the popula-
tio ns of M .xiaoj inensis.The AMOVA analysis indicates that the seedling population variances com-
posed a large part of the species genetic variation of M .xiaojinensis.
Key words:Malus , genetic differentiation , RAPD
　　中国西南部是世界苹果属植物最大的多样性中
心(李育农 ,1989)。小金海棠(Malus xiaojinensis)
是第一个由中国人命名的苹果属植物新种(成明昊
等 ,1983),分布在沿岷江上游和大渡河中上游流域
之间 ,称为岷江—大渡河带 ,属横断山植物区系 。在
四川省小金县有面积达 1000亩以上 、分布密度较
基金项目:西南农业大学校基金资助项目(No.97001)。
收稿日期:2000-11-07;修改稿收到日期:2001-04-02
作者简介:周志钦 ,男 , 1964年出生 ,副教授。从事果树分子生物学与资源利用研究。 E-mail地址:bdpengq@cta.cq.cn
生物多样性　2001 , 9(2):145～ 150 　 　 　 　 　 　 　
Biodiversity Science
大 、自然林相较为完整的分布群落。在黑水 、汶川 、
理县 、马尔康 、阿坝 、石棉 、康定 、金川等地也有少量
分布 ,分布区的海拔高度在 2500 ～ 3350 m 之间(成
明昊等 ,1992;蒋舜媛 ,李朝銮 , 1997)。小金海棠不
仅具有耐盐 、耐旱 、耐热 、耐涝 、抗寒 、对白粉病和苹
果潜隐病毒有一定的抗性等众多抗逆境特性 , 而且
作砧木嫁接亲合性好 ,有矮化效应 ,具高度的无融合
生殖特性 ,综合生产性能优于 M7(成明昊等 , 2000;
周志钦 ,李育农 ,1995)。韩振海从 40多个苹果属植
物种类中鉴定出小金海棠为全球范围内的第一个抗
缺铁黄叶病苹果基因型①。因此 ,小金海棠是苹果
属植物中极珍贵的基因资源。本研究的目的是从分
子水平上分析小金海棠种群的遗传多样性 ,并比较
现有群体及其子代实生苗间遗传多样性的变化 ,为
小金海棠的开发利用和野生资源的保护提供科学依
据。
1　材料和方法
1.1　材料
1998年 10月在小金海棠集中分布的小金县两
河乡选择 2 个相邻群体 ,在相距约 50 km 的木坡乡
登村选择 1个群体 。从每个群体随机选取 10 个单
株 ,分别从每个单株采集枝条和果实 ,编号并带回室
内。将枝条嫁接在西南农业大学苹果野生资源圃 ,
得到小金海棠现有分布群体并命名为 Gdc、GlhI 、
GlhII , 分别代表登村群体和两河乡的 2个相邻群
体。对果实取种子 ,经层积后 ,在第 2年分单株播种
得到 Gdc、GlhI 、GlhII 群体的相应子代实生苗群体 ,
分别命名为群体 Sdc 、SlhI 、和 SlhII 。2000年春季从
每个群体取正在扩展的嫩叶用于 DNA 的提取。
1.2　DNA的提取和 RAPD分析
按照 Zhou等(2000)的方法提取 DNA (Van de
Peer et al.,1994)。DNA 样品经分光光度计和琼脂
糖凝胶电泳检查纯度和浓度后 ,稀释到约 50μg/mL
用于 RAPD分析。用随意选择的 2 个样品 DNA 模
板筛选 Operon 公司 的 10bp的随机引物(A B D K
P U 组)120个 。根据带的强弱和清晰度从中选择
了 20个引物用于全部 DNA 样品的 PCR扩增分析。
PCR扩增的产物用 1.5%的琼脂糖凝胶在 1×TAE
缓冲液电泳 , EB 染色后在 Bio-RAD System 观察并
保存结果 。
1.3　数据的统计和分析
按 RAPD带在琼脂糖凝胶上同一位置的有无
分别记为 1和 0 ,得到一个全部分析样品的二态数
据矩阵。根据 1 和 0在全部分析样品中的分布情
况 ,统计不同引物获得的带的总数 、多态性带的数
目 。在不同群体内或全部分析样品中 ,对任意带只
要有一个个体不同于其他个体则记为多态带。
遗传关系的分析使用 TREECON 计算机软件
中 Nei &Li(1979)遗传距离和邻位聚类方法生成
树(Van de Peer et al., 1994)。同一群体内不同个体
间 、不同群体间 、以及现有分布群体与其相应的子代
实生苗群体间遗传变异的分析采用 Schneider S et
al.(2000)Arlequin(Ver.2.000)软件中的AMOVA
(Analysis of Molecular Variance)分析法(http://
lgb.unige.ch/arlequin/)。
2　结果与分析
2.1　RAPD带的多态性
在用于全部样品的 RAPD 分析的 20 个引物
中 ,15个引物得到了全部分析样品的 PCR产物 ,共
产生强度和清晰度较好的带 81 条。图 1 为引物
OPK-16在全部 60个分析样品中产生的 RAPD带
型 。15 个引物在全部分析样品和不同群体中
RAPD多态性带的数目及所占百分率见表 1 。由表
1可知 ,在全部分析样品中 15个引物产生的平均带
数为 5.4 ,平均多态性带的数目为 3.8。现有分布 3
个群体 Gdc、GlhI和 GlhII 的平均多态性带的数目
及其相应的 Sdc、 SlhI 、SlhII 子代实生苗群体的平
均多态性数目都只有 1.5条左右 。而单个群体平均
多态性带数目最低的 GlhI 仅有 0.7条 ,最高的 Gl-
hII也只有 2.5条 。
2.2　小金海棠种的不同群体和同一群体不同个体
间的遗传关系
在 TREECON 分析软件中 , 根据 Nei & Li
(1979)遗传距离和邻位聚类法建立的小金海棠现有
分布群体 Gdc、GlhI 、GlhII ,其相应的子代实生苗群
体 Sdc、SlhI 、和 SlhII ,以及全部分析个体间的遗传
关系分别见图 2 、图 3和图 4。由图 2 ～ 4可见 ,无论
是在现有分布的群体中(图 2),还是在子代实生苗
群体中(图 3),甚至在全部个体的遗传关系图中(图
4),登村群体内除 Sdc5外(原因有待进研究)
①韩振海 , 1990.从苹果属中筛选吸收和利用铁能力强的种.北京
农业大学博士学位论文 , 134
146　 生 物 多 样 性　　Biodiversity Science 9 卷
图 1　引物 OPK16 在全部 60 个分析样品中所产生 RAPD带型
图中各群体的样品分别是 Gdc:1～ 10 , GlhI:11～ 20 , GlhI I:21～ 30 , Sdc:31 ～ 40 , SlhI:41～ 50 , SlhI I:51 ～ 60 , 第 29道是缺失
的泳道。
F ig.1　The RAPD profile of the 60 samples analy zed in the experiment produced by primer OPK16
Lanes 1 ～ 10 belong to group Gdc , lanes 11 ～ 20 to G lhI , lanes 21～ 30 to G lhII , lanes 31 ～ 40 to Sdc , 41 ～ 50 to SlhI , and 51 ～ 60
to SlhI I groups , respectively.No.29 is an absent lane.
表 1　用于 RAPD分析的 15 个引物在小金海棠不同群体中产生的带的总数和多态性带的数目
Table 1　The number of to tal bands and the number of polymorphic bands produced by each of the fifteen decamer primers used in
RAPD analy sis with the different populations of Malus x iaojinensis
引物
Primer
总带数
Total
bands
多态性带数 Number of polym orphic bands
全部个体
All individuals
群体Gdc
＊Pop.Gdc
群体 GlhI
Pop.GlhI
群体 GlhII
Pop.Glh II
群体 Sdc
Pop.Sdc
群体 SlhI
Pop.S lhI
群体 SlhII
Pop.S lhII
OPA15 4 3 0 0 2 2 2 2
OPA18 5 5 3 0 3 2 0 1
OPB12 5 4 2 2 2 4 1 3
OPD05 8 7 4 3 6 2 1 0
OPD08 6 4 2 0 2 0 2 1
OPD11 7 6 1 0 4 1 1 0
OPD20 8 3 0 0 2 0 0 2
OPK16 7 7 2 3 6 4 4 2
OPP02 4 2 0 0 1 1 0 2
OPP08 5 4 0 1 3 3 3 1
OPP09 5 5 0 1 4 1 0 3
OPP10 3 1 1 0 1 2 0 2
OPP15 3 2 1 1 0 1 0 2
OPP18 4 1 0 0 1 1 1 1
OPU01 7 4 4 0 1 3 2 0
平均带
Average
5.4 3.8 1.3 0.7 2.5 1.8 1.1 1.5
百分率
Percentage
70.6 24.7 13.4 46.9 33.3 20.9 27.2
Note:＊Pop.=population.
的各个体都明显地聚在一起 ,与两河乡的 2个群体
相分离 ,而两河乡相邻 2个群体的个体却相互聚在
一起 ,无明显界限。这一结果显示不同分布区的小
金海棠群体存在遗传差异 。
2.3　小金海棠的遗传变异分析
将小金海棠的现有 3个分布群体分为一组 ,其
相应的 3个子代实生苗群体分为另一组 ,使用全部
RAPD数据 ,用AMOVA 分析法分析了小金海棠世
代间的遗传变异 。同时也对两组进行了单独的
AMOVA分析 ,以便比较小金海棠现有分布群体
间 、其子代实生苗群体间以及各群体内个体间遗传
变异的大小 ,结果列于表 2。表 2中的数据表明 ,小
金海棠现有分布群体与其相应的子代实生苗群体间
的变异占全部分析样品总变异的约 24.22%, 说明两个
2 期 周志钦等:苹果属小金海棠的遗传多样性初步研究 147　
图 2　小金海棠现有分布群体个体间的遗传关系
图中 Gdc代表登村群体 , GlhI 、GlhII 分别代表两河乡的 2 个群体 , 数字代表每个群体的样本号 1 ～ 10。
F ig.2　The genetic relationships of the individual trees from the existing papulations o f Malus x iaojinensis
Gdc indicates the population from “ Dengchun” , GlhI and G lhII indicate the two populations from “ Lianghe” , numbers are the sam-
pling numbers in each population.
图 3　图 1 中 3 个群体 Gdc、GlhI 、GlhII相应实生苗后代个体间的遗传关系
图中 S 表示实生苗 ,其余字母和数字与图 1中含义相同。
F ig.3　The gentic relationships of the seedlings corresponding to the three populations Gdc、GlhI 、GlhII in Fig.1.
“ S” indicates seedlings and all other characters and numbers correspond to those in Fig.1.
世代间存在一定的遗传多样性差异 。进一步单独对
现有分布群体及其相应的子代实生苗群体的 AMO-
VA分析结果显示 ,子代实生苗群体间变异的百分
率是 25.12%,而现有分布的群体间变异的百分率
为 16.96%,这一结果表明小金海棠实生群体间的
变异仍然是物种变异的主要来源 。
148　 生 物 多 样 性　　Biodiversity Science 9 卷
　　　　　　图 4　全部分析样本植株间的遗传关系　　　　　　图中字母与数字的含义与图 1 、图 2 相同。
　　　　　　Fig.4　The gentic relationships of all the individual trees analysed in our experiments　　　　　　The characters and numbers in the figure cor respond to those in Fig.1 and Fig.2.
3　讨论
植物多样性研究是现代生物学研究的重大课题
(王仁卿等 ,2000)。目前在我国利用分子标记技术
评价果树资源遗传多样性的工作才刚起步(张开春
等 ,1999)。在苹果属植物中 ,张开春等(1997)研究
发现三倍体无融合生殖的湖北海棠的平邑甜茶
(Malus hupehensis)具有丰富的遗传多样性 ,并认为
RAPD技术是检测平邑甜茶遗传一致性的有效方
法 。小金海棠是苹果属植物中极为珍贵的野生资
源 ,有很高的利用价值(成明昊等 , 2000;周志钦 ,李
育农 ,1995)。本文利用 TREECON 计算机软件对
小金海棠两代 、6 个群体 、60 单株的 RAPD 标记分
析结果显示 ,小金海棠现有分布群体与其子代群体
间及同代不同群体间(相距 50 km)存在遗传差异。
而 进
一步的AMOVA分析则表明 ,小金海棠物种变异有
2 期 周志钦等:苹果属小金海棠的遗传多样性初步研究 149　
表 2　小金海棠世代间 、不同群体间及群体内个体间遗传变异的 AMOVA分析
Table 2　The AMOVA analysis of the genetic variances between different g enerations(groups), among different populations in one
generation and different individuals w ithin populations of Malus x iaojinensis
变异来源
S ou rce of
variation
自由度
Degree of
f reedom
方差的总和
Sum of
squared deviations
变异的组份
Variance
com ponents
占总变异的百分率
Percentage
of variation
P值
P-value
组间
Among groups
1 94.117 2.40833 24.22 <0.001
组内群体间
Among populations
w ithin groups
4 87.467 1.59241 16.01 <0.001
群内个体间
Within populat ions
54 320.900 5.94259 59.76 <0.001
嫁接群体间
Among graf ted
populations
2 37.200 1.24852 16.96 <0.001
嫁接群体内
Within grafted
populations
27 165.100 6.11481 83.04 <0.001
实生群体间
Among seedling
populations
2 50.267 1.93630 25.12 <0.001
实生群体内
Within seedling
populations
27 155.800 5.77037 74.88 <0.001
相当一部分来源于实生群体间 ,这一结果是完全合
理的 。因为高度的无融合生殖应当使群体内个体间
的变异对整个物种变异的贡献减小 ,而不同实生群
体对不同生态环境的适应并产生变异 ,应该是小金
海棠物种生存和发展的动力之一。
本文的研究结果为小金海棠种群的基本遗传结
构 ,群体的遗传变异及其遗传变异的来源等方面提
供了分子方面的直接证据 ,为苹果属植物物种多样
性的保护和珍贵基因资源的利用提供了新证据。至
于本文图 4中出现的亲本群体的个体不与相应的子
代群体的个体先相聚的现象 ,还有待今后进一步研
究解释。
致谢　本实验在西南农业大学农业部蚕桑学重点开
放实验室完成 ,研究工作得到实验室鲁成教授的指
导和程道军老师多方面的帮助 ,特致谢忱。
参考文献
成明昊 , 江宁拱 , 曾维光 , 1983.苹果属一新种.西南农学
院学报 ,(4):53 ～ 55
成明昊 , 金强 , 刘扬青 , 1992.阿坝州苹果属植物野生资源
的调查研究.四川果品 , (4):50～ 57
成明昊 , 李晓林 ,张云贵 , 2000.苹果优良砧木———小金海棠
研究进展 , 西南农业大学学报 , 22(5):383 ～ 386
蒋舜媛 , 李朝銮 , 1997.川西山区苹果属植物野生种表型相
似性和地理亲缘.应用与环境生物学报 , 3(3):218 ～
225
李育农 , 1989.世界苹果和苹果属植物基因中心的研究初
报.园艺学报 , 16(2):101～ 107
王仁卿 ,宋凯 , 郭伟华 , 程伟 , 张明才 , 2000.植物多样性:面
临的严重威胁及其保护———第 16 届国际植物学大会评
述.植物学通报 , 17(2):155～ 159
张开春 ,吴禄平 , 李荣旗 , 毕晓颖 , 景士西 , 尹淑萍 , 1997.
RAPD 技术———检测平邑甜茶遗传一致性的有效方法.
农业生物技术学报 , 5(2):201 ～ 202
张开春 ,尹淑萍 , 杨英军 , 林珂 , 侯义龙 , 过国南 , 1999.分子
标记在果树上的应用.果树科学 , 16(3):210 ～ 218
周志钦 , 李育农 , 1995.苹果属植物无融合生殖研究进展
———文献综述.园艺学报 , 22(4):341 ～ 347
Van de Peer and De Wachter R , 1994.TREECON for Win-
dow s:a software package fo r the construction and drawing
of evolutionary trees for the Micro soft Windows environ-
ment.Computer Application Bioscience , 10:569 ～ 570
Zhou Z Q and Li Y N , 2000.The RAPD evidence for the phy-
logenetic relationship of the closely related species of culti-
vated apple.Genetic Resources and Crop Evolution , 47
(4):353～ 357
(责任编辑:时意专)
150　 生 物 多 样 性　　Biodiversity Science 9 卷